用于预防沾粘的氨基酸改质的聚合物及其应用转让专利
申请号 : CN202110576688.8
文献号 : CN115403760B
文献日 : 2023-10-03
发明人 : 张育嘉 , 张运坤 , 黄文延 , 薛敬和 , 蔡协致 , 林宣因 , 徐乃盛 , 林子榆
申请人 : 博唯弘展生技股份有限公司
摘要 :
本发明揭露一种合成氨基酸改质的聚合物及其制备方法和其用途。该合成氨基酸改质的聚合物具有明显的温度敏感特性，改善的抗水侵蚀性和增强的机械性能，并且适于减少或预防术后组织沾粘的形成。此外，该氨基酸改质的聚合物还可作为载体来传输医药活性物质。#imgabs0#
权利要求 :
1.一种具有下式(I)结构的聚合物，其特征在于，
其中：
POLY为聚(环氧乙烷)(PEO)‑聚(环氧丙烷)(PPO)‑聚(环氧乙烷)(PEO)的三嵌段共聚物；
m和n彼此独立地为0或1，其中m和n不能同时为0；以及
AA为氨基酸残基，其氨基直接与POLY的链端结合形成氨基甲酸酯(O—C(═O)—NH)键。
2.根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于，POLY的重量平均分子量为1,000至20,
000道尔顿。
3.根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于，POLY选自由普朗尼克F‑127(PF127)，普朗尼克F‑68(PF68)及普朗尼克L‑35(PL35)所组成的群组。
4.根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于，该氨基酸残基选自由疏水性氨基酸，亲水性氨基酸，碱性氨基酸，酸性氨基酸及芳香族氨基酸所组成的群组。
5.根据权利要求4所述的聚合物，其特征在于，该疏水性氨基酸选自由甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，甲硫氨酸，白氨酸，异白氨酸和脯氨酸所组成的群组；该碱性氨基酸选自由离氨酸，组氨酸和精氨酸所组成的群组；该酸性氨基酸选自由天冬氨酸，天冬酰胺和麸氨酸所组成的群组；该芳香族氨基酸选自由酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸所组成的群组；以及该亲水性氨基酸选自由丝氨酸，半胱氨酸和苏氨酸所组成的群组。
6.根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于，POLY为普朗尼克，以及AA选自由白氨酸，甲硫氨酸，离氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，酪氨酸，丝氨酸和半胱氨酸所组成的群组。
7.一种根据权利要求1所述的聚合物用于制备预防术后组织沾粘和药物递送的药物的用途。
8.一种组成物，其特征在于，包含具有如下式(I)结构的聚合物中的任一种：或其组合，以及医药上可接受的载体；
其中：
POLY为聚(环氧乙烷)(PEO)‑聚(环氧丙烷)(PPO)‑聚(环氧乙烷)(PEO)的三嵌段共聚物；
m和n彼此独立地为0或1，其中m和n不能同时为0；以及
AA为氨基酸残基，其氨基直接与POLY的链端结合形成氨基甲酸酯(O—C(═O)—NH)键。
9.根据权利要求8所述的组成物，其特征在于，POLY的重量平均分子量为1,000至20,
000道尔顿。
10.根据权利要求8所述的组成物，其特征在于，该聚合物中的任一种或其组合的含量为该组成物的5重量％至30重量％。
11.根据权利要求8所述的组成物，其特征在于，POLY选自由普朗尼克F‑127(PF127)，普朗尼克F‑68(PF68)及普朗尼克L‑35(PL35)所组成的群组。
12.根据权利要求8所述的组成物，其特征在于，该氨基酸残基选自由疏水性氨基酸，亲水性氨基酸，碱性氨基酸，酸性氨基酸及芳香族氨基酸所组成的群组。
13.根据权利要求12所述的组成物，其特征在于，该疏水性氨基酸选自由甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，甲硫氨酸，白氨酸，异白氨酸和脯氨酸所组成的群组；该碱性氨基酸选自由离氨酸，组氨酸和精氨酸所组成的群组；该酸性氨基酸选自由天冬氨酸，天冬酰胺和麸氨酸所组成的群组；该芳香族氨基酸选自由酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸所组成的群组；以及该亲水性氨基酸选自由丝氨酸，半胱氨酸和苏氨酸所组成的群组。
14.根据权利要求8所述的组成物，其特征在于，POLY为普朗尼克，以及AA选自由白氨酸，甲硫氨酸，离氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，酪氨酸，丝氨酸和半胱氨酸所组成的群组。
15.根据权利要求8所述的组成物，其特征在于，该组合为两种或多种式(I)的混合，其中POLY为普朗尼克F‑127(PF127)，以及AA选自由离氨酸，丝氨酸及半胱氨酸所组成的群组。
16.根据权利要求8所述的组成物，其特征在于，进一步包含医药活性剂。
17.根据权利要求16所述的组成物，其特征在于，该医药活性剂选自由抗癌药，抗生素，止血剂，类固醇，非类固醇抗发炎剂，激素，止痛剂及麻醉剂所组成的群组。
18.一种根据权利要求8所述的组成物用于制备预防术后组织沾粘和药物递送的药物的用途。
说明书 :
用于预防沾粘的氨基酸改质的聚合物及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种合成氨基酸改质的聚合物及其制备方法和其用途。该氨基酸改质的聚合物具有温度敏感特性，以及能够形成可吸收性的机械屏障，以减少或预防术后组织沾粘。另外，该氨基酸修饰的聚合物能够用作载体以传输医药活性剂。
背景技术
[0002] 组织或器官沾粘是指异常连接到内部组织或器官表面的瘢痕组织带，一般来说，手术创伤是引起组织沾粘的最常见因素。术后组织沾粘可能导致严重的临床并发症，如慢性疼痛、缺血、肠阻塞、器官功能障碍等，往往需要再次手术进行沾粘分离。而再次进行手术可能是致命，因其引入了许多危险因素，如麻醉不充分、出血过多、术后炎症等。因此，为了预防术后组织沾粘，在受损组织和相邻组织之间引入物理屏障以阻断组织沾粘的形成，已被广泛接受并用于临床。
[0003] 各种类型的天然或合成聚合物作为预防组织沾粘的物理组织屏障已被广泛探索，包括膜/片、液体和凝胶类型。薄膜/薄片型组织屏障可将受损组织与邻近组织物理隔离，从而预防组织沾粘。由羧甲基纤维素与透明质酸交联制备的 (Genzyme)和由氧化聚合物纤维素制备的 (Johnson&Johnson Medical)是用于预防组织沾粘的商业
化薄膜/片状材料。然而，膜/片型防沾粘材料在紧急手术状态下很难处理。此外，当应用部位在地理上复杂、微小、管状或处于任何难以触及的区域时，膜/片型组织屏障就不适合使用。使用薄膜/片状防沾粘材料的另一个缺点是在缝合过程中，它们可能导致对损伤部位的额外损害。
化薄膜/片状材料。然而，膜/片型防沾粘材料在紧急手术状态下很难处理。此外，当应用部位在地理上复杂、微小、管状或处于任何难以触及的区域时，膜/片型组织屏障就不适合使用。使用薄膜/片状防沾粘材料的另一个缺点是在缝合过程中，它们可能导致对损伤部位的额外损害。
[0004] 一些液体型防沾粘材料，例如：由32％葡聚糖溶液制备的 和由4％艾考糊精溶液制备的 已在市场上使用。液体类型的防沾粘剂很容易在手术后以灌注的方式应用于清洗整个伤口。然而，这些材料通常有一个缺点，即对应用部位的附着力不足。因此，它们不能呈现足够的预防沾粘效果。
[0005] 为了解决上述问题，人们开发了各种基于不同聚合物材料的凝胶型防沾粘剂。如：基于聚乳酸的Adcon‑L(Gliatech)、基于透明质酸的 (Lifecore Biomedical)、
基于天然聚合物的Adba(Amitie)、基于聚乙二醇的Spraygel(Confluent Surgical)和基于聚氧化乙烯‑聚氧化丙烯共聚物的Flowgel(Mediventures)等，都已被开发为商业化的凝胶型防沾粘剂。在所有凝胶型防沾粘材料中，温度敏感型水胶特别令人感兴趣，因为它们的预凝胶溶液可以通过聚合物溶液涂抹、注射或喷涂而直接施用于受损组织，随后即通过温度触发在原位固化为凝胶。此外，热敏感型水胶还具有封装医药活性剂的能力，如抗炎药物。
基于天然聚合物的Adba(Amitie)、基于聚乙二醇的Spraygel(Confluent Surgical)和基于聚氧化乙烯‑聚氧化丙烯共聚物的Flowgel(Mediventures)等，都已被开发为商业化的凝胶型防沾粘剂。在所有凝胶型防沾粘材料中，温度敏感型水胶特别令人感兴趣，因为它们的预凝胶溶液可以通过聚合物溶液涂抹、注射或喷涂而直接施用于受损组织，随后即通过温度触发在原位固化为凝胶。此外，热敏感型水胶还具有封装医药活性剂的能力，如抗炎药物。
[0006] 相比之下，凝胶型防沾粘材料比液体型更能够形成稳定的屏障，与膜/片型防沾粘剂相比，能够大大缩短操作时间。然而，凝胶型防沾粘材料通常在伤口愈合前就会因被人体快速溶解而出现早期吸收，最终导致防沾粘效果不佳。
[0007] U.S Pat.No.4,141,973B1公开了一种组合物，其中，透明质酸被用作预防组织沾粘的主要成分。然而，透明质酸在活体中可以被迅速降解，其半衰期很短，只有3天，这表明透明质酸是一种缺乏足够生存时间来防止组织沾粘的材料。这一缺点大大限制了单一使用透明质酸作为预防组织沾粘剂的功能。
[0008] 普朗尼克(Pluronic)或泊洛沙姆(Poloxamer)是一种三嵌段共聚物，通常具有A‑聚环氧乙烷‑B‑聚环氧丙烷‑A‑聚环氧乙烷(PEO‑PPO‑PEO)的结构，是一种典型的热敏感材料，因其可表现出热可逆的溶胶‑凝胶相转变行为，而被广泛作为一种防沾粘材料来研究。一般来说，普朗尼克在低温下以溶液状态存在，但温度升高到一定程度后就会发生凝胶化(美国专利号4,188,373，美国专利号4,474,751，美国专利号4,478,822)。这样的溶胶‑凝胶相转变行为会受到包括成分、浓度、分子量、环境离子强度、pH值、添加剂等因素的影响。所以，普朗尼克的聚合物因其多功能的物理化学和生物相容性而极具发展吸引力。虽然普朗尼克表现出优秀的溶胶‑凝胶相转变行为，但其水合物结构在作于组织沾粘屏障时有许多缺点，如机械强度低、组织附着性差和不耐水侵蚀等。因此，普朗尼克有生存时间短的问题，因此在手术部位不足以有充分时间进行沾粘预防。此外，数十年来，普朗尼克作为载体在医药科学领域也被广泛研究，但其机械强度的不足和较差的水稳定性限制了其在载体上的应用。尽管近年来，人们已经做了许多尝试来提高以普朗尼克为主材料的抗组织沾粘和药物传输能力，但至今还没有发展出一种理想的以普朗尼克为主的抗组织沾粘和药物传输材料。
[0009] 美国专利第9,327,049B2号揭露了一种组合物，其中普朗尼克被用作主要成分以预防组织沾粘。此外，该组合物还具有抗菌和止血特性。该组合物包括泊洛沙姆188(F‑68)，泊洛沙姆407( F‑127)，几丁聚糖和明胶。尽管几丁聚糖具有抗菌和止血活性，并且在活体中的降解时间较长，但使用几丁聚糖作为防沾粘剂的成分，对几丁质过敏的病人会有危险，所以此组合物并不适用于这类病人。
[0010] 美国专利第9,895,446B2号揭露了一种用于化疗药物的肠道内递送的组合物。该组合物包括至少一种抗癌药物和一种或多种泊洛沙姆/普朗尼克化合物，包括泊洛沙姆188( F‑68)、泊洛沙姆407( F‑127)以及泊洛沙姆188和407的混合物。然而，尽管单一使用泊洛沙姆407或188或使用这两种泊洛沙姆的混合物作为药物载体，这些材料的机械强度皆不足以抵抗水的侵蚀，限制了它们在可持续药物释放系统中的应用。
[0011] 尽管目前以普朗尼克为主材料在用于预防组织沾粘及药物载体上皆有一定的进展，但仍需要更多的改进。普朗尼克作为热敏感型材料，如果能解决其结构上的一些缺陷，如：提高其机械强度、增加其组织附着能力和其防水性能，那么它就有很大的潜力成为理想的防沾粘剂和药物载体。尽管目前尚未开发出理想的以普朗尼克为主材料的防沾粘剂或载体，但至少其中的一些目标将通过下文所公开的发明来实现。
发明内容
[0012] 本发明的第一种态样在于提供一种具有下式(I)结构的聚合物，
[0013]
[0014] 其中：
[0015] POLY为聚(环氧乙烷)(PEO)‑聚(环氧丙烷)(PPO)‑聚(环氧乙烷)(PEO)的三嵌段共聚物；
[0016] m和n彼此独立地为0或1，其中m和n不能同时为0；以及
[0017] AA为氨基酸残基，其氨基直接与POLY的链端结合形成氨基甲酸酯(O—C(═O)—NH)键。
[0018] 在一具体例中，该三嵌段共聚物选自普朗尼克F‑127(PF127)，普朗尼克F‑68(PF68)及普朗尼克L‑35(PL35)。
[0019] 在另一具体例中，该氨基酸残基选自疏水性氨基酸，亲水性氨基酸，碱性氨基酸，酸性氨基酸及芳香族氨基酸。
[0020] 在一特定具体例中，该氨基酸残基可为白氨酸，甲硫氨酸，离氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，酪氨酸，丝氨酸和半胱氨酸之一。
[0021] 本发明的第二种态样在于提供一种组成物，其包含具有式(I)结构的聚合物中的任一种或其组合，以及医药上可接受的载体。
[0022] 在一具体例中，该组成物进一步包含医药活性剂。
[0023] 在一特定具体例中，该医药活性剂可为抗癌药，抗生素，止血剂，类固醇，非类固醇抗发炎剂，激素，止痛剂及麻醉剂。
[0024] 本发明的第三种态样在于提供一种聚合物或组成物用于制备预防术后组织沾粘和药物传输的药物的用途。
附图说明
[0025] 通过参考详细说明和权利要求书，当结合以下图式时，可以得出对该目标更完整的理解。以下各图式仅为说明所执行的实施例而提供，本发明的范围不应受到这些图式的限制。
[0026] 图1A显示由实施例1‑5制备的氨基酸改质的普朗尼克和比较例1中制备的未改质的普朗尼克的储存和损失模量。测量于20℃下进行，储存模量和损失模量分别以直线和点线显示。
[0027] 图1B显示由实施例1‑5制备的氨基酸改质的普朗尼克和比较例1中制备的未改质的普朗尼克的储存和损失模量。测量于37℃下进行，储存模量和损失模量分别以直线和点线显示。
[0028] 图2显示使用Hoffmann沾粘评分系统评估组织沾粘的结果。对照组和实验组之间的统计学差异通过使用Prism 7for Mac(GraphPad Software,USA)进行双尾计算的司徒顿t检定(Student’s t‑test)进行分析。p<0.05的值被认为其差异具有统计学意义，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001，NS代表无统计学意义的差异。
[0029] 图3A显示对照组的组织沾粘情况。
[0030] 图3B显示经比较例1处理后的组织沾粘情况。
[0031] 图3C显示经实施例1(1)处理后的组织沾粘情况。
[0032] 图3D显示经实施例2处理后的组织沾粘情况。
[0033] 图3E显示经比较例2处理后的组织沾粘情况。
[0034] 图4A显示由比较例1所制备的水胶的紫杉醇(PTX)释放曲线。
[0035] 图4B显示由实施例2所制备的水胶的紫杉醇(PTX)释放曲线。
[0036] 图4C显示由实施例5(2)所制备的水胶的紫杉醇(PTX)释放曲线。
具体实施方式
[0037] 在详细描述本发明的一个或多个实施例之前，必须指出，在本说明书和权利要求书中使用的单数形式“一”，“一个”及“该”，除非上下文明确规定，否则其包括复数对象。因此，例如，有关“一个氨基酸”包括一个的氨基酸以及两个或多个相同或不同的氨基酸，有关“聚合物的链端”包括一个的链端以及两个相同或不同的聚合物的链端等。
[0038] 在描述和请求本发明时，除非另有规定，本文使用的术语具有以下定义。
[0039] 于本文中，术语如“包括”、“包含”、“具有”，或任何其他变化旨在涵盖非排他性的囊括。例如，包括元素列表的部件、结构、物品或装置都不一定只限于这些元素，而是可以包括未明确列出，但为该部件、结构、物品或装置所固有的其他元素。
[0040] 术语“氨基酸”是指蛋白质的结构单元。由遗传密码所编码的20种氨基酸被称为“标准氨基酸”。这些氨基酸的结构是H2N‑CHR‑COOH，其中R是氨基酸特有的侧链。标准氨基酸有丙氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰氨、甘氨酸、组氨酸、异白氨酸、白氨酸、离氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。氨基酸可分为五类，具体而言，疏水性氨基酸、亲水性氨基酸、碱性氨基酸、酸性氨基酸和芳香族氨基酸。如本文所用，氨基酸可以以两种立体形式存在，即本文所述的“D型”和“L型”。
[0041] 本发明的氨基酸改质的聚合物和组成物可以在各种术后类型的任何情况下被施用以防止组织沾粘。如本文所用，术语"术后"是指本发明的氨基酸改质聚合物和组合物于具有使用价值的术后手术实例，包括但不限于腹部、腹盆腔、眼科、骨科、胃肠道、胸腔、颅部、头颈部、心血管、妇科、产科、关节(如关节镜)、泌尿科、整形、重建、肌肉骨骼和神经肌肉手术。
[0042] 根据本发明，可以有效预防术后组织沾粘。本发明中使用的防沾粘聚合物及其组成物可以为任何形式，如粉末、溶液或凝胶形式。因此，即使在相对局部的手术中，如内视镜手术，也易于执行。
[0043] 本发明中使用的抗沾粘聚合物及其组成物可以通过如涂抹或喷洒的方式直接施用于伤口部位，也可以施用于伤口部位周围器官或周围组织表面来应用于手术上。该应用可以一次性进行，也可以多次涂抹或喷洒到目标器官或周围组织表面的局部部分。此外，还可以使用涂抹或喷洒装置。该装置可以是一个预填充的注射器。剂量可以由所属领域的技术者适当选择或调整。
[0044] 术语“氨基酸改质聚合物”是指其链端通过氨基甲酸酯连接与氨基酸和/或聚氨基酸结合的聚合物，其中该聚合物可以是嵌段共聚物，可以包含两个或多个嵌段。此外，该共聚物可以是普朗尼克(Pluronic)，它是一种三嵌段聚合物，由聚环氧乙烷(PEO)‑聚环氧丙烷(PPO)‑聚环氧乙烷(PEO)组成。该氨基酸改质聚合物的结构由以下公式(I)表示：
[0045] 其中：POLY是聚环氧乙烷(PEO)‑聚环氧丙烷(PPO)‑聚环氧乙烷(PEO)的三嵌段共聚物；m和n彼此独立地为0或1，其中m和n不能同时为0；以及AA代表一种氨基酸或一种聚氨基酸残基，其氨基直接与POLY的链端结合，形成氨基甲酸酯键，其中AA的选择包含疏水性氨基酸、碱性氨基酸、酸性氨基酸、芳香族氨基酸和亲水性氨基酸。其中，疏水性氨基酸包括疏水性氨基酸和/或疏水性聚氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、白氨酸、异白氨酸、脯氨酸及其聚合物；碱性氨基酸包括碱性氨基酸和/或碱性聚氨基酸，例如离氨酸、组氨酸、精氨酸和其聚合物。酸性氨基酸包括酸性氨基酸和/或酸性聚氨基酸，例如天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸及其聚合物；芳香族氨基酸包括芳香族氨基酸和/或芳香族聚氨基酸，例如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸及其聚合物；亲水性氨基酸包括亲水性氨基酸和/或亲水性聚氨基酸，例如丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸及其聚合物。
[0046] 术语“氨基酸改质聚合物组成物”是指包含具有结构式(I)的聚合物中的任何一种或其组合。
[0047] 术语“以一定量”是指本发明中基于最终组成物的任何一种聚合物或其组合的重量。本发明中，聚合物或其组合的量可以是最终组成物重量的5％至30％，7％至25％，较佳为10％至20％，12％至18％，更佳为13％至17％。
[0048] 术语“聚合物组合”是指将两种或两种以上的不同氨基酸改质的聚合物混合的组合。于本文，基于两种氨基酸改质聚合物的组合，其组合中的每种聚合物可以包含依99:1至1:99、90:10至10:90、80:20至20:80、70:30至30:70、60:40至40:60或90:10至50:50的重量比，例如：组合中的每种聚合物可以包含95:5至30:70、80:20至40:60或70:30至50:50的重量比。
[0049] 术语“化学活化的共聚物溶液”是指由聚环氧乙烷(PEO)‑聚环氧丙烷(PPO)‑聚环氧乙烷(PEO)组成的共聚物被溶解到含有催化剂的溶剂中，在共聚物的链端产生活性碳酸酯，其允许与氨基酸进一步反应，形成聚合氨基酸衍生物。
[0050] 术语“生物相容性”是指在所使用的数量和位置上对接受者的细胞基本上无毒、无免疫原性和无刺激性的材料，并且在所使用的位置上也不会引起或导致对接受者身体的重大危害或不良影响。
[0051] 术语“抗沾粘”是指施用可用于防止相邻组织或器官表面粘连在一起的组合物，以使粘连的范围(例如面积)、粘连的强度和/或沾粘的严重程度(例如厚度或对机械或化学破坏的抵抗力)相对于没有施用此类物质而发生的粘连的范围、强度和/或严重程度达到有效的降低。
[0052] 术语“防沾粘剂”、“抗沾粘剂”及“沾粘抑制剂”是指施用或应用一种用于抑制相邻组织或器官表面粘附在一起的组合物。
[0053] 术语“载体”是指能够装载、传递及释放医药活性剂的携带物质。
[0054] 术语“载体应用”是指需要载体来传递和释放药物活性制剂的应用。
[0055] 术语“氨基甲酸酯连接”是指氨基酸的氨基与聚合物链端碳酸酯之间的氨基甲酸酯结合。这种氨基甲酸酯连接的化学结构表示为以下公式(II):
[0056]
[0057] 术语“医药活性剂”是指任何可对人体或动物身体产生某些治疗、预防和/或诊断作用的医药有用物质。在此，医药活性剂的选择可包含抗癌药、抗生素、止血剂、类固醇、非类固醇抗发炎剂、荷尔蒙、止痛剂和麻醉剂。优选为抗癌药物紫杉醇。
[0058] 本发明中使用的术语“医药上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组成物或载体，如液体或固体填充物、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料。每种载体必须是“可接受的”，即与制剂中的其他成分相容，且不会对病人造成危害。
[0059] 在本发明中，包括氨基酸改质聚合物和聚合物组成物可以水凝胶型式存在，并且可具备温度敏感性。因此，该聚合物和组成物的型态可于温度变化时在溶胶和凝胶状态之间可逆地变化，且溶胶‑凝胶相变(凝胶化)的温度可通过调整聚合物的含量来控制。该聚合物及/和聚合物组成物在室温下可呈现溶胶状态，但当温度略低于人体温度时，本文所指28℃至34℃之间，则转变为凝胶状态。因此它们可以注射或喷入方式施用于人体或动物体内的手术部位，进而提供足够的伤口覆盖。当其被施用到手术部位后，该聚合物及/和聚合物组成物随后可发生凝胶化，并粘附在伤口上，作为防止组织沾粘的屏障。
[0060] 本发明中的氨基酸改质的聚合物及聚合物组成物可允许热敏感性溶胶‑凝胶状态可逆转变，这使它们能够被用为载体，对许多医药活性制剂进行经皮、注射、喷雾以及可控制性递送。
[0061] 在本发明中，单纯的普朗尼克(Pluronic)为未经改质的比较样品，被作为实施例中的比较例，而用的评估本发明由氨基酸改质的普朗尼克(Pluronic)与其组成物，所改善的抗组织沾粘能力及药物释放功效。经由广泛研究的结果，本申请的发明人发现，本发明的氨基酸改质的普朗尼克与其组成物可以(1)提高聚合物结构的机械强度、(2)增加聚合物的流动性，使其具备更多的生物医学应用上的可用性、(3)提高抗水侵蚀能力、(4)提高聚合物与组织之间的附着性、(5)提高预防组织沾粘的能力，(6)增加医药活性剂的装载能力，以及(7)改善传输医药活性剂时的释放曲线。
[0062] 本发明使用本领域技术人员已知的有机合成、生物化学、流变学等常规技术进行。
[0063] 以下，本发明将以参照实施例方式进行更详细的描述。然而，以下每个实施例仅用于说明所执行的实施方案，且本发明的范围不受这些实施例的限制。
[0064] 本发明中，用于执行实施例和比较例的化学品如下：
[0065] 普朗尼克‑F127(Mw:12,500Da)、普朗尼克‑F‑68(Mw:8,400Da)和普朗尼克‑L‑35(Mw:1,900Da)购于巴斯夫公司。无水四氢呋喃(以下简称"THF")、4‑二甲基氨基吡啶(以下简称"DMAP")和无水二甲亚砜(以下简称"无水DMSO")均购于Acrose公司。N,N'‑二琥珀酰亚氨基碳酸酯(以下简称"DSC")，和紫杉醇(以下简称"PTX")可从Fluorochem购买。L‑天冬氨酸、L‑天冬酰胺、L‑离氨酸、L‑丝氨酸和L‑酪氨酸购于Acrose。L‑白氨酸、L‑半胱氨酸和L‑甲硫氨酸购于CJ海德(宁波)生物技术有限公司。
[0066] 实施例1
[0067] 制备疏水性氨基酸改质的普朗尼克(Pluronic)
[0068] (1)白氨酸改质的普朗尼克F‑127
[0069] 首先将疏水性氨基酸，4.8摩尔L‑白氨酸溶解在碱性溶液中，形成氨基酸溶液。随后，于氮气保护下将0.6摩尔的普朗尼克F‑127和4.8摩尔的DMAP溶解在30毫升无水THF中，得到透明的混合溶液，并持续搅拌。经30分钟后，于1小时内滴加10毫升含有4.8摩尔DSC的无水DMSO，并在室温及氮气保护下持续搅拌24小时。24小时后，加入含有白氨酸的溶液，并将该混合物保持搅拌24小时。所得的白氨酸改质的普朗尼克F‑127溶液通过透析纯化，并经1
冷冻干燥得到产率约45％的白色聚合物粉末。H NMR(600MHz,D2O)：δ4.30,4.21(m,‑CH2‑O‑(C＝O)‑NH‑),4.01(m,‑O‑(C＝O)‑NH‑CH‑),1.70(m,‑CH2‑CH‑(CH3)2),1.60(m,‑CH‑(CH3)2),‑1 ‑1 ‑1
0.96(m,‑CH‑(CH3)2)；FTIR：780cm (—NH wag),1531cm (—CNH),1569cm (—(C═O)—‑1
NH—),1731cm (—(C═O))。
冷冻干燥得到产率约45％的白色聚合物粉末。H NMR(600MHz,D2O)：δ4.30,4.21(m,‑CH2‑O‑(C＝O)‑NH‑),4.01(m,‑O‑(C＝O)‑NH‑CH‑),1.70(m,‑CH2‑CH‑(CH3)2),1.60(m,‑CH‑(CH3)2),‑1 ‑1 ‑1
0.96(m,‑CH‑(CH3)2)；FTIR：780cm (—NH wag),1531cm (—CNH),1569cm (—(C═O)—‑1
NH—),1731cm (—(C═O))。
[0070] 白氨酸改质的普朗尼克F‑127的化学结构示例如下：
[0071]
[0072] (2)白氨酸改质的普朗尼克F‑68
[0073] 首先将疏水性氨基酸，4.8摩尔L‑白氨酸溶解在碱性溶液中，形成氨基酸溶液。随后，于氮气保护下将0.6摩尔的普朗尼克F‑68和4.8摩尔的DMAP溶解在30毫升无水THF中，得到透明的混合溶液，并持续搅拌。经30分钟后，于1小时内滴加10毫升含有4.8摩尔DSC的无水DMSO，并在室温及氮气保护下持续搅拌24小时。24小时后，加入含有白氨酸的溶液，并将该混合物保持搅拌24小时。所得的白氨酸改质的普朗尼克F‑68溶液通过透析纯化，并经冷1
冻干燥得到产率约40％的白色聚合物粉末。H NMR(600MHz,D2O)：δ4.28,4.23(m,‑CH2‑O‑(C＝O)‑NH‑),4.06(m,‑O‑(C＝O)‑NH‑CH‑),1.72(m,‑CH2‑CH‑(CH3)2),1.62(m,‑CH‑(CH3)2),‑1 ‑1 ‑1
0.97(m,‑CH‑(CH3)2)；FTIR：780cm (—NH wag),1531cm (—CNH),1569cm (—(C═O)—‑1
NH—),1731cm (—(C═O))。
冻干燥得到产率约40％的白色聚合物粉末。H NMR(600MHz,D2O)：δ4.28,4.23(m,‑CH2‑O‑(C＝O)‑NH‑),4.06(m,‑O‑(C＝O)‑NH‑CH‑),1.72(m,‑CH2‑CH‑(CH3)2),1.62(m,‑CH‑(CH3)2),‑1 ‑1 ‑1
0.97(m,‑CH‑(CH3)2)；FTIR：780cm (—NH wag),1531cm (—CNH),1569cm (—(C═O)—‑1
NH—),1731cm (—(C═O))。
[0074] 白氨酸改质的普朗尼克F‑68的化学结构示例如下：
[0075]
[0076] (3)白氨酸改质的普朗尼克L‑35
[0077] 首先将疏水性氨基酸，4.8摩尔L‑白氨酸溶解在碱性溶液中，形成氨基酸溶液。随后，于氮气保护下将0.6摩尔的普朗尼克F‑35和4.8摩尔的DMAP溶解在30毫升无水THF中，得到透明的混合溶液，并持续搅拌。经30分钟后，于1小时内滴加10毫升含有4.8摩尔DSC的无水DMSO，并在室温及氮气保护下持续搅拌24小时。24小时后，加入含有白氨酸的溶液，并将该混合物保持搅拌24小时。所得的白氨酸改质的普朗尼克L‑35溶液通过透析纯化，并经冷1
冻干燥得到产率约35％的透明聚合物。H NMR(600MHz,D2O)：δ4.30(m,‑O‑(C＝O)‑NH‑CH‑),
4.22(m,‑CH2‑O‑(C＝O)‑NH‑),1.70(m,‑CH2‑CH‑(CH3)2),1.61(m,‑CH‑(CH3)2),0.97(m,‑CH‑‑1 ‑1 ‑1 ‑1
(CH3)2)；FTIR：780cm (—NH wag),1531cm (—CNH),1569cm (—(C═O)—NH—),1731cm(—(C═O))。
冻干燥得到产率约35％的透明聚合物。H NMR(600MHz,D2O)：δ4.30(m,‑O‑(C＝O)‑NH‑CH‑),
4.22(m,‑CH2‑O‑(C＝O)‑NH‑),1.70(m,‑CH2‑CH‑(CH3)2),1.61(m,‑CH‑(CH3)2),0.97(m,‑CH‑‑1 ‑1 ‑1 ‑1
(CH3)2)；FTIR：780cm (—NH wag),1531cm (—CNH),1569cm (—(C═O)—NH—),1731cm(—(C═O))。
[0078] 白氨酸改质的普朗尼克L‑35的化学结构示例如下：
[0079]
[0080] (4)甲硫氨酸改质的普朗尼克F‑127
[0081] 首先将疏水性氨基酸，4.8摩尔L‑甲硫氨酸溶解在碱性溶液中，形成氨基酸溶液。随后，于氮气保护下将0.6摩尔的普朗尼克F‑127和4.8摩尔的DMAP溶解在30毫升无水THF中，得到透明的混合溶液，并持续搅拌。经30分钟后，于1小时内滴加10毫升含有4.8摩尔DSC的无水DMSO，并在室温及氮气保护下持续搅拌24小时。24小时后，加入含有甲硫氨酸的溶液，并将该混合物保持搅拌24小时。所得的甲硫氨酸改质的普朗尼克F‑127溶液通过透析纯
1
化，并经冷冻干燥得到产率约45％的白色聚合物粉末。H NMR(600MHz,D2O)：δ4.30(m,‑O‑(C＝O)‑NH‑CH‑),4.23(m,‑CH2‑O‑(C＝O)‑NH‑),2.61(m,‑CH2‑CH2‑S‑CH3),2.16(s,‑S‑CH3),‑1 ‑1
2.13,1.96(m,‑CH2‑CH2‑S‑CH3)；FTIR：1215cm (—CNH),1603cm (—(C═O)—NH—),‑1
1733cm (—(C═O))。
1
化，并经冷冻干燥得到产率约45％的白色聚合物粉末。H NMR(600MHz,D2O)：δ4.30(m,‑O‑(C＝O)‑NH‑CH‑),4.23(m,‑CH2‑O‑(C＝O)‑NH‑),2.61(m,‑CH2‑CH2‑S‑CH3),2.16(s,‑S‑CH3),‑1 ‑1
2.13,1.96(m,‑CH2‑CH2‑S‑CH3)；FTIR：1215cm (—CNH),1603cm (—(C═O)—NH—),‑1
1733cm (—(C═O))。
[0082] 实施例2
[0083] 制备碱性氨基酸改质的普朗尼克(Pluronic)
[0084] 离氨酸改质的普朗尼克F‑127
[0085] 首先将碱性氨基酸，2.4摩尔L‑离氨酸溶解在蒸馏水中，形成氨基酸溶液。随后，于氮气保护下将0.6摩尔的普朗尼克F‑127和4.8摩尔的DMAP溶解在30毫升无水THF中，得到透明的混合溶液，并持续搅拌。经30分钟后，于1小时内滴加10毫升含有4.8摩尔DSC的无水DMSO，并在室温及氮气保护下持续搅拌24小时。24小时后，加入含有离氨酸的溶液，并将该混合物保持搅拌24小时。所得的离氨酸改质的普朗尼克F‑127溶液通过透析纯化，并经冷冻1
干燥得到产率约45％的白色聚合物粉末。H NMR(600MHz,D2O)：δ4.25(m,‑CH2‑O‑(C＝O)‑NH‑),3.16(m,‑O‑(C＝O)‑NH‑CH2‑),1.81,1.70(m,NH‑CH2‑CH2‑CH2‑CH2),1.57(m,NH‑CH2‑‑1 ‑1
CH2‑CH2‑CH2‑),1.41(m,NH‑CH2‑CH2‑CH2‑CH2‑,2H)；FTIR：776cm (—NH wag),1557cm (—‑1
CNH),1710cm (—(C═O))。
干燥得到产率约45％的白色聚合物粉末。H NMR(600MHz,D2O)：δ4.25(m,‑CH2‑O‑(C＝O)‑NH‑),3.16(m,‑O‑(C＝O)‑NH‑CH2‑),1.81,1.70(m,NH‑CH2‑CH2‑CH2‑CH2),1.57(m,NH‑CH2‑‑1 ‑1
CH2‑CH2‑CH2‑),1.41(m,NH‑CH2‑CH2‑CH2‑CH2‑,2H)；FTIR：776cm (—NH wag),1557cm (—‑1
CNH),1710cm (—(C═O))。
[0086] 实施例3
[0087] 制备酸性氨基酸改质的普朗尼克(Pluronic)
[0088] (1)天冬氨酸改质的普朗尼克F‑127
[0089] 首先将酸性氨基酸，4.8摩尔L‑天冬氨酸溶解在碱性溶液中，形成氨基酸溶液。随后，于氮气保护下将0.6摩尔的普朗尼克F‑127和4.8摩尔的DMAP溶解在30毫升无水THF中，得到透明的混合溶液，并持续搅拌。经30分钟后，于1小时内滴加10毫升含有4.8摩尔DSC的无水DMSO，并在室温及氮气保护下持续搅拌24小时。24小时后，加入含有天冬氨酸的溶液，并将该混合物保持搅拌24小时。所得的天冬氨酸改质的普朗尼克F‑127溶液通过透析纯化，1
并经冷冻干燥得到产率约45％的白色聚合物粉末。H NMR(600MHz,D2O)：δ4.38(m,‑O‑(C＝‑1
O)‑NH‑CH‑),4.26(m,‑CH2‑O‑(C＝O)‑NH‑),2.70,2.51(m,‑CH2‑(C＝O)‑OH)；FTIR：776cm‑1 ‑1
(—NH wag),1557cm (—CNH),1710cm (—(C═O))。
并经冷冻干燥得到产率约45％的白色聚合物粉末。H NMR(600MHz,D2O)：δ4.38(m,‑O‑(C＝‑1
O)‑NH‑CH‑),4.26(m,‑CH2‑O‑(C＝O)‑NH‑),2.70,2.51(m,‑CH2‑(C＝O)‑OH)；FTIR：776cm‑1 ‑1
(—NH wag),1557cm (—CNH),1710cm (—(C═O))。
[0090] (2)天冬酰胺改质的普朗尼克F‑127
[0091] 首先将酸性氨基酸，2.4摩尔L‑天冬酰胺溶解在碱性溶液中，形成氨基酸溶液。随后，于氮气保护下将0.6摩尔的普朗尼克F‑127和4.8摩尔的DMAP溶解在30毫升无水THF中，得到透明的混合溶液，并持续搅拌。经30分钟后，于1小时内滴加10毫升含有4.8摩尔DSC的无水DMSO，并在室温及氮气保护下持续搅拌24小时。24小时后，加入含有天冬酰胺的溶液，并将该混合物保持搅拌24小时。所得的天冬酰胺改质的普朗尼克F‑127溶液通过透析纯化，1
并经冷冻干燥得到产率约45％的白色聚合物粉末。H NMR(600MHz,D2O)：δ4.35(m,‑O‑(C＝‑1
O)‑NH‑CH‑),4.27(m,‑CH2‑O‑(C＝O)‑NH‑),2.82,2.68(m,‑CH2‑(C＝O)‑NH2)；FTIR：1416cm‑1 ‑1
(—CN),1680cm (—(C═O)—NH—),1720cm (—(C═O))。
并经冷冻干燥得到产率约45％的白色聚合物粉末。H NMR(600MHz,D2O)：δ4.35(m,‑O‑(C＝‑1
O)‑NH‑CH‑),4.27(m,‑CH2‑O‑(C＝O)‑NH‑),2.82,2.68(m,‑CH2‑(C＝O)‑NH2)；FTIR：1416cm‑1 ‑1
(—CN),1680cm (—(C═O)—NH—),1720cm (—(C═O))。
[0092] 实施例4
[0093] 制备芳香族类氨基酸改质的普朗尼克(Pluronic)
[0094] 酪氨酸改质的普朗尼克F‑127
[0095] 首先将芳香族氨基酸，4.8摩尔L‑酪氨酸溶解在碱性溶液中，形成氨基酸溶液。随后，于氮气保护下将0.6摩尔的普朗尼克F‑127和4.8摩尔的DMAP溶解在30毫升无水THF中，得到透明的混合溶液，并持续搅拌。经30分钟后，于1小时内滴加10毫升含有4.8摩尔DSC的无水DMSO，并在室温及氮气保护下持续搅拌24小时。24小时后，加入含有酪氨酸的溶液，并将该混合物保持搅拌24小时。所得的酪氨酸改质的普朗尼克F‑127溶液通过透析纯化，并经1 2 6
冷冻干燥得到产率约40％的白色聚合物粉末。H NMR(600MHz,D2O)：δ7.20(d,CH,CH–
3 5
phenyl ring),.6.89(d,CH,CH–phenyl ring),4.21(m,‑CH2‑O‑(C＝O)‑NH‑),4.11(m,‑O‑‑1 ‑1
(C＝O)‑NH‑CH‑),3.15,2.83(m,‑CH2‑ph)；FTIR：1403cm (—CN),1517cm (—CNH),1604cm‑1 ‑1
(—C—C—/C═C),1710cm (—(C═O))。
冷冻干燥得到产率约40％的白色聚合物粉末。H NMR(600MHz,D2O)：δ7.20(d,CH,CH–
3 5
phenyl ring),.6.89(d,CH,CH–phenyl ring),4.21(m,‑CH2‑O‑(C＝O)‑NH‑),4.11(m,‑O‑‑1 ‑1
(C＝O)‑NH‑CH‑),3.15,2.83(m,‑CH2‑ph)；FTIR：1403cm (—CN),1517cm (—CNH),1604cm‑1 ‑1
(—C—C—/C═C),1710cm (—(C═O))。
[0096] 实施例5
[0097] 制备亲水性氨基酸改质的普朗尼克(Pluronic)
[0098] (1)丝氨酸改质的普朗尼克F‑127
[0099] 首先将亲水性氨基酸，4.8摩尔L‑丝氨酸溶解在蒸馏水中，形成氨基酸溶液。随后，于氮气保护下将0.6摩尔的普朗尼克F‑127和4.8摩尔的DMAP溶解在30毫升无水THF中，得到透明的混合溶液，并持续搅拌。经30分钟后，于1小时内滴加10毫升含有4.8摩尔DSC的无水DMSO，并在室温及氮气保护下持续搅拌24小时。24小时后，加入含有丝氨酸的溶液，并将该混合物保持搅拌24小时。所得的丝氨酸改质的普朗尼克F‑127溶液通过透析纯化，并经冷冻1
干燥得到产率约40％的白色聚合物粉末。H NMR(600MHz,D2O)：δ4.30(m,‑CH2‑O‑(C＝O)‑‑1 ‑1
NH‑),4.16(m,‑O‑(C＝O)‑NH‑CH‑),3.93,3.83(m,‑CH2‑OH)；FTIR：1410cm (—CN),1604cm‑1
(—(C═O)—NH—),1720cm (—(C═O))。
干燥得到产率约40％的白色聚合物粉末。H NMR(600MHz,D2O)：δ4.30(m,‑CH2‑O‑(C＝O)‑‑1 ‑1
NH‑),4.16(m,‑O‑(C＝O)‑NH‑CH‑),3.93,3.83(m,‑CH2‑OH)；FTIR：1410cm (—CN),1604cm‑1
(—(C═O)—NH—),1720cm (—(C═O))。
[0100] (2)半胱氨酸改质的普朗尼克F‑127
[0101] 首先将亲水性氨基酸，4.8摩尔L‑半胱氨酸溶解在蒸馏水中，形成氨基酸溶液。随后，于氮气保护下将0.6摩尔的普朗尼克F‑127和4.8摩尔的DMAP溶解在30毫升无水THF中，得到透明的混合溶液，并持续搅拌。经30分钟后，于1小时内滴加10毫升含有4.8摩尔DSC的无水DMSO，并在室温及氮气保护下持续搅拌24小时。24小时后，加入含有半胱氨酸的溶液，并将该混合物保持搅拌24小时。所得的半胱氨酸改质的普朗尼克F‑127溶液通过透析纯化，1
并经冷冻干燥得到产率约50％的白色聚合物粉末。H NMR(600MHz,D2O)：δ4.46(m,‑O‑(C＝‑1
O)‑NH‑CH‑),4.27(m,‑CH2‑O‑(C＝O)‑NH‑),3.20,2.98(m,‑CH2‑SH)；FTIR：1412cm (—CN),‑1 ‑1 ‑1
1515cm (—CNH),1604cm (—(C═O)—NH—),1700cm (—(C═O))。
并经冷冻干燥得到产率约50％的白色聚合物粉末。H NMR(600MHz,D2O)：δ4.46(m,‑O‑(C＝‑1
O)‑NH‑CH‑),4.27(m,‑CH2‑O‑(C＝O)‑NH‑),3.20,2.98(m,‑CH2‑SH)；FTIR：1412cm (—CN),‑1 ‑1 ‑1
1515cm (—CNH),1604cm (—(C═O)—NH—),1700cm (—(C═O))。
[0102] 实验例1
[0103] 氨基酸改质的聚合物流变学分析
[0104] (1)制备氨基酸改质的聚合物水胶
[0105] 将实施例1‑5中制备的每种氨基酸改质的普朗尼克F‑127溶解在一定量的蒸馏水中，得到最终浓度为15％(重量/体积)的聚合物水胶。
[0106] (2)比较例1的制备
[0107] 将一定量的未改质的普朗尼克F‑127，与一定量的蒸馏水一起加入，形成最终浓度为15％(重量/体积)的聚合物水胶。
[0108] (3)流变学特征分析
[0109] 使用配备了锥板结构和防溶剂蒸发金属盖的HR10流变仪(TAInstruments)，对实施例1‑5制备的水胶及比较例1的未改质对应物的粘度、溶胶‑凝胶相变转移温度以及粘弹‑1性质进行特征化分析。粘度的测量是于1.0s 的剪切率及2℃/min的升温速率下进行。溶胶‑凝胶相变转移温度被定义为当材料的储存模量和损失模量呈现相互交叉的一个特定的温度。于本发明中，此温度可通过振荡模式在20℃至37℃的温度范围内测量，其中升温速率为
2℃/min，扭矩值为100μN.m，固定频率为1Hz。粘弹性质的测量是分别在20℃和37℃下，通过
1％的应变进行扫频测量。粘度和溶胶‑凝胶相转变温度的量测结果分别在表1A和1B中列出，粘弹性质的量测结果显示于图1A和1B。
2℃/min，扭矩值为100μN.m，固定频率为1Hz。粘弹性质的测量是分别在20℃和37℃下，通过
1％的应变进行扫频测量。粘度和溶胶‑凝胶相转变温度的量测结果分别在表1A和1B中列出，粘弹性质的量测结果显示于图1A和1B。
[0110] 如表1A所示，由实施例2和5(2)制备的水胶在25℃和37℃下的粘度都远高于比较例1，表明离氨酸和半胱氨酸改质的聚合物，其聚合物链处于更加复杂的缠结状态，其中离氨酸和半胱氨酸残基可能有助于在聚合物、氨基酸残基及水之间的产生强大的相互作用，导致聚合物的机械强度提高。这些结果提供了有力的证据，证明普朗尼克F‑127结构的机械强度可以通过一些氨基酸的改质而大幅增强。由实施例4制备的水胶，于25℃和37℃的粘度都明显低于比较例1，这表明带有芳香族基团的氨基酸可能会阻碍改质后聚合物的分子链缠结，并最终导致聚合物流动性的增加，这可能提供其它可用性，如喷涂。对于由其它实施例制备的水凝胶，如表1A所示，它们都表现出高于比较例1的粘度，即使它们的粘度增加不如实施例2和5(2)制备的水胶显著，但这些实施例仍然提供了一个启示，即当在普朗尼克的链端引入一个或一些氨基酸时，普朗尼克F‑127的机械强度可以得到改善。
[0111] 表1B显示了由实施例1‑5制备的水胶的溶胶‑凝胶相转变温度。如表B所示，首先，证实了所有制备的水胶都具备温度敏感性，尽管它们都经过不同类型的氨基酸改质。其次，由实施例1‑5所制备的水胶皆呈现出高于比较例1的溶胶‑凝胶相转变温度。值得注意的是，由实施例2和5(2)制备的水胶表现出明显高于比较例1的溶胶‑凝胶转变温度，表示水胶和水之间形成了更多的氢键或其他相互作用，其中氢键或其它相互作用的形成，应归因于聚合物链中离氨酸的氨基或半胱氨酸的硫醇基的作用，故这类氨基酸改质水胶的疏水链可能需要更高温度才能聚集以形成类固体凝胶。
[0112] 为了更好的评估材料的机械性能，使用流变仪研究了由实施例1‑5和比较例1制备的水胶的粘弹性质。如图1A所示，在20℃时，观察到由实施例1‑5制备的所有水胶的损失模量(G")值皆大于储存模量(G')值，表明所有制备的水胶在室温下皆表现出类似溶胶的特性，这使得这些水胶可用于更多样化的应用。如图1B所示，在37℃时，观察到由实施例1‑5制备的所有水胶的储存模量(G')值皆大于损失模量(G")值，表示这些水胶都表现出类胶状特性。此外，由实施例2和5(2)所制备的水胶表现出远大于其损失模量(G")值的储存模量(G')值，表明这些水胶呈现出优异的机械强度。此外，除了由实施例3(2)和4所制备的水胶外，其它实施例所制备的水胶都表现出大于比较例1的储存模量(G')值，表明得到了更好的机械性能。值得注意的是，由实施例2、5(2)和比较例1制备的水胶相比较，即，离氨酸和半胱氨酸改质的普朗尼克水胶与未改质的普朗尼克水胶相比，前二者呈现出远大于比较例1的储存模量(G')，表明当未改质的普朗尼克水胶经一种或一些氨基酸改质后，可以获得机械性能上的增强。需要注意的是，尽管由实施例3制备的水胶与比较例1相比，其储存模量(G')值变化不大，但由于其粘度明显高于比较例1，因此它们仍可能具有不同的机械强度。不意外地，由实施例4制备的水胶表现出明显小于比较例1的储存模量(G')值，表明该水凝胶的机械强度可能弱于比较例1。所有制备的水胶的粘弹性结果与粘度测量得到的结果基本一致。
[0113] 表1A
[0114]
[0115] 表1B
[0116]
[0117] 实验例2
[0118] 体外聚合物生存时间的测量
[0119] (1)制备氨基酸改质的聚合物水胶
[0120] 将实施例1‑5中制备的每种氨基酸改质的普朗尼克F‑127溶解在一定量的蒸馏水中，得到最终浓度为15％(重量/体积)的聚合物水胶。
[0121] (2)比较例1的制备
[0122] 将一定量的未改质的普朗尼克F‑127，与一定量的蒸馏水一起加入，形成最终浓度为15％(重量/体积)的聚合物水胶。
[0123] (3)留存时间的测量
[0124] 本发明中，用于测量所制备的聚合物水胶的生存时间的方法是参照美国专利，专利案号为10,105,387B2号。
[0125] 简而言之，由实施例1‑5及比较例1所制备的各聚合物水胶中，取1毫升添加到7毫升的单独玻璃小瓶中。然后，将所有的小瓶放在37℃的培养箱中，以获得固体聚合物水胶。当所有小瓶中的水胶皆转变为胶态固体后，向其中加入1毫升磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH7.4)后，并储存于37℃的培养箱中。每天于固定的时间去除所制备的聚合物凝胶表面层上的磷酸盐缓冲溶液，并观察聚合物凝胶于玻璃小瓶中的剩余体积以估计聚合物的生存时间，结果见表2。
[0126] 如表2所示，由实施例1至5制备的水胶的凝胶生存时间都长于比较例1，生存时间范围为4到18天。值得注意的是，由实施例2和5(2)制备的水胶显示出明显优越的凝胶生存时间，分别为16天和18天。比较例1没有经过任何改质，显示出最短的凝胶生存时间，约2天。这些结果表明，经过氨基酸改质的普朗尼克水胶可能增加了聚合物链中及链间的氢键以及聚合物链与周围水之间的氢键，进而提高了水凝胶的抗水侵蚀能力。此外，离氨酸和半胱氨酸改质的普朗尼克水胶，提供了额外的证据证明经改质后的普朗尼克能提高抗水侵蚀能力，因为它们的氨和硫醇基团倾向于形成氢键，甚至形成双硫键(通过硫醇基团)，致使凝胶抗水侵蚀的稳定性大大增强。结论是本发明提供了一种氨基酸改质的普朗尼克化合物，与未改质的普朗尼克相比，其凝胶生存时间显著延长。
[0127] 值得注意的是，如前所述，粘度和储存模量的增加可以被认为是对所制备的水胶的机械强度的改进；与此相反，相较于比较例1的水胶，由实施例4制备的水凝胶显示出相对低的粘度和较弱的机械强度，但其仍能表现出长于比较例1的凝胶生存时间。这可能是基于酪氨酸的固有特性，因为它是一种疏水氨基酸，对水有天然的排斥性，这可能有助于酪氨酸改质的普朗尼克水胶抵抗水的侵蚀，从而增加凝胶生存时间。
[0128] 表2
[0129]
[0130]
[0131] 实验例3
[0132] 体外粘膜粘性测量
[0133] (1)氨基酸改质的聚合物溶液的制备
[0134] 将由实施例1‑5所制备的每种氨基酸改质的普朗尼克F‑127，溶解在一定量的超纯水中，形成最终浓度为15％(重量/体积)的聚合物溶液。并将每种聚合物溶液保持低温备用。
[0135] (2)比较例1的制备
[0136] 将一定量的普朗尼克F127，与一定量的超纯水一起加入，形成最终浓度为15％(重量/体积)的聚合物溶液。并将此聚合物溶液保持低温备用。
[0137] (3)制备粘蛋白溶液
[0138] 将粘蛋白粉溶于超纯水中以获得5％(重量/体积)粘蛋白溶液。详细地说，于4℃的冷水浴中，在温和的磁力搅拌(200rpm)下，将一定量的粘蛋白缓慢加入到100ml超纯水中。制备结束后，将粘蛋白溶液储存于4℃备用。
[0139] (4)制备包含聚合物及粘蛋白(聚合物‑粘蛋白)的混合物
[0140] 将未经改质的普朗尼克聚合物粉末及由实施例1‑5所制备的各个氨基酸改质普朗尼克聚合物的粉末，分别与(3)中所制备好的5％(重量/体积)粘蛋白溶液混合，得到15％(重量/体积)聚合物‑粘蛋白混合物。
[0141] (5)体外粘膜粘性测定
[0142] 本发明应用了流变学方法(Hassan,EE,et al.,A Simple Rheological Methodfor the in Vitro Assessment of Mucin‑Polymer Bioadhesive Bond Strength,Pharm Res 7,491‑495,1990)达成水胶粘附性的预测和间接评量。使用HR10流变仪(TA Instruments)评估由实施例1‑5所制备的氨基酸改质的普朗尼克聚合物溶液、比较例1的未改质对应物溶液、制备的粘蛋白溶液以及聚合物和粘蛋白的混合物溶液的粘附性质，该流‑1
变仪配有锥板和防止溶剂蒸发的保护性金属盖。流变分析采用流动模式，在37℃下以10s的剪切率进行，每次分析前都要在室温下静置5分钟，以避免热冲击引起的结构改变。
变仪配有锥板和防止溶剂蒸发的保护性金属盖。流变分析采用流动模式，在37℃下以10s的剪切率进行，每次分析前都要在室温下静置5分钟，以避免热冲击引起的结构改变。
[0143] 本实验乃基于对由氨基酸改质的聚合物和粘蛋白溶液的混合物中获得的分散体的测量粘度的评估。聚合物和粘蛋白之间的相互作用程度是计算混合物的最终粘度(ηfinal)的量测结果，它代表了这些成分之间既定的相互作用的参数，可以通过以下公式计算：
[0144] ηfinalηmixture(ηpolymercompositionηmiucin
[0145] 其中，
[0146] ηmixture为由氨基酸改质的聚合物和粘蛋白所组成的混合物的粘度，
[0147] ηpolymer composition为由氨基酸改质的聚合物的粘度，
[0148] ηmucin为粘蛋白的粘度，
[0149] 当由氨基酸改质的聚合物和粘蛋白之间存有相互作用的情况下，ηfinal的值>0(Mayol L.,et al.,A Novel Poloxamers/Hyaluronic Acid in Situ Forming Hydrogel for Drug Delivery:Rheological,Mucoadhesive and in Vitro Release Properties,Eur J Pharm Biopharm 70(1)；199‑206,2008)。粘膜粘性量测结果显示于表3。
[0150] 表3
[0151]
[0152] 如表3所示，由所有实施例所制备的聚合物组成物的粘膜粘附性以计算的粘度ηfinal表示。显然，由实施例1‑5的制备的聚合物皆表现出一定程度的组织附着力(ηfinal>0)。此外，由实施例1和4所制备的氨基酸改质普朗尼克F‑127聚合物的ηfinal值低于比较例1，但其它实施例的聚合物的ηfinal值都明显高于比较例1，这表明使用疏水性和疏水性芳香族氨基酸进行普朗尼克F‑127改质，会导致聚合物的组织附着性下降。这些结果可归因于疏水性氨基酸的侧链的低可用性。更具体地说，在这种情况下，包括白氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸(被归类为芳香族氨基酸，但具有疏水特性)在内的疏水氨基酸的侧链较难与粘蛋白产生相互作用(例如氢键)，因此造成它们的组织粘附性相对较弱。相反，由实施例2和5制备的聚合物表现出明显的强粘附性，因为该聚合物拥有具反应性的侧链，其中一个氨基(来自实施例
2)、一个羟基(来自实施例5(1))和一个硫醇基(来自实施例5(2))，可用于与粘蛋白形成氢键和/或双硫键。因此，这些氨基酸改质的聚合物表现出很强的组织附着性。
2)、一个羟基(来自实施例5(1))和一个硫醇基(来自实施例5(2))，可用于与粘蛋白形成氢键和/或双硫键。因此，这些氨基酸改质的聚合物表现出很强的组织附着性。
[0153] 实验例4
[0154] 动物模型的防沾粘功效性测试
[0155] 将实施例1‑5中制备的每种氨基酸改质的普朗尼克F‑127溶解在一定量的蒸馏水中，得到最终浓度为15％(重量/体积)的聚合物水胶。
[0156] (2)比较例1的制备
[0157] 将一定量的未改质的普朗尼克F‑127，与一定量的蒸馏水一起加入，形成最终浓度为15％(重量/体积)的聚合物水胶。
[0158] (3)比较例2的制备
[0159] 首先将由实施例2和5(2)中制备的氨基酸改质聚合物粉末以8:2的重量比混合，得到聚合物组合。随后加入一定量的蒸馏水，得到最终浓度为15％(w/v)的水胶组合物。
[0160] (4)动物试验
[0161] 为了评估所提供的氨基酸改质聚合物的组织沾粘预防功效，进行了一项动物试验研究(腹壁缺损的大鼠模型)。在此，将由实施例1(1)、2、3和4制备的聚合物作为实验组，将比较例1制备的未改质的对应物作为比较组，比较例2制备的水胶组合作为另一比较组，并将手术部位没有使用任何材料的组别作为对照组。
[0162] 于动物试验中，每组4只雄性Sprague Dawley(SD)大鼠通过注射1mL/Kg含有和 (1:1)的混合物进行腹腔内麻醉。先将麻醉后的大鼠腹部剃毛，再用聚维酮碘消毒，并沿腹壁白线切开5厘米长的腹膜。然后，用手术刀在右腹壁上创造面积为2
2
×2cm 的腹膜缺损。接着，对于实验组，将2毫升由实施例1‑4及比较例1‑2所制备的各个水胶分别均匀地涂抹在受伤部位，原位凝胶化约在2分钟内形成。对于对照组，仅用2毫升无菌生理盐水清洗损伤位置。最后，用3‑0丝线缝合腹膜，再用4‑0丝线缝合皮肤。
2
×2cm 的腹膜缺损。接着，对于实验组，将2毫升由实施例1‑4及比较例1‑2所制备的各个水胶分别均匀地涂抹在受伤部位，原位凝胶化约在2分钟内形成。对于对照组，仅用2毫升无菌生理盐水清洗损伤位置。最后，用3‑0丝线缝合腹膜，再用4‑0丝线缝合皮肤。
[0163] 术后14天，以双盲方式根据霍夫曼沾粘评分系统，评估组织沾粘的严重度，分数由0、1、2或3，评分越高，组织沾粘越严重。
[0164] Hoffmann组织沾粘程度评分系统的详细说明提供于表4(Hoffmann NE.,et al.,Choice of Hemostatic Agent Influence Adhesion Formation in A Rat Cecal Adhesion Model,J Surg Res.155(1),77‑81,2009)。组织沾粘程度的评估结果显示表5，并在图2中进行图式说明，统计分析采用Prism 7for Mac(GraphPad Software,USA)进行双尾计算的司徒顿t检定(Student’s t‑test)分析，如果p<0.05，则认为对照组和实验组的差异具有统计学意义。对照组、比较组和实验组的组织沾粘的照片说明显示于图3A至图3E。
[0165] 如表5所示(另见图2)，由实施例1‑4制备的水胶都表现出对组织沾粘的明显预防作用，而由比较例1中制备的水胶与对照组相比，其对预防组织沾粘的效果并不具有统计意义(另见图3A至图3D)。特别的是，由实施例2制备的水胶在预防组织沾粘方面皆表现出显著的优异功效。这些结果表明，具有较长生存时间的水胶应能更有效地预防组织沾粘。此外，通过调整不同的氨基酸改质聚合物的组合，可以控制这些水胶组合物的粘度、机械强度和组织附着力，从而调节它们的生存时间。所以，具有预期的防组织沾粘功效的水胶是可以被制备的。因此，由比较例2制备的水胶，其成分包括离氨酸和半胱氨酸改质聚合物的组合，该凝胶生存时间超过16天，且在动物试验中显示出明显优越的组织沾粘预防功效(另见图3E)。
[0166] 表4
[0167]
[0168] 表5
[0169]
[0170]
[0171] 注:平均值±SEM(n＝4)；*:p<0.05；**:p<0.01；***:p<0.001；****:p<0.0001；NS:无统计意义的差异
[0172] 实验例5
[0173] 医药活性剂的装载、封包及释放
[0174] (1)PTX和氨基酸改质聚合物的混合溶液的制备
[0175] 首先将12毫克的PTX溶解在8毫升的甲醇中。再将1克分别由实施例2及5(2)制备的氨基酸改质聚合物，个别溶于上述已配置的PTX‑甲醇溶液中，得到PTX‑氨基酸改质聚合物的混合物溶液。
[0176] (2)比较例1的制备
[0177] 将12毫克PTX溶解在8毫升的甲醇中。再将1克未经改质的普朗尼克F‑127加入到PTX‑甲醇溶液中，形成PTX‑普朗尼克F‑127混合物。
[0178] (3)药物装载及封包
[0179] 本发明中，选择紫杉醇(PTX)作为医药活性剂，使用薄膜水合法对其进行装载和封包(Wei Z.,et al.,Paclitaxel‑Loaded Pluronic P123/F127 Mixed Polymeric Micelles:Formulation,Optimization and in Vitro Characterization,Int.J.Pharm,376(1),176‑185,2009)。简而言之，将由比较例1及实施例2及5(2)所制备的药物和氨基酸改质聚合物的混合物溶液分别转移到一个独立的茄子形玻璃瓶中，并进行1小时的旋转蒸发以去除甲醇。当甲醇被除去后，瓶中形成了一层装载PTX的聚合物薄膜，然后将其置于50℃的真空烘箱中过夜，以完全去除溶剂。每组装载PTX的聚合物薄膜以8mL蒸馏水再次水合以封包PTX，然后用23μm的纤维素膜过滤去除未被封包的PTX。最后，将每一种封装有PTX的聚合物进行冻干，得到PTX‑聚合物粉末，该粉末可配合公式来计算药物装载能力和封包效力。
[0180] 计算药物装载能力和药物封包效力的公式如下：
[0181]
[0182]
[0183] 装载能力和封包效力结果显示于表6。
[0184] 表6
[0185]
[0186] 如表6所示，证实由实施例2及5(2)所制备的水胶与比较例1相比，显示出更好的载药能力和封包功效。
[0187] (4)药物释放
[0188] 本发明中，药物释放试验采用无膜扩散法来实施(Zhang L.,et al.,Development and in‑Vitro Evaluation of Sustained Release Poloxamer 407(P407)Gel Formulations of Ceftiofur,J.Controlled Release,85(1),73‑81,2002)。简而言之，首先将由比较例1、实施例2和5(2)中制备的封包有PTX的聚合物粉末的样品放在每个对应的烧杯中，并重新水合以形成含有20％(w/v)氨基酸改质的PTX‑聚合物水胶；于本文，聚合物含量为20％(w/v)的PTX‑未改质普朗尼克水胶是由比较例1所制备，作为比较样品。然后，将制备完毕的各个PTX‑聚合物水凝胶在37℃的培养箱中预热，以保持固体凝胶状态。之后，将
50毫升已预热的含有PBS‑甲醇混合溶液(90％：10％；v/v)的释放介质，直接加入到各组别的PTX‑聚合物水凝胶表面，然后将其置于37℃的培养箱中，以100rpm的速度持续摇晃。在预定的时间，由每个烧杯中取1毫升溶液用于评估药物释放状况，随即加入1毫升释放介质以保持固定体积。对所制备的氨基酸改质聚合物和比较例1进行三次重复的药物释放试验，用紫外光光谱仪检测药物释放数据，其中紫外光波长设置为236nm。分析后的药物释放曲线显示于图4A至图4C中。
50毫升已预热的含有PBS‑甲醇混合溶液(90％：10％；v/v)的释放介质，直接加入到各组别的PTX‑聚合物水凝胶表面，然后将其置于37℃的培养箱中，以100rpm的速度持续摇晃。在预定的时间，由每个烧杯中取1毫升溶液用于评估药物释放状况，随即加入1毫升释放介质以保持固定体积。对所制备的氨基酸改质聚合物和比较例1进行三次重复的药物释放试验，用紫外光光谱仪检测药物释放数据，其中紫外光波长设置为236nm。分析后的药物释放曲线显示于图4A至图4C中。
[0189] 图4A显示了由未改质的普朗尼克F‑127所制备水胶的PTX释放曲线。如图4A所示，约50％的已封装PTX在24小时内被释放，所有PTX在48小时内完全释放，显示了快速的药物释放行为。此外，大约30％的PTX在最初的12小时内被释放，表明发生了药物突释现象。
[0190] 图4B至图4C分别展示了由实施例2和5(2)制备的水凝胶的PTX释放模式。如图4B至图4C所示，在120小时内，约60％的PTX从由实施例2制备的水胶中释放，而40％的PTX从由实施例5(2)制备的水胶中缓慢释放，显示了这些水凝胶的可持续药物释放能力。此外，尽管两种水凝胶都在168小时内完全释放PTX，但它们仍然呈现出不同的药物释放模式。由实施例2所制备的水胶的PTX释放率在最后48小才快速增加，而实施例5(2)所制备的水胶则是在最后24小时迅速释放PTX。这些结果可能是由于这两种水胶的机械强度不同。如实验例2中的实施例2和5(2)的凝胶存留结果所示，经离氨酸改质的水胶表现出稍短于半胱氨酸改质水胶的凝胶生存时间，表明离氨酸改质水胶的结构应该比半胱氨酸改质的水胶更早且更快地崩溃。这种情况将促进离氨酸改质的水胶比半胱氨酸改质的水胶更快地形成内部信道，该内部信道将使PTX更容易穿透整个水胶层，因此，与半胱氨酸改质的水胶相比，离氨酸改质的水胶会更早地增加PTX释放率。
[0191] 总结来说，基于本发明的实验结果，证实了经由一种或一些氨基酸改质后的普朗尼克聚合物，可以大幅改善以普朗尼克为主体的药物释放系统的载药能力、药物封装效果以及药物释放的可持续性。
[0192] 综上所述，本发明发现由氨基酸改质的普朗尼克(Pluronic)与其组合物可以：(1)提高聚合物结构的机械强度、(2)增加聚合物的流动性，使其具备更多的生物应用上的可用性、(3)提高抗水侵蚀能力、(4)提高聚合物与组织之间的附着性、(5)提高预防组织沾粘的能力、(6)增加医药活性剂的装载能力以及(7)改善传输医药活性剂时的释放情况。