一种多功能篮状菌株GYDW-YM101及其应用转让专利
申请号 : CN202111532109.6
文献号 : CN115369043B
文献日 : 2023-06-16
发明人 : 陶刚 , 孟玉 , 王涛
申请人 : 贵州民族大学
摘要 :
本发明公开了一种篮状菌属菌株及应用。本发明的发明人发现了篮状菌属菌株GYDW‑YM101，并发现该菌株具有很强的溶磷、促生及拮抗植物病原菌的功能。该菌株在无机磷和有机磷选择培养基上生长7d后，SPI值都达到1.04和1.23。该菌种特别适用于于抑制经济作物的病原菌油茶炭疽菌(Colltotrichum camelliae)、灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)、大豆核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，对这些有害病菌具有很好的抑制作用，可以制备生防菌剂用于农业生产中；该菌株还能用于制备土壤改良剂和微生物菌肥，在保持活性的情况下，对植物植株的促生长和生态土壤改造起到显著有益的作用。
权利要求 :
1.一种篮状菌属菌株，其特征在于：其微生物学分类命名为篮状菌属菌株GYDW‑YM101，拉丁文学名Talaromyces sp.GYDW‑YM101，保藏编号为CCTCC M 20211572。
2.一种利用如权利要求1所述的篮状菌属菌株在土壤溶磷中的应用。
3.一种利用如权利要求1所述的篮状菌属菌株在制备微生物肥料中的应用。
4.一种利用如权利要求1所述的篮状菌属菌株在制备生防菌剂中的应用，其特征在于：所述的生防菌剂针对原菌油茶炭疽菌、灰葡萄孢霉、大豆核盘菌及尖孢镰刀菌。
说明书 :
一种多功能篮状菌株GYDW‑YM101及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种多功能篮状菌属菌株及应用。
背景技术
[0002] 篮状菌属Talaromyces C.R.Benj.隶属于真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota，散囊菌纲Eurotiomycetes，散囊菌目Eurotiales，发菌科Trichocomaceae。篮状菌是一类适应性强的腐生真菌，广泛分布于自然界的土壤、空气、水体及植物叶际和根际。篮状菌是自然界的重要分解者，有些种能产生高活性的木质纤维素酶类，有些种则产生大量颜色鲜艳的黄色或红色色素，还有些种对植物矿物质吸收、抗病、抗逆和生长起促进作用。如嗜松篮状菌T.pinophilus，可分泌高效的纤维素酶水解植物木质纤维素，从而增加土壤腐殖质，而且嗜松篮状菌还能够分泌有机酸溶解钾长石促进植物生长；黄色篮状菌(T.flavus)和产紫篮状菌(T. purpureogenus)分泌的有机酸可以溶解磷酸钙并矿化磷酸酯，使其变为植物可吸收的磷酸盐形式；黄色篮状菌分泌磷酸酯酶可以矿化有机磷，如卵磷脂和植酸，为植物生长补充磷元素。还有些种类，如沃特曼篮状菌(T.wortmanni)在土壤中分泌挥发性有机物(Volatile organic compounds，VOCs)，促进籽苗生长并促使某些植物如油菜产生抗病性。但是，篮状菌的某些种是人类和动物的机会病原菌，有些种则是食品工业的常见污染菌。
[0003] 磷是农业生产中的一个重要限制因素，磷肥作为常用肥料在农业中的大批量使用，也让难溶性磷不断地在土壤中累积。在土壤生态环境中，大部分磷元素通过与金属阳离子结合，以不溶解无机磷或有机磷的形式存在，植物难以直接吸收利用。近年来，我国的功能性溶磷微生物研究还比较少，尤其是在溶磷真菌类群的广泛分离筛选和多样性资源方面，不同类群和不同种属之间的溶磷微生物在溶磷作用上也差异明显，使得溶磷微生物肥料的产业化发展受到制约。
[0004] 上述篮状菌属真菌及其它常见真菌类群如木霉菌(Trichoderma Pers.)能够通过代谢产物作用改善土壤根际微环境等途径来促进植物生长和产生抗病、抗逆等功能，从而在农业生产和生态改造应用等实践中，能够有效减少化肥和农药的施用。
[0005] 尽管真菌促生与拮抗功能的研究和相关真菌资源很多，但大多是单一促生或拮抗作用，并且只是针对某一种植物病原菌的拮抗，具有溶磷、拮抗等多功能菌株资源还较少，无法满足绿色农业和生态应用实践的实际需求。
发明内容
[0006] 本发明的目的是：提供一种篮状菌属菌株。
[0007] 并发现该菌株在土壤溶磷中的应用。
[0008] 同时发现该菌株在制备微生物肥料中的应用。
[0009] 还发现该菌株在制备生防菌剂中的应用。
[0010] 本发明是这样实现的：篮状菌属菌株，其微生物学分类命名为篮状菌属菌株GYDW‑YM101，拉丁文学名Talaromyces sp.GYDW‑YM101，保藏编号为 CCTCC No：M 20211572。
[0011] 所述的篮状菌属菌株在土壤溶磷中的应用。
[0012] 所述的篮状菌属菌株在制备微生物肥料中的应用。
[0013] 所述的篮状菌属菌株在制备生防菌剂中的应用，所述的生防菌剂针对原菌油茶炭疽菌、灰葡萄孢霉、大豆核盘菌及尖孢镰刀菌。
[0014] 本发明的篮状菌属菌株GYDW‑YM101(Talaromyces sp.GYDW‑YM101)经鉴定为蓝状菌属真菌，已于2021年12月8日保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 20211572，地址是湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。
[0015] 本发明的发明人发现了篮状菌属菌株GYDW‑YM101，并发现该菌株具有很强的溶磷、促生及拮抗植物病原菌的功能。该菌株在无机磷和有机磷选择培养基上生长7d后，SPI值都达到1.04和1.23。该菌种特别适用于于抑制经济作物的病原菌油茶炭疽菌(Colltotrichum camelliae)、灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)、大豆核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，对这些有害病菌具有很好的抑制作用，可以制备生防菌剂用于农业生产中；该菌株还能用于制备土壤改良剂和微生物菌肥，在保持活性的情况下，对植物植株的促生长和生态土壤改造起到显著有益的作用。本发明的菌株是一株多功能菌株，能够在将来的实践应用中体现多功能用途，同时该菌株是不同于已经发表的一种不常见种类。
附图说明
[0016] 图1为GYDW‑YM101的溶磷圈(A‑B无机磷培养基正面和反面，C‑D是有机磷培养基正面和反面)；
[0017] 图2为GYDW‑YM101对黄瓜苗促生作用；
[0018] 图3为GYDW‑YM101对峙培养对植物病原菌的抑制作用；
[0019] 图4为菌株发酵液作用4种植物病原菌的拮抗作用(上为GYDW‑YM101 发酵液作用病原菌，下为4种植物病原菌对照)；
[0020] 图5为GYDW‑YM101系统发育树。
具体实施方式
[0021] 实施例1：篮状菌属菌株GYDW‑YM101
[0022] 1.1供试材料
[0023] 1.1.1植物根际土壤样品来源：使用“五点采样法”收集植物根际土壤。在植物靠近根处设点，铲去表层1‑2cm的土壤后，取植物根系周围的土壤约200克，混合装入样品袋中，做好采样地点的经纬度、日期、植物名称等信息记录，并对植物进行拍照。土样带回实验室4℃保存备用。
[0024]植物名称 采集地点 经纬度 采样时间
玉米 贵州省贵阳市党武镇 E:106°65′N:26°49′ 2020.01.08
玉米 贵州省贵阳市党武镇 E:106°65′N:26°49′ 2020.01.08
[0025] 1.1.2培养基
[0026] (1)无机磷培养基(g/L)：葡萄糖10g、(NH4)2SO4 0.5g、NaCl 0.3g、KCl 0.3 g、MgSO4 0.3g、MnSO4 0.03g、FeSO4·7H2O 0.03g、酵母膏0.5g、Ca3(PO4)2 3g、琼脂16g、蒸馏水1000mL，pH值6.8‑7.0。121℃灭菌30min备用。
[0027] (2)有机磷培养基(g/L)：葡萄糖10g、(NH4)2SO4 0.5g、NaCl 0.3g、KCl 0.3 g、MgSO4 0.3g、MnSO4 0.03g、FeSO4·7H2O 0.03g、酵母膏0.4g、卵磷脂0.2g、 CaCO35 g、琼脂16g、蒸馏水l000 mL，pH值7.0‑7.2。121℃灭菌30min备用。
[0028] 1.2溶磷真菌的分离筛选
[0029] (1)称取10g土样于90mL灭菌水中，于28℃摇床中振荡培养30min，转速为150r/‑3 ‑4 ‑5min；(2)采用梯度稀释法，土壤悬液浓度依次稀释成10 、10 和10 ，再依次取100μL分别涂布于无机磷培养基平板和有机磷培养基平板，每种浓度3 次重复，28℃恒温暗箱倒置培养；
[0030] (2)培养5～7d后，挑取具有溶磷圈的单菌落于无机磷固体平板和有机磷固体平板上进行纯化验证，每个单菌落2次重复，28℃恒温倒置培养；
[0031] (3)纯化后对同种作物中形态相似的菌株进行合并保存。
[0032] 1.3平板解磷能力测定
[0033] 通过平板测定法，将纯化后的解磷真菌接种于无机磷和有机磷培养基平板上，28℃恒温倒置培养，在第5‑7d时采用十字交叉法测定菌落的直径(d)和溶磷圈的直径(D)，并计算溶磷指数(SPI)，SPI＝(菌落直径+溶磷圈直径)/菌落直径。
[0034] 1.4真菌菌株促生试验
[0035] 1.4.1黄瓜试管苗促生评价实验
[0036] 将实验菌株接种到PDA培养平板活化，28℃培养5d后，菌株菌丝和孢子铺满培养平板备用。
[0037] 选用籽粒饱满的中农6号黄瓜种子，首先用10％次氯酸钠消毒5分钟，然后用无菌水冲洗5次；将冲洗好的种子蘸1％CMC(羧甲基纤维素钠)，然后分别蘸取菌株孢子；将蘸有孢子的种子按10粒/皿放在铺有纱布的培养皿(纱布和培养皿灭菌处理)，滴加灭菌水保湿，培养箱28℃培养4d，长出子叶和根，然后光照培养24小时，备用。
[0038] 采用150*15mm试管，灭菌，1/8MS培养基灭菌，将试管放于试管架上，加入半量1/8MS培养基。将上述黄瓜幼苗移种于试管中，1株/管，每株5个重复，放在温室中培养，温度
25‑28℃，组织培养灯白天晚上交替光照黑暗培养，15‑20d 后收获测定其鲜重和干重。
25‑28℃，组织培养灯白天晚上交替光照黑暗培养，15‑20d 后收获测定其鲜重和干重。
[0039] 1.4.2实验数据分析
[0040] 用Excel软件整理数据，选择LSD法检验不同处理间的差异显著性(p<0.05)， DPS软件来进行方差分析。通过公式来计算实验菌株对黄瓜试管苗的株高的促生率，鲜重、干重亦同：
[0041] 实验菌株促生率(％)＝(处理试管苗重量‑对照试管苗重量)/(对照试管苗重量)×100％
[0042] 1.5菌株拮抗试验
[0043] 1.5.1供试病原菌
[0044] 作物病原菌油茶炭疽菌(Colltotrichum camelliae)、灰葡萄孢霉 (Botrytis cinerea)、大豆核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，由中国农业科学院植物保护研究所李世东实验室提供。
[0045] 1.5.2平板对峙法试验方法
[0046] 将待测的实验菌株接种到PDA培养平板活化，28℃培养5d后，用打孔器分别取病原菌与待测菌饼，将两菌接种于同一PDA平板上，相距4cm，每组3 个重复，以单接病原菌为对照，置于28℃培养，7d后测量病原菌朝向实验菌株的菌落半径，并计算抑制率。
[0047] 抑制率(％)＝(对照病原菌菌落半径‑处理病原菌菌落半径)/(对照病原菌菌落半径)×100％
[0048] 1 5.3发酵液拮抗试验方法
[0049] 实验菌株接种到PDA培养基上培养7天左右，从长满菌落的培养平板中取8 个直径为5mm的菌饼接种PDB液体培养基中，28℃、200r/min摇床振荡培养培养4天，通过灭菌滤纸过滤来除去菌株的孢子和菌丝体，常温条件下7830r/min 离心10min，用0.22μm的滤膜过滤上清液，制成无菌滤液。在冷却到50℃左右，向90mLPDA培养基中加入10mL实验菌株的无菌滤液，混匀后倒平板。接种植物病原菌到平板的正中央，28℃恒温暗箱培养7天。用十字交叉法测量病原菌的菌落半径来计算其抑菌效果。用Excel 2010软件整理数据，选择LSD法检验不同处理间的差异显著性(p<0.05)，DPS软件来进行方差分析。通过1.5.2的公式计算对植物病原菌的抑制率。
[0050] 1.6菌株分子系统学鉴定
[0051] (1)待活化实验菌株生长至铺满培养平板后，用灭菌手术刀刮取菌丝并收集，采用2％CTAB法提取基因组DNA；
[0052] (2)使用真菌ITS通用引物，ITS1(5’‑TCCGTAGGT GAACCTGCGG‑3’) 和ITS4(5’‑TCCTCCGCTTATTGATATGC‑3’)进行PCR扩增。PCR反应体系(25 μL)：2×Es Taq Master Mix(北京天根生物技术有限公司)12.5μL、DNA模板1 μL、通用引物ITS1和ITS4各1μL、dd H2O 9.5μL，对照加入dd H2O代替DNA模板。PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10min，8℃∞。扩增产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测后,送上海生工公司测序；
[0053] (3)将测序结果与NCBI的GenBank中的ITS序列进行比对，选取序列相似性较高的作为参考序列，再用BioEdit软件(version 7.0.9)进行序列比对并手动校正，将处理好的数据通过MEGA6.0软件和测序序列进行多位点序列比对，手动剪切校正序列，选择邻接法(Neighbor‑Joining Tree)构建分子系统发育树，鉴定木霉菌株的分类地位。构建系统发育树。
[0054] 2.结果
[0055] 2.1 GYDW‑YM101菌株具有很强的溶解无机磷和有机磷的能力，SPI值达到1.04 和1.23(图1)。
[0056] 2.2 GYDW‑YM101菌株的促生作用
[0057] 表1 GYDW‑YM101对黄瓜苗生长的影响
[0058]
[0059] 注：同列数字后不同小写字母表示显著差异(P≤0.05)
[0060] 表2 GYDW‑YM101对黄瓜苗的促生率
[0061]
[0062] 2.3 GYDW‑YM101对4种植物病原菌的拮抗作用
[0063] 表3对峙培养对植物病原菌的抑制作用
[0064]
[0065] 表4菌株发酵液作用病原菌的直径(mm)及抑制率(％)
[0066]病原菌 油茶炭疽菌 葡萄灰霉 大豆核盘菌 尖孢镰刀菌
菌落直径(mm) 41±0.58 32.67±1.33 44.67±2.03 51.33±1.2
CK 45.67±2.33 71±0.58 35±1.73 59.33±2.33
抑制率(％) 42.25％±0.008 6.67％±0.038 24.72％±0.034 20.62％±0.018 [0067] 2.4 GYDW‑YM101菌株分子生物学鉴定
菌落直径(mm) 41±0.58 32.67±1.33 44.67±2.03 51.33±1.2
CK 45.67±2.33 71±0.58 35±1.73 59.33±2.33
抑制率(％) 42.25％±0.008 6.67％±0.038 24.72％±0.034 20.62％±0.018 [0067] 2.4 GYDW‑YM101菌株分子生物学鉴定
[0068] 2.4.1 ITS rDNA测序序列
[0069] >GYDW‑YM101[ITS序列]
[0070] CGCGGCCCAACCTCCCACCCTTGTCTCTATACACCTGTTGCTTTGGCGGGCCCACCG GGGCCACCTGGTCGCCGGGGGACGCACGTCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGCGCTC TGTGAACCCTGATGAAGATGGGCTGTCTGAGTACTATGAAAATTGTCAAAACTTTCAA CAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAAT GTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGC ATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGT TGGGTGTGGTCCCCCCGGGGACCTGCCCGAAAGGCAGCGGCGACGTCCGTCTGGTCC TCGAGCGTATGGGGCTCTGTCACTCGCTCGGGAAGGACCTGCGGGGGTTGGTCACCA CCATGTTTTTACCACGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAGTTACCCGCTGAACTTAAGC ATATCA
[0071] 2.4.2分子系统发育学鉴定
[0072] 菌株GYDW‑YM101与篮状菌属Talaromyces种类(T.tumuli，T.adpressus)聚为一个分支，为其相近种类(图5)，初步鉴定GYDW‑YM101为篮状菌属真菌种类。
[0073] 从上述实验得知，该菌株在无机磷和有机磷选择培养基上生长7d后，SPI值都达到1.04和1.23；黄瓜试管苗评价试验结果表明，对黄瓜苗鲜重和干重的促生效果分别增长
18.3％和13.5％；平板拮抗试验结果表明，对油茶炭疽菌、灰葡萄孢霉、大豆核盘菌和尖孢镰刀菌抑菌率分别达到54.17％、34.15％、48.81％和59.85％；菌株发酵液拮抗实验结果表明，对上述4种病原菌抑制率分别为42.25％、6.67％、 24.72％和20.62％。
18.3％和13.5％；平板拮抗试验结果表明，对油茶炭疽菌、灰葡萄孢霉、大豆核盘菌和尖孢镰刀菌抑菌率分别达到54.17％、34.15％、48.81％和59.85％；菌株发酵液拮抗实验结果表明，对上述4种病原菌抑制率分别为42.25％、6.67％、 24.72％和20.62％。
[0074] 证明本发明的篮状菌属菌株具有很强的溶磷、促生及拮抗植物病原菌的功能，可用于土壤溶磷及改良剂以及用于制备微生物肥料和生防菌剂。