一种基于复合凝聚法制备益生菌微胶囊的方法与应用

摘要

本发明提供了一种基于复合凝聚法制备益生菌微胶囊的方法，属于医药生物工程技术领域，本发明通过以改性大豆蛋白和植物或微生物来源的多糖为壁材，以益生菌为芯材，并使用非酶方式的双重固化剂对壁材进行固化处理制备益生菌微胶囊。该制备方法使得本发明制得的益生菌微胶囊具有益生菌活力损失小，活力维持时间长，可有效将益生菌递送到肠道发挥益生作用等优点。

权利要求

1.一种基于复合凝聚法制备益生菌微胶囊的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将大豆蛋白溶液进行超声改性，得到改性大豆蛋白溶液；

(2)将所述改性大豆蛋白溶液与益生菌混合得到蛋白‑益生菌混合溶液，每100mL的改

8 10

性大豆蛋白溶液与10‑10 cfu的益生菌混合；

(3)将多糖溶解于水中，得到浓度为3.0‑6.0％的多糖溶液；

(4)将步骤(2)制得的蛋白‑益生菌混合溶液与多糖溶液混合后，保持体系温度在40‑50℃，调整体系pH至4.4‑4.8，得到蛋白‑益生菌‑多糖混合溶液；

(5)将步骤(4)制得的蛋白‑益生菌‑多糖混合溶液的温度降低到8‑12℃，调节体系的pH至5.5‑6.5，加入固化剂，静置、去除上清，得到湿微胶囊；

(6)将湿微胶囊冷冻干燥，得到益生菌粉末；

步骤(1)中所述超声改性为将大豆蛋白溶解后置于密闭容器中进行超声处理；

所述超声处理的温度为45‑55℃，所述超声处理的超声功率为800‑1200W，所述超声处理的时间为10‑30min；

步骤(1)中所述大豆蛋白溶液的浓度为3.0％‑6.0％；

步骤(5)中所述的固化剂为京尼平和单宁酸，所述京尼平和单宁酸的添加无时间顺序限定，所述京尼平的添加量为大豆蛋白质量的5.0％‑15.0％，所述单宁酸的添加量为大豆蛋白质量的5.0％‑15.0％；

步骤(5)中加入所述固化剂后，进行搅拌，所述搅拌的转速为600‑800rpm，所述搅拌时间为55‑65min。

2.根据权利要求1所述基于复合凝聚法制备益生菌微胶囊的方法，其特征在于，所述益生菌包括植物乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和短乳杆菌中的一种或多种；所述多糖为植物或微生物来源的多糖；所述植物或微生物来源的多糖包括阿拉伯胶、卡拉胶和瓜尔豆胶中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述基于复合凝聚法制备益生菌微胶囊的方法，其特征在于，所述步骤(4)中调整体系pH的试剂为酸性溶液，步骤(5)中调节体系pH的试剂为碱性溶液；所述酸性溶液包括盐酸、醋酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸和酒石酸中的一种或多种，所述碱性溶液包括氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠和碳酸氢二钠中的一种或多种。

4.权利要求1至3任一项所述基于复合凝聚法制备益生菌微胶囊的方法制得的益生菌微胶囊。

5.权利要求4所述的益生菌微胶囊在制备耐胃酸口服益生菌制剂中的应用。

说明书

一种基于复合凝聚法制备益生菌微胶囊的方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药生物工程技术领域，尤其涉及一种基于复合凝聚法制备益生菌微胶囊的方法与应用。

背景技术

[0002] 微胶囊是由壁材和芯材两部分结构所构成的，微胶囊技术通过将微生物或其它不稳定成分作为芯材包埋到壁材之中，从而保护它们免受外界环境因素的损害，特别是对以微生物为芯材制成的微胶囊，还可以实现对微生物的固定。

[0003] 目前，对于微生物的微胶囊化技术多以挤压法、乳化法和喷雾干燥法为主。然而，这三种方法均存在着诸多的短板，如挤压法是最为常用的微生物微胶囊化方法，其操作简单，成本低廉，然而所得微胶囊的尺寸较大，多为毫米级别，通常不小于200μm，因此其应用范围受到很大限制；乳化法由于涉及乳化中剧烈搅拌的过程，会对微生物菌体造成伤害，同时，由于油脂成分的引入，会导致氧化稳定性不佳等问题；喷雾干燥法由于在干燥的过程中存在失水造成的渗透胁迫，再加上热空气对细胞的热损伤，会对微生物菌体造成严重伤害。而复合凝聚法具有操作条件温和，粒径尺寸较小，不引入不稳定成分等优点，因此成为微胶囊化益生菌的良好选择。

[0004] 但是，由于复合凝聚是一个物理变化，当体系pH发生变化时，复合凝聚所形成的壁材层就会解散，所以复合凝聚法制备的微胶囊都需要经过固化的环节。对于以微生物以外的成分作为芯材的微胶囊而言，一般都是采取酶促交联的方法进行固化。但是酶促交联后需要进行灭酶，一般需要在90℃以上的条件下进行，然而高温条件会将微生物灭活。且如果不经过固化的步骤，微胶囊的壁材层就不够稳定，也会极大地影响微胶囊对益生菌的保护作用。因此，复合凝聚法在益生菌微胶囊的制备中应用较少。

[0005] 此外，微胶囊的壁材通常是蛋白质和多糖的组合，而由于制备工艺对溶解性、乳化性等功能特性的需求，通常采用明胶蛋白或酪蛋白等动物蛋白作为壁材，植物蛋白的使用受到了限制。但是动物蛋白的使用会使产品的添加和使用范围受到局限。

[0006] 方亚鹏等在2018年申请的专利申请号为CN201811612214.9的“一种基于全水相复合凝聚的益生菌微胶囊及其制备方法”虽然也涉及了与本发明相似的复合凝聚法制备益生菌微胶囊，但是其原料中包含明胶蛋白等动物源性成分。此外，由于方亚鹏等的发明没有使用固化剂，该发明所制得益生菌微胶囊的稳定性和对益生菌的保护能力均相对欠佳，特别是缺乏耐胃酸的能力，不适宜应用于将益生菌送入人体肠道发挥益生作用。

[0007] 李爱科等在2020年申请的专利申请号为CN202011208280.7的“一种多层包被益生菌微胶囊的制备方法”由于多层包被体系的使用，也具有良好的对益生菌的保护能力，但是其原料也包含有脱脂奶粉等动物源性成分，此外，由于多层包被体系的构建需要，该发明的工艺步骤繁多。

[0008] 谢湖均等在2022年申请的专利申请号为CN202210471554.4的“植物乳杆菌凝胶珠及其制备方法”也涉及到采用大分子对益生菌进行包埋和固定化，但是，由于使用的是水凝胶珠的产品形式，其产品的粒径大小超过1mm，大大限制了其在药品、保健品及诸多工业领域的应用。且吴剑等在2018年申请的专利申请号为CN201811645176.7的“一种硒化海藻酸钠与硒化壳聚糖包裹的益生菌双层微胶囊、制备方法及其应用”中同样是使用挤压法制备的水凝胶珠的产品形式，所得微胶囊产品大小也在毫米级。

发明内容

[0009] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新型的基于复合凝聚法制备益生菌微胶囊的方法，该方法是以大豆蛋白和多糖为壁材，以益生菌为芯材，通过使用非酶方式的双重固化剂对壁材进行固化处理制备益生菌微胶囊；该方法制备的产品成本低廉、包埋效率高且益生菌稳定性良好，壁材层能够保护益生菌耐受住胃液环境的消化，从而使益生菌在肠道环境中快速释放从而有效发挥益生作用。

[0010] 为实现上述目的，本发明通过下述技术方案来实现：

[0011] 一种基于复合凝聚法制备益生菌微胶囊的方法，包括以下步骤：

[0012] (1)将大豆蛋白溶液进行超声改性，得到改性大豆蛋白溶液；

[0013] (2)将所述改性大豆蛋白溶液与益生菌混合得到蛋白‑益生菌混合溶液，每100mL8 10
的改性大豆蛋白溶液与10‑10 cfu的益生菌混合；

[0014] (3)将多糖溶解于水中，得到浓度为3.0‑6.0％的多糖溶液；

[0015] (4)将步骤(2)制得的蛋白‑益生菌混合溶液与多糖溶液混合后，保持体系温度在40‑50℃，调整体系pH至4.4‑4.8，得到蛋白‑益生菌‑多糖混合溶液；

[0016] (5)将步骤(4)制得的蛋白‑益生菌‑多糖混合溶液的温度降低到8‑12℃，调节体系的pH至5.5‑6.5，加入固化剂、静置、去除上清，得到湿微胶囊；

[0017] (6)将湿微胶囊冷冻干燥，得到益生菌粉末。

[0018] 所述益生菌包括植物乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和短乳杆菌中的一种或多种；

[0019] 所述多糖为植物或微生物来源的多糖；所述植物或微生物来源的多糖包括阿拉伯胶、卡拉胶和瓜尔豆胶中的一种或多种。

[0020] 所述益生菌是通过将益生菌培养物在4℃下离心，去除上清，或使用生理盐水溶液洗涤2次后离心，去除上清液，获得的益生菌菌泥或菌悬液。

[0021] 所述步骤(1)中的超声改性为将大豆蛋白溶解后置于密闭容器中进行超声处理；具体为，将大豆蛋白在45‑55℃下加水溶解，并加盖密封，放置于45‑55℃的恒温水浴中，使得大豆蛋白溶液与水浴温度相同，再将容器转移到超声水浴清洗机的水槽中，进行超声改性，得到改性大豆蛋白溶液；

[0022] 所述步骤(1)中超声处理的温度为45‑55℃，所述超声处理的超声功率为800‑1200W，所述超声处理的时间为10‑30min；

[0023] 优选的，步骤(1)中超声处理的温度为50℃，超声功率为1000W，超声时间为20min；

[0024] 所述步骤(1)中大豆蛋白溶液的浓度为3.0％‑6.0％；

[0025] 优选的，步骤(1)中大豆蛋白溶液的浓度为5.0％，步骤(3)中多糖溶液的浓度为5.0％；

[0026] 所述步骤(4)中调整体系pH的试剂为酸性溶液，步骤(5)中调节体系pH的试剂为碱性溶液；所述酸性溶液包括盐酸、醋酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸和酒石酸中的一种或多种，所述碱性溶液包括氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠和碳酸氢二钠中的一种或多种；

[0027] 优选的，所述步骤(4)中的温度保持在45℃，调整体系的pH至4.6，步骤(5)中的温度降低到10℃，调节体系的pH至6.0；

[0028] 所述步骤(4)中调整体系的pH后，进行搅拌处理，所述搅拌速度为600‑800rpm，搅拌时间为10‑20min；

[0029] 优选的，所述步骤(4)中的搅拌速度为700rpm，搅拌时间为15min；

[0030] 所述步骤(5)中的固化剂为京尼平和单宁酸，所述京尼平和单宁酸的添加无时间顺序限定，所述京尼平的添加量为大豆蛋白质量的5.0％‑15.0％，所述单宁酸的添加量为大豆蛋白质量的5.0％‑15.0％；

[0031] 优选的，所述京尼平的添加量为大豆蛋白质量的6.0％‑10.0％，所述单宁酸的添加量为大豆蛋白质量的8.0％‑13.0％；

[0032] 优选的，所述步骤(5)中京尼平的添加量为大豆蛋白质量的8.0％，单宁酸的添加量为大豆蛋白质量的10.0％；

[0033] 所述步骤(5)中加入固化剂后，进行搅拌，所述搅拌的转速为600‑800rpm，所述搅拌时间为55‑65min；

[0034] 优选的，所述步骤(5)中的搅拌速度为700rpm，搅拌时间为60min；

[0035] 所述步骤(6)中湿微胶囊的处理方法为，将湿微胶囊在‑80℃下预冷冻24h后，使用冷冻干燥法干燥，得到益生菌粉末。

[0036] 本发明还提供了一种益生菌微胶囊。

[0037] 本发明还提供了一种益生菌微胶囊在制备耐胃酸口服益生菌制剂中的应用。

[0038] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0039] 1)由于本发明使用了非酶的方式对微胶囊的壁材进行固定，无需灭酶处理，因此本发明在制备益生菌微胶囊时不会影响益生菌的活性；本发明通过合理复合使用单宁酸和京尼平两个固化剂，使得产品的结构稳定性良好，能够有效保护所包埋益生菌在贮藏期间的活性，且能够实现在胃液环境中对所包埋益生菌的保护，添加于药品时，可以将益生菌递送到肠道中并迅速释放，以发挥益生菌的益生作用；

[0040] 2)本发明将改性大豆蛋白和植物或微生物来源的多糖作为壁材，包埋益生菌制备微胶囊粉末，由于本发明使用了复合凝聚法，使得微胶囊化的全过程条件温和，不涉及高温、高速搅拌、高压均质等工艺流程，能够有效地保护益生菌的活性，此外，本发明的工艺环节相对简单，原料廉价易得，有利于生产企业控制生产成本，提高生产效率；

[0041] 3)本发明所使用的大豆蛋白功能特性基础好，通过改性进一步增强了大豆蛋白的功能特性，作为微胶囊壁材使用可以替代常用的动物蛋白，如明胶蛋白等；产品原料中不含动物源性成分，产品在消费者中受众广泛，接受度高；

[0042] 4)本发明能够得到微米尺寸的益生菌微胶囊，与目前应用更为广泛的水凝胶珠形式的微胶囊相比，本发明具备产品尺寸较小，易于在多种产品形态中添加，应用范围广泛的特点，特别适合口服益生菌制剂在药品中添加和使用。

[0043] 综上，本发明通过使用乳化性、起泡性等功能特性良好的大豆蛋白与植物或微生物来源的多糖共同作为微胶囊壁材，使用复合凝聚的方法制备益生菌微胶囊，并采用单宁酸与京尼平协同进行固化，能够以较低成本和较为简单的工艺方法制得具有较高保护能力的益生菌微胶囊。

具体实施方式

[0044] 本发明提供了一种基于复合凝聚法制备益生菌微胶囊的方法，包括以下步骤：

[0045] (1)将大豆蛋白溶液进行超声改性，得到改性大豆蛋白溶液；

[0046] (2)将所述改性大豆蛋白溶液与益生菌混合得到蛋白‑益生菌混合溶液，每100mL8 10
的改性大豆蛋白溶液与10‑10 cfu的益生菌混合；

[0047] (3)将多糖溶解于水中，得到浓度为3.0‑6.0％的多糖溶液；

[0048] (4)将步骤(2)制得的蛋白‑益生菌混合溶液与多糖溶液混合后，保持体系温度在40‑50℃，调整体系pH至4.4‑4.8，得到蛋白‑益生菌‑多糖混合溶液；

[0049] (5)将步骤(4)制得的蛋白‑益生菌‑多糖混合溶液的温度降低到8‑12℃，调节体系的pH至5.5‑6.5，加入固化剂，静置、去除上清，得到湿微胶囊；

[0050] (6)将湿微胶囊冷冻干燥，得到益生菌粉末。

[0051] 在本发明中，将大豆蛋白溶液进行超声改性，得到改性大豆蛋白溶液。在本发明中，所述大豆蛋白溶液优选的将大豆蛋白溶解于水中获得，所述溶解的温度优选为45‑55℃，进一步优选为48‑52℃，更进一步优选为50℃；所述大豆蛋白溶液的浓度优选为3.0‑6.0％，进一步优选为4.0‑5.5％，更进一步优选为5.0％。在本发明中，所述大豆蛋白溶解于水的过程优选的在恒温水浴的条件下进行；本发明在获得所述大豆蛋白溶液后，将大豆蛋白溶液进行超声改性，所述超声改性优选的将大豆蛋白溶解后置于密闭容器中进行超声处理；所述超声处理的温度优选为45‑55℃，进一步优先为48‑52℃，更进一步优先为50℃；所述超声处理的超声功率优选为800‑1200W，进一步优选为900‑1100rpm，更进一步优选为
1000rpm；所述超声处理的时间优选为10‑30min，进一步优选为15‑25min，更进一步优选为
20min。在本发明中，所述超声处理优选的在超声水浴清洗机中进行。

[0052] 本发明在获得改性大豆蛋白溶液后，将所述改性大豆蛋白溶液与益生菌混合得到蛋白‑益生菌混合溶液。在本发明中，所述益生菌是经冷冻保藏的益生菌培养物在4℃下离心，去除上清后获得，或使用生理盐水溶液洗涤2次后离心获得的益生菌菌泥或菌悬液；所述加入益生菌菌泥或菌悬液前需将改性大豆蛋白溶液的温度降低到40‑50℃，优选为43‑47℃，进一步优选为45℃；所述将改性大豆蛋白溶液与益生菌混合后需经磁力搅拌使溶液混合均匀。

[0053] 在本发明中，将多糖溶解于水中，得到浓度为3.0‑6.0％的多糖溶液，所述多糖溶液的浓度优选为3.5‑5.5％，进一步优选为5.0％。

[0054] 本发明在制备获得蛋白‑益生菌混合溶液与多糖溶液后，将二者混合得到蛋白‑益生菌‑多糖混合溶液。在本发明中，所述蛋白‑益生菌混合溶液与多糖溶液混合时为等体积混合；所述混合后及调节体系pH后均需进行搅拌处理，所述搅拌处理的搅拌速度优选为600‑800rpm，进一步优选为650‑760rpm，更进一步优选为700rpm；本发明对蛋白‑益生菌混合溶液与多糖溶液混合后的搅拌时间没有特殊限定，以混合均匀为宜；所述调节体系pH后的搅拌时间优选为10‑20min，进一步优选为13‑18min，更进一步优选为15min；所述体系温度优选为保持在42‑48℃，进一步优选为45℃；所述调节体系pH优选为4.5‑4.7，进一步优选为4.6。

[0055] 本发明在获得蛋白‑益生菌‑多糖混合溶液后，将所述蛋白‑益生菌‑多糖混合溶液温度的降低到8‑12℃，调节体系的pH至5.5‑6.5，加入固化剂，静置、去除上清，得到湿微胶囊。在本发明中，所述蛋白‑益生菌‑多糖混合溶液的温度优选为降低至9‑11℃，进一步优选为降低至10℃；所述调节体系的pH优选为5.6‑6.2，进一步优选为6.0；所述添加的固化剂为京尼平和单宁酸，所述京尼平和单宁酸的添加无时间顺序限定，所述京尼平的添加量为大豆蛋白质量的5.0‑15.0％，进一步优选为6.0‑10.0％，更进一步优选为8.0％；所述单宁酸的添加量为大豆蛋白质量的5.0‑15.0％，进一步优选为8.0‑13.0％，更进一步优选为10.0％；所述加入固化剂后均需进行搅拌处理，所述搅拌处理的搅拌速度优选为600‑
800rpm，进一步优选为650‑750rpm，更进一步优选为700rpm；所述搅拌时间优选为55‑
65min，进一步优选为58‑62min，更进一步优选为60min。

[0056] 本发明在获得所述湿微胶囊后，将湿微胶囊冷冻干燥，得到益生菌粉末。在本发明中，所述在湿微胶囊冷冻干燥前需将湿微胶囊在‑80℃下预冷冻12～36h，优选为24h。

[0057] 本发明还提供了上述制备方法制备获得的益生菌微胶囊。所述获得的益生菌微胶囊具有产品尺寸较小，产品结构稳定性良好，易于在多种产品形态中添加，应用范围广泛的特点，尤其适合口服益生菌制剂在药品中添加和使用。本发明制得的益生菌微胶囊能够有效保护所包埋益生菌在贮藏期间的活性，且能够实现其在胃液环境中对所包埋益生菌的保护，添加于药品时，可将益生菌递送到肠道中并迅速释放，能够很好地发挥益生菌的益生作用。

[0058] 本发明还提供了上述益生菌微胶囊在制备耐胃酸口服益生菌制剂中的应用。本发明对所述耐胃酸口服益生菌制剂的剂型以及辅料没有特殊限定，采用本领域常规的益生菌剂型和辅料即可。

[0059] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0060] 实施例1

[0061] 一种基于复合凝聚法制备植物乳杆菌微胶囊粉末的方法，包括以下步骤：

[0062] (1)将冷冻保藏的植物乳杆菌培养物在4℃下离心，去除上清，获得1×109cfu/mL的植物乳杆菌悬液；

[0063] (2)将用作微胶囊壁材的大豆蛋白5.0g溶解于50℃的100mL水中后加盖密封，放置于50℃的恒温水浴中，使得大豆蛋白溶液与水浴温度相同，再将容器转移到超声水浴清洗机的水槽中，设置水浴温度为50℃，超声功率1000W，超声时间20min，进行超声改性，得到改性大豆蛋白溶液；

[0064] (3)将改性大豆蛋白溶液的温度降低到45℃，加入1mL的植物乳杆菌悬液，磁力搅拌以使得溶液中的改性大豆蛋白与益生菌混合均匀，得到大豆蛋白‑植物乳杆菌混合溶液；

[0065] (4)将阿拉伯胶5.0g溶解于45℃的100mL水中，得到阿拉伯胶溶液；

[0066] (5)将大豆蛋白‑植物乳杆菌混合溶液与阿拉伯胶溶液混合，并保持700rpm的搅拌速度和45℃的温度，添加乙酸溶液将体系pH调整到pH4.6后，继续搅拌10min，以进行复合凝聚，再将溶液体系的温度逐渐降低到10℃，并使用碳酸氢钠溶液调节体系pH到6.0；

[0067] (6)加入0.4g的京尼平，以700rpm的转速搅拌60min后，再加入0.5g的单宁酸，继续搅拌60min，静置去除上清，得到湿微胶囊；

[0068] (7)将湿微胶囊在‑80℃预冷冻24.0h后，使用冷冻干燥法干燥，得到植物乳杆菌微胶囊粉末。

[0069] 实施例2

[0070] 一种基于复合凝聚法制备植物乳杆菌微胶囊粉末的方法，包括以下步骤：

[0071] 将实施例1中的步骤(6)改为：先加入0.5g的单宁酸，以700rpm的转速搅拌60min后，再加入0.4g的京尼平，继续搅拌60min后，静置去除上清，得到湿微胶囊。其余步骤与实施例1相同。

[0072] 实施例3

[0073] 一种基于复合凝聚法制备干酪乳杆菌微胶囊粉末的方法，包括以下步骤：

[0074] 将实施例1中的植物乳杆菌替换为干酪乳杆菌，制得干酪乳杆菌微胶囊粉末，其余步骤与实施例1相同。

[0075] 实施例4

[0076] 一种基于复合凝聚法制备双歧杆菌微胶囊粉末的方法，包括以下步骤：

[0077] 将实施例1中的植物乳杆菌替换为双歧杆菌，制得双歧杆菌微胶囊粉末，其余步骤与实施例1相同。

[0078] 对比例1

[0079] 将实施例1中的改性大豆蛋白替换为未经改性的大豆蛋白作为微胶囊壁材原料，制备植物乳杆菌微胶囊粉末，其余步骤与实施例1相同。

[0080] 对比例2

[0081] 去掉实施例1中的步骤(6)，即不使用京尼平和单宁酸对微胶囊壁材进行固定处理，制备植物乳杆菌微胶囊粉末，其余步骤与实施例1相同。

[0082] 对比例3

[0083] 将实施例1中的步骤(6)改为：加入0.4g的京尼平，保持搅拌120min后，静置去除上清，得到湿微胶囊，即仅使用京尼平一种固化剂制备植物乳杆菌微胶囊粉末，其余步骤与实施例1相同。

[0084] 对比例4

[0085] 将实施例1中的步骤(6)改为：加入0.5g的单宁酸，保持搅拌120min后，静置去除上清，得到湿微胶囊，即仅使用单宁酸一种固化剂制备植物乳杆菌微胶囊粉末，其余步骤与实施例1相同。

[0086] 对比实验1：将实施例1‑2和对比例1‑4制得的植物乳杆菌微胶囊保存在25℃的环境中，观察其四周内的存活率(％)，结果如表1所示：

[0087] 表1：不同植物乳杆菌微胶囊粉末在25℃环境下的存活率

[0088]

[0089] 结果显示，根据本发明的制备方法制得的植物乳杆菌微胶囊在25℃下保存28d后，其存活率可达到88％以上，且前21d的存活率均在90％以上。该实验结果表明，本发明所制备的益生菌微胶囊能够在常温条件下确保所固定益生菌的存活率，蛋白质的改性和双重固化剂复合固定技术的使用能够有效提升微胶囊对所固定微生物的保护能力。

[0090] 对比实验2：将实施例1‑4制得的植物乳杆菌微胶囊粉末、干酪乳杆菌微胶囊粉末、双歧乳杆菌微胶囊粉末置于模拟胃液中，进行体外抗性实验。其中，模拟胃液的配方为：胃蛋白酶1.25g、柠檬酸钠0.5g、苹果酸钠0.5g、乳酸420μL、乙酸500μL，加800mL水溶解，用20％盐酸调节至pH 2.0，加水稀释成1000mL。将三种益生菌微胶囊粉末分别以1:8(w/v)的比例放置在温度为37℃的模拟胃液中，并辅以100rpm的速度搅拌，观察其40min内的存活率(％)，结果如表2所示：

[0091] 表2：不同益生菌制得的微胶囊粉末在模拟胃液中的存活率

[0092]

[0093] 结果显示，本申请制得的不同益生菌微胶囊粉末能够在37℃的模拟胃液中，存活40min，且存活率均在97％以上。该实验结果表明，在37℃的模拟胃液环境中，本发明所制备的微胶囊壁材层可以在40min内对益生菌起到有效的防护作用，也就意味着益生菌具备较好的人工胃液耐受能力。

[0094] 对比试验3：将实施例1‑4制得的植物乳杆菌微胶囊粉末、干酪乳杆菌微胶囊粉末、双歧乳杆菌微胶囊粉末置于模拟肠液中，进行体外释药实验。其中，模拟肠液的配方为0.5g胰酶、1.75g胆酸钠，加800mL水溶解，用氢氧化钠调节pH至7.0，加水稀释成1000mL。将三种益生菌微胶囊粉末分别以1:8(w/v)的比例放置在温度为37℃的模拟肠液中，并辅以100rpm的速度搅拌，观察4h内的益生菌微胶囊粉末的释放性能(以活菌数log cfu/g计算)，结果如表3所示：

[0095] 表3：不同益生菌微胶囊粉末在模拟肠液中的释放性能

[0096]

[0097] 结果显示，本发明制得的益生菌微胶囊粉末在模拟肠液中的释放率随时间的延长而升高。该实验结果表明，在模拟肠液环境中，微胶囊的壁材层可以实现对所固定益生菌的快速释放。进一步的，综合模拟胃液环境的实验结果表明，本发明所制备微胶囊能够将所包埋的益生菌有效递送到胃肠道内发挥益生功效。

[0098] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。