一种用于抗血栓药物治疗血栓疗效预测的SNP标志物及其应用转让专利
申请号 : CN202211352613.2
文献号 : CN115386630B
文献日 : 2023-02-03
发明人 : 崔一民 , 刘志艳 , 向倩 , 王哲 , 母光妍 , 周双 , 张涵煦
申请人 : 北京大学第一医院
摘要 :
本发明公开了一种用于抗血栓药物治疗血栓疗效预测的SNP标志物及其应用。本发明具体涉及到AHNAK2的SNP位点rs10145032。本发明属于生物医药领域，为预测抗血栓药物治疗血栓的疗效，本发明提供了一个SNP位点rs10145032用于抗血栓药物治疗血栓疗效的预测。本发明的有益效果在于：首次发现了SNP位点rs10145032的基因型与抗血栓药物治疗血栓的疗效相关，通过检测rs10145032的基因型，可以判断抗血栓药物治疗血栓的疗效。
权利要求 :
1.检测样本中SNP标志物的试剂在制备抗血栓药物治疗血栓疗效预测的产品中的应用，其特征在于，所述SNP标志物包括AHNAK2基因的SNP位点rs10145032。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗血栓药物包括溶栓药、抗凝药、抗血小板药，所述溶栓药包括尿激酶、阿替普酶、瑞替普酶或链激酶，所述抗凝药包括肝素、华法林、阿加曲班、磺达肝癸钠、利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班或达比加群酯，所述抗血小板药包括血栓素A2抑制剂、二磷酸腺苷P2Y12受体拮抗剂、凝血酶受体拮抗剂、5‑羟色胺受体拮抗剂、血小板糖蛋白、磷酸二酯酶抑制剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血栓包括白色血栓、混合血栓、红色血栓、透明血栓，所述白色血栓包括延续性血栓，所述混合血栓包括红细胞为主的血栓、球形血栓或层状血栓。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序、系统。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当rs10145032的基因型为GG时，受试者服用抗血栓药物后药效较差；当rs10145032的基因型为GC时，受试者服用抗血栓药物后药效较好；当rs10145032的基因型为CC时，受试者服用抗血栓药物后药效较好但出血事件概率升高。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括通过直接测序、单碱基延伸、等位基因特异性探针杂交、等位基因特异性引物延伸、等位基因特异性扩增、等位基因特异性核苷酸掺入、5 '核酸酶消化、分子信标测定、寡核苷酸连接测定、大小分析和单链构象多态性方法检测rs10145032基因型的试剂。
7.根据权利要求1‑6任一项所述的应用，其特征在于，所述样本为血液。
说明书 :
一种用于抗血栓药物治疗血栓疗效预测的SNP标志物及其
应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种用于抗血栓药物治疗血栓疗效预测的SNP位点及其应用，具体涉及的SNP标志物为rs10145032。
背景技术
[0002] 在全球范围内，血栓性疾病的发病率和死亡率都居首位。冠状动脉血栓导致的心梗和脑血管栓塞导致的脑梗都是临床上常见的缺血性中风，深静脉血栓、肺栓塞等心血管疾病也同样是血栓的重要致病因素，抗血栓治疗作为以上提到的疾病的核心抢救措施，其抗凝血是抗血栓治疗的重要组成部分。
[0003] 在血栓栓塞性疾病的疗法和预防中，使用了多种抗凝血药物，但抗凝血药物经常会出现高出血风险，包括脑溢血、胃肠道出血、血小板减少症、药物性脱发或骨质疏松症。
[0004] 口服抗凝药物，如利伐沙班，在治疗血栓高危患者中用途广泛，但利伐沙班依然与临床应用中出血事件的风险增加有关。在以往服用利伐沙班的患者，每年出现出血事件的概率在20%左右，存在住院和死亡风险。因此研究一些药物基因组学有益于血栓患者的临床个体化用药，有效保障血栓患者的生命健康。
发明内容
[0005] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种与抗血栓药物治疗血栓疗效预测相关的SNP标志物，以更加准确全面地评估个体使用抗血栓药物后的药效，减少药物不良反应，实现临床用药个体化。
[0006] 本发明的目的之一在于提供一种用于抗血栓药物治疗血栓疗效预测的产品，所述产品包括检测样本中SNP位点rs10145032基因型的试剂。
[0007] 进一步，所述SNP位点rs10145032为AHNAK2基因的SNP位点rs10145032。
[0008] 术语“SNP”（单核苷酸多态性）是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP是人类的可遗传变异中最为常见的一种，占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每300个碱基对中就有1个。SNP是一种二态的标记，由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。SNP既可能在基因序列内，也可能在基因以外的非编码序列上。SNP位点的命名方式是以“rs‑”方式命名的，在数据库和相关的信息系统中凭借此命名就可以准确的找到位置、核苷酸序列等。
[0009] 术语“治疗”是指给予化合物或组合物以控制疾病的进展。疾病进展的控制应理解为达到有益或期望的临床结果，包括但不限于减轻症状、减少疾病持续时间、稳定病理状态(特别是避免额外恶化)、疾病进展的延迟、病理状态的改善和缓解(部分和全部)。与不进行治疗的预期生存相比，疾病进展的控制还涉及生存期的延长。
[0010] 进一步，所述抗血栓药物包括溶栓药、抗凝药、抗血小板药中的一种或多种。
[0011] 进一步，所述溶栓药包括尿激酶、阿替普酶、瑞替普酶或链激酶。
[0012] 在本发明中，术语“溶栓药”是指包括纤溶酶原、纤溶酶、激活酶原和抑制物的溶解血栓的药物。溶栓药的原理是通过促进纤维蛋白溶解而溶解血栓，其中溶栓酶是促进蛋白溶解剂或纤溶酶原的直接激活剂。体内纤维蛋白溶解过程是一系列蛋白酶催化反应，首先是体内激活剂被活化并转化为纤溶酶原的激活剂；之后经过激活剂的处理，纤溶酶原就转化为了纤溶酶，最后纤溶酶作用于纤维蛋白将之溶解。
[0013] 进一步，所述抗凝药包括肝素、华法林、磺达肝癸钠、利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班、阿加曲班或达比加群酯。
[0014] 在本发明中，术语“抗凝药”也称作抗凝素、抗凝物、抗凝血素，主要用于防治血管内栓塞或血栓形成的疾病，预防中风或其它血栓性疾病。抗凝药是通过影响凝血过程中的某些凝血因子阻止凝血过程的药物。
[0015] 进一步，所述抗血小板药包括血小板糖蛋白、磷酸二酯酶抑制剂、血栓素A2抑制剂、二磷酸腺苷P2Y12受体拮抗剂、凝血酶受体拮抗剂、5‑羟色胺受体拮抗剂中的一种或多种。
[0016] 在本发明中，术语“抗血小板药”是指用来抑制血小板的环氧化酶生长的药物。抗血小板药物主要分为两大类，分别是抑制血小板聚集药物、影响血小板活化扩增药物。抑制血小板聚集的药物包括血小板糖蛋白，磷酸二酯酶抑制剂两大类；影响血小板活化扩增的药物主要有血栓素A2抑制剂，二磷酸腺苷P2Y12受体拮抗剂，凝血酶受体拮抗剂，5‑羟色胺受体拮抗剂这四类。
[0017] 进一步，所述血小板糖蛋白包括阿西单抗或替罗非班。
[0018] 进一步，所述磷酸二酯酶抑制剂包括双嘧达莫或西洛他唑。
[0019] 进一步，所述血栓素A2抑制剂包括阿司匹林。
[0020] 进一步，所述二磷酸腺苷P2Y12受体拮抗剂包括噻吩吡啶类（如噻氯匹定、氯吡格雷或普拉格雷）或非噻吩吡啶类（如替卡格雷、坎格雷洛或替格瑞洛）。
[0021] 进一步，所述凝血酶受体拮抗剂包括Vorapaxar(SCH‑530348)或Atopaxar( E5555)。
[0022] 进一步，所述5‑羟色胺受体拮抗剂包括沙格雷酯或西酞普兰。
[0023] 进一步，所述血栓包括白色血栓如延续性血栓、混合血栓、红色血栓、透明血栓中的一个或多个。
[0024] 进一步，所述混合血栓包括红细胞为主的血栓、球形血栓或层状血栓。
[0025] 进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序、系统中的一种或多种。
[0026] 进一步，所述试剂包括与rs10145032亲和的核酸配体。
[0027] 进一步，所述亲和的核酸配体包括RNA、DNA、PNA、CAN、HNA、LNA或ANA。
[0028] 进一步，所述核酸配体包括引物或探针。
[0029] 进一步，所述引物包括18个或更多个核苷酸，以及50个或更少核苷酸。
[0030] 进一步，所述引物或探针可以使用磷酰亚胺固相支持法或其他熟知方法化学合成。
[0031] 进一步，所述引物或探针使用本领域已知的许多手段修饰所述核酸序列。
[0032] 进一步，所述许多手段修饰包括甲基化、加帽、用天然核苷酸的一种或多种类似物进行的置换或在核苷酸之间的修饰。
[0033] 进一步，所述核苷酸之间的修饰包括修饰不带电荷的连接体如磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰亚胺、氨基甲酸酯，或修饰带电荷的连接体如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯。
[0034] 进一步，所述探针包括可以完成特异性杂交、与目的核酸序列特异性结合的任意长度片段。
[0035] 进一步，所述探针的类型包括RNA、DNA、PNA、CAN、HNA、LNA、ANA或其它衍生物。
[0036] 在本发明中，术语“引物”表示寡核苷酸，不管是在纯化的限制性消化物中天然存在还是合成产生，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下，即在存在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶并在合适温度和pH下时它能作为合成起点。引物可以是单链或双链，并且必须足够长以在诱导剂存在下引发合成预期的延伸产物。引物的确切长度依赖于很多因素，其中包括温度、引物来源和使用方法。例如，对于诊断应用，依赖于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15‑25个或更多核苷酸，尽管它可以含有更少核苷酸。参与确定引物适当长度的因素对于本领域技术人员容易知道。
[0037] 在本发明中，术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸 （往往称为“靶多核苷酸”） 结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
[0038] 探针通常被直接标记，例如用同位素、发色团、发光团、色原体，或被间接标记，例如用生物素，链霉亲和素复合物随后可以与生物素结合。因此，本发明测定中所用的可检测的标记可以是一级标记（其中该标记包含可直接检测的元件或能产生直接可检测的元件的元件） 或二级标记（其中可检测的标记与一级标记结合，例如，免疫标记中常用的）。通常，标记的信号核酸用于检测杂交。可以通过常用于检测杂交多核苷酸存在的数种方法中的任3 125 35 14 32
一种标记互补的核酸或信号核酸。最常用的检测方法是利用用H、 I、S、C 或 P 标记的探针等的放射自显影法。其它标记包括，例如，能结合标记抗体的配体、荧光团、化学发光剂、酶以及能作为标记配体的特异结合对成员的抗体。
一种标记互补的核酸或信号核酸。最常用的检测方法是利用用H、 I、S、C 或 P 标记的探针等的放射自显影法。其它标记包括，例如，能结合标记抗体的配体、荧光团、化学发光剂、酶以及能作为标记配体的特异结合对成员的抗体。
[0039] 在作为探针使用的多核苷酸的大小优选为18个或更多个核苷酸、更优选为 20个或更多个核苷酸，以及转录区域的全长或更少。作为引物使用时，该多核苷酸大小优选为18个或更多个核苷酸，以及50个或更少核苷酸。
[0040] 进一步，所述产品包括处理样本的试剂。
[0041] 在本发明的上下文中，所使用的术语“样本”是指获得自或衍生自受试者的组合物，其包含有待根据例如物理，生化，化学和/或生理特点来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。例如，样本是指来源于受试者的任何样本，预计或已知其包含待表征的细胞和/或分子实体。
[0042] 进一步，所述样本包括但不限于，组织样本（例如肿瘤组织样本），原代或培养的细胞或细胞系、细胞上清、细胞裂解物、血小板、血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、滤泡液、精液、羊水、乳液、全血、血液衍生的细胞、尿液、脑脊髓液、唾液、痰液、泪液、汗液、粘液、肿瘤裂解物、组织培养液、组织提取物、匀浆化的组织、肿瘤组织、细胞提取物中的一种或其组合。
[0043] 进一步，所述样本为血液。
[0044] 进一步，所述产品还包括记载了前面所述的抗血栓药物治疗血栓疗效预测步骤的产品说明书，所述预测步骤包括：
[0045] 1）来自样本的核酸与检测rs10145032基因型的试剂接触；
[0046] 2）确定rs10145032的基因型；
[0047] 3）基于所述基因型预测受试者使用抗血栓药物治疗血栓的疗效。
[0048] 进一步，所述rs10145032的基因型为GG时，受试者服用前面所述的抗血栓药物后药效较差；当rs10145032的基因型为GC时，受试者服用前面所述的抗血栓药物后药效较好；当rs10145032的基因型为CC时，受试者服用前面所述的抗血栓药物后药效较好但出血事件概率升高。
[0049] 本发明的另一目的在于提供检测样本中SNP标志物的试剂在制备抗血栓药物治疗血栓疗效预测的产品中的应用，所述SNP标志物包括AHNAK2基因的SNP位点rs10145032。
[0050] 进一步，所述抗血栓药物包括溶栓药、抗凝药、抗血小板药中的一种或多种。
[0051] 进一步，所述溶栓药包括尿激酶、阿替普酶、瑞替普酶或链激酶。
[0052] 进一步，所述抗凝药包括肝素、华法林、阿加曲班、磺达肝癸钠、利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班或达比加群酯。
[0053] 进一步，所述抗血小板药包括血栓素A2抑制剂、二磷酸腺苷P2Y12受体拮抗剂、凝血酶受体拮抗剂、5‑羟色胺受体拮抗剂、血小板糖蛋白、磷酸二酯酶抑制剂中的一种或多种。
[0054] 进一步，所述血小板糖蛋白包括阿西单抗或替罗非班。
[0055] 进一步，所述磷酸二酯酶抑制剂包括双嘧达莫或西洛他唑。
[0056] 进一步，所述血栓素A2抑制剂包括阿司匹林。
[0057] 进一步，所述二磷酸腺苷P2Y12受体拮抗剂包括噻吩吡啶类（如噻氯匹定、氯吡格雷或普拉格雷）或非噻吩吡啶类（如替卡格雷、坎格雷洛或替格瑞洛）。
[0058] 进一步，所述凝血酶受体拮抗剂包括Vorapaxar(SCH‑530348)或Atopaxar( E5555)。
[0059] 进一步，所述5‑羟色胺受体拮抗剂包括沙格雷酯或西酞普兰。
[0060] 进一步，所述血栓包括白色血栓如延续性血栓、混合血栓、红色血栓、透明血栓中的一个或多个。
[0061] 进一步，所述混合血栓包括红细胞为主的血栓、球形血栓或层状血栓。
[0062] 进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序、系统中的一种或多种。
[0063] 进一步，当rs10145032的基因型为GG时，受试者服用前面所述的抗血栓药物后药效较差；当rs10145032的基因型为GC时，受试者服用前面所述的抗血栓药物后药效较好；当rs10145032的基因型为CC时，受试者服用前面所述的抗血栓药物后药效较好但出血事件概率升高。
[0064] 进一步，所述试剂包括通过直接测序、单碱基延伸、等位基因特异性探针杂交、等位基因特异性引物延伸、等位基因特异性扩增、等位基因特异性核苷酸掺入、5 '核酸酶消化、分子信标测定、寡核苷酸连接测定、大小分析和单链构象多态性方法检测rs10145032基因型的试剂。
[0065] 进一步，所述样本为血液。
[0066] 本发明的优点和有益效果：
[0067] 本发明首次发现了SNP位点rs10145032的基因型与抗血栓药物治疗血栓的疗效相关，通过检测rs10145032的基因型，可以判断抗血栓药物治疗血栓的疗效。
附图说明
[0068] 图1是研究设计流程图；
[0069] 图2是AHNAK2基因多态性对凝血酶原时间比值的影响趋势图；
[0070] 图3是AHNAK2基因多态性对凝血酶原时间比值预测的ROC曲线图；
[0071] 图4是AHNAK2基因多态性对1个月出血事件的影响趋势图；
[0072] 图5是AHNAK2基因多态性对出血事件预测的ROC曲线图。
具体实施方式
[0073] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本发明所揭露的内容轻而易举地了解本发明的优点和功能。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0074] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
[0075] 实施例1 健康人服用利伐沙班后药效学、药物动力学、生物指标结果分析[0076] 1、研究对象和样本收集
[0077] 基于全国多中心的临床生物等效性试验，研究中心包括北京大学第一医院、北京回龙观医院、辽宁中医药大学附属医院、青岛大学附属医院、南昌大学第一附属医院的一期2
临床试验中心。研究认为为18‑45岁、身体质量指数在18‑26 kg/m 之间的中国健康受试者。
所有受试者在研究开始前至少4周没有服用任何药物。健康受试者在服药前一天进入研究，他们被随机分配到测试剂组或参照组，不同组别间无显著性差异（p<0.05），结果如表1所示。除利伐沙班15 mg剂量组和10 mg剂量组的年龄外，各剂量组健康受试者的人口统计学特征无差异。
临床试验中心。研究认为为18‑45岁、身体质量指数在18‑26 kg/m 之间的中国健康受试者。
所有受试者在研究开始前至少4周没有服用任何药物。健康受试者在服药前一天进入研究，他们被随机分配到测试剂组或参照组，不同组别间无显著性差异（p<0.05），结果如表1所示。除利伐沙班15 mg剂量组和10 mg剂量组的年龄外，各剂量组健康受试者的人口统计学特征无差异。
[0078] 受试者在空腹和餐后条件下接受单剂量的利伐沙班，包括10、15和20 mg。所有受试者均在利伐沙班给药48 h或72 h后出院。图1显示了利伐沙班在健康志愿者中的研究设计。
[0079] 本研究是根据临床实践指南和赫尔辛基宣言进行的，方案由独立的伦理委员会和北京大学第一医院及所有参与研究的分中心医院机构审查委员会批准(批件号:2016[1235])。临床试验在Clinical Trials中注册号为NCT03161496。在研究开始前，向所有受试者简要介绍研究的目的、持续时间和潜在风险，并提供书面知情同意书。
[0080] 2、研究方法
[0081] 2.1 血样采集
[0082] 药效学（pharmacodynamics，PD）参数的检测采样时间分别为给药后0、3、8、12 h。在2.7 mL柠檬酸钠（3.2% v/v）试管中采集血液样本，在采样60 min内，室温下2500 g离心
15 min。血浆样本在取样后6个月内转移到‑70℃低温保存，等待进行检测分析。
15 min。血浆样本在取样后6个月内转移到‑70℃低温保存，等待进行检测分析。
[0083] 2.2 PD分析方法
[0084] 使用Sysmex®CS‑2100i全自动多参数止血分析仪（Sysmex，日本）检测PD参数（活化部分凝血酶活时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶原时间（prothrombin time，PT））。采用经验证的凝血法检测试剂盒（Thromborel‑S®和Actin®，西门子医疗诊断产品有限公司，德国）测定PT和APTT。
[0085] 2.3 基因检测分析方法
[0086] 采用盐析法从外周血中提取基因组DNA，进行全外显子组测序。测序库是通过对KAPA库制备试剂盒（KAPA Biosystems Inc.，美国）的修改构建而成。使用Bioruptor（Diagenode，Lie 'ge，Belgium）将1 μg的基因组DNA剪切到平均200 bp的片段大小。片段用amprexp珠（Beckman Coulter Inc.，美国）纯化。测序库进行最小PCR循环，并使用量子比特2.0荧光计（Thermo Fisher Scientific，美国）进行定量。使用Roche NimbleGen SeqCap EZ外显子组扩增试剂盒V3 （Roche NimbleGen，Inc.，瑞士）将测序库合并为池进行溶液相杂交。捕获的测序库使用安捷伦2100生物分析仪（安捷伦科技公司，美国）进行分析，使用量子比特2.0荧光仪（Thermo Fisher Scientific，美国）测量DNA浓度，然后发送测序，使用HiSeq 3000平台（Illumina，Inc.，美国）生成2×150 bp的对端解读。除了表型差异外，质量控制步骤还发现了低阅读深度和覆盖率、性别不匹配、潜在亲缘关系和群体分层。
[0087] 对于常见的单核苷酸多态性（MAF>0.01），采用加性遗传模型，基于卡方检验进行‑5初级单核苷酸多态性关联分析。采用全基因组显著性阈值p<1×10 校正多重检测。采用PLINK v 1.90进行全基因组关联分析。采用Epacts v 3.2.6软件（https://genome.sph.umich.edu/wiki/EPACTS）进行基因检测，筛选罕见SNP (0.001 < MAF <
0.05)。选择至少2个Epacts模型中p < 0.01的基因作为候选基因，按照以下标准进行筛选：
1000个基因组中变异MAF <1%、1000个基因组东亚血统人群、ExAC和ExAC东亚血统人群;该变异位于外显子区域；CADD phred评分至少为15分，这意味着可能存在破坏性变异。
0.05)。选择至少2个Epacts模型中p < 0.01的基因作为候选基因，按照以下标准进行筛选：
1000个基因组中变异MAF <1%、1000个基因组东亚血统人群、ExAC和ExAC东亚血统人群;该变异位于外显子区域；CADD phred评分至少为15分，这意味着可能存在破坏性变异。
[0088] 2.4 数据统计分析
[0089] 所有统计分析均使用统计软件包社会科学21.0软件（IBM，Armonk，美国）进行。使用Pearson相关分析检验变量之间的相关性。采用Logistic回归方法评估PG和PD参数的显著性差异，分别采用粗模型和经基线特征调整的模型。P< 0.05为差异有统计学意义。连续变量和分类变量以平均值±标准差（SD）、频率和百分比表示。采用差异基因超几何分布检验计算p值，采用Benjamini‑Hochberg多重检验计算误检率。
[0090] 3、研究结果
[0091] 研究发现AHNAK2基因上SNP位点 rs10145032显著影响利伐沙班的PT比值（p=0.0004）。SNP位点rs10145032不同基因型为GG/GC/CC，其携带者的基因分布情况为40/137/
112，结果如表2所示。
112，结果如表2所示。
[0092]
[0093] 与AHNAK2基因rs10145032的GC、CC携带者相比，40位携带AHNAK2基因rs10145032的GG位点受试者的PT比值下降，p值为0.0004，具有统计学意义。研究结果表明AHNAK2基因rs10145032的GG基因携带者服用利伐沙班后PT改变较小，提示高凝状态，临床用药时需根据用药目的进行酌情增加药物剂量，结果如图2所示。
[0094] 采用ROC曲线分析AHNAK2基因上的SNP rs10145032对凝血酶原的预测，发现AUC值为0.93，敏感性为1.0，特异性为0.66，预测基因突变为G基因携带者，可对药效学有预测意义，结果如图3所示。
[0095] 实施例2 NVAF患者服用利伐沙班后药效学、药物动力学、生物指标结果分析[0096] 1、研究对象选择
[0097] 本研究纳入包括18岁以上接受血栓预防的非瓣膜性房颤（non‑valvular atrial fibrillation，NVAF）患者。排除标准如下：
[0098] 1）免疫缺陷性疾病、病毒性肝炎、严重肝功能异常或肾功能异常患者；
[0099] 2）利伐沙班治疗前14天内接受p‑糖蛋白抑制剂联合治疗的患者，包括全身吡咯类抗真菌药物酮康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑，人免疫缺陷病毒蛋白酶抑制剂利托那韦，或诱导剂利福平、苯妥英、苯巴比妥、卡马西平；
[0100] 3）利伐沙班是否有过敏、活动性出血、过去6个月有颅内或胃肠道出血史、30天内有无大手术等禁忌症；
[0101] 4）不愿意按时服药或按规定献血。
[0102] 该研究方案经北京大学第一医院独立伦理委员会和所有临床注册号为NCT03161496的分中心医院批准。这项研究遵守了《赫尔辛基宣言》中概述的道德原则。所有参与本研究的患者均签署了知情同意书。
[0103] 2、研究方法
[0104] 2.1 基因检测
[0105] 随访期间采集基因血样，提取DNA进行基因分型。采用SureSelectXT目标富集系统和Illumina NovaSeq 6000测序仪（Illumina，美国）进行全外显子组测序检测SNP。基因分型后对样本和遗传标记进行严格的质量控制。缺失率<10%、次要等位基因频率>5%、Hardy‑‑6Weinberg平衡p值>10 的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）被纳入进一步分析。
[0106] 2.2 研究结局事件
[0107] 在临床患者入组后1个月、6个月、1年和2年通过电话或常规门诊进行随访。主要安全结果为出血事件，包括出血学术研究联盟划分的大出血和小出血。次要终点是中风或全身栓塞事件。中枢神经系统以外的部位出现全身性栓塞，导致四肢、肾脏和其他内脏器官急性缺血，诊断依据是突然出现的局部疼痛，伴有寒冷、无脉的四肢或血尿，并通过血管造影、超声检查或计算机断层扫描确诊。
[0108] 2.3 数据统计分析
[0109] 连续变量用平均值和标准差表示，而分类变量用百分数表示。所有统计分析均使用R软件（http://www.R‑project.org）和statistical Package for Social Sciences软件，版本21.0（IBM，Armonk，美国）分析。使用卡方检验，P值<0.05表示可能偏离总体分布。采用Cox比例风险模型计算风险比，确定预后因素及亚组间差异。
[0110] 3、研究结果
[0111] 2017年6月至2021年7月共纳入257例NVAF患者。入组时，50.97%(131/257)的患者进行了射频导管消融。纳入患者的基线特征如表3所示。
[0112]
[0113] 本研究探索了遗传变异对NVAF患者服用利伐沙班后临床结局（出血、栓塞等事件）的影响。研究发现AHNAK2基因上的SNP rs10145032显著影响利伐沙班的用药后1个月时的出血事件（p=0.03）。
[0114] SNP位点rs10145032不同基因型为GG/GC/CC，其携带者的基因分布情况为40/117/99，结果如表4所示。
[0115]
[0116] 与AHNAK2基因rs10145032的GC、GG携带者相比，99位携带AHNAK2基因rs10145032的CC位点NVAF患者的出血事件发生率高（10% vs. 30%），p值为0.03，具有统计学意义，结果如图4所示。
[0117] 采用ROC曲线分析AHNAK2基因上的SNP 位点rs10145032对出血事件的预测，发现AUC值为0.85，敏感性为0.86，特异性为0.56，预测基因突变为C基因携带者，可对药效学有预测意义，结果如图5所示。
[0118] 本研究在健康人群中证实AHNAK2基因rs10145032的C基因突变者服用利伐沙班后PT改变增加，提示有出血风险；在NVAF患者中的出血事件临床结局中也证实，AHNAK2基因rs10145032的CC基因携带者服用利伐沙班后1个月的出血事件更高。
[0119] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。