一种包含α-紫罗兰酮用于抗紫外线暴露引起肾脏损伤的组合物

摘要

本发明公开了一种包含α‑紫罗兰酮用于抗紫外线暴露引起肾脏损伤的组合物，属于医药技术领域。所述组合物的活性成分为α‑紫罗兰酮或其盐。本发明通过试验证明，通过补充α‑紫罗兰酮可以显著改善慢性UVB辐照引发的肾脏损伤，包括肾炎、肾纤维化、肾实质损伤。本发明首次公开α‑紫罗兰酮或其盐具有改善慢性紫外线暴露引起的肾脏损伤方面的用途，可用于制备治疗肾损伤药物，具有良好的开发前景。

权利要求

1.α‑紫罗兰酮或其盐在制备抗紫外线暴露引起肾脏损伤的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述紫外线暴露包括慢性紫外线辐照和急性紫外线辐照。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述紫外线包括UVA、UVB、UVC。

4.如权利要求1‑3任一项所述的应用，其特征在于，所述肾脏损伤包括肾炎症、肾纤维化、肾实质损伤中的一种或多种。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，α‑紫罗兰酮或其盐改善慢性紫外线暴露引起的肾脏炎症，所述炎症包括巨噬细胞浸润增加、炎症因子表达增加。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，α‑紫罗兰酮或其盐降低慢性紫外线暴露引起的肾脏纤维化增加，所述肾脏纤维化增加包括肾组织切片Masson阳性面积增加、MMP基因表达降低、胶原纤维相关基因表达量增加。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，α‑紫罗兰酮或其盐改善慢性紫外线暴露引起的肾实质损伤，所述肾实质损伤包括肾组织中CXCL12基因、E‑selectin基因、Lipocalin基因表达量增加。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括有效剂量的α‑紫罗兰酮或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，药物的制剂形式为口服制剂。

说明书

一种包含α‑紫罗兰酮用于抗紫外线暴露引起肾脏损伤的组

合物

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及α‑紫罗兰酮应用于制备抗紫外线暴露引起肾脏损伤的药物中的用途。

背景技术

[0002] 紫外线(Ultraviolet，UV)是一类波长为400nm～10nm的光辐射，紫外线按照波长划分为UVA、UVB和UVC，UVC几乎被臭氧层阻隔，抵达地表的紫外线主要是UVA和UVB，UVA和UVB辐射给人体肌肤带来伤害，为一类致癌物。目前，紫外线被认为是激发系统性红斑狼疮(SLE)的最重要的环境因素之一，研究表明，高达～80％的患者有光敏感性。皮肤暴露在紫外线下会引发局部皮肤病、皮肤红斑狼疮(CLE)和全身炎症的恶化，包括肾炎(LN)。但是其引发机制尚不清楚。

[0003] Sladjana Skopelja‑Gardner等人的研究显示皮肤暴露于紫外线，免疫系统以IL‑17A依赖的方式刺激中性粒细胞从皮肤迁移到肾脏，触发中性粒细胞介导的肾炎过程(Acute skin exposure to ultraviolet light triggers neutrophil‑mediated kidney inflammation.PNAS,2021,118(3))。研究人员还发现，即使是正常的健康小鼠，皮肤单次暴露在紫外线下也会刺激肾脏的炎症和损伤过程，包括出现短暂性蛋白尿。虽然正常、健康的小鼠不会出现红斑狼疮患者中看到的临床标准的肾脏疾病，但是肾脏已发生亚临床损伤。

[0004] 因此，开发用于预防和治疗紫外线引发肾脏损伤的药物是所属领域技术人员亟需解决的技术问题。

[0005] α‑紫罗兰酮(α‑Ionone)是一种天然香料，存在于各种花卉、水果和蔬菜中。α‑紫罗兰酮带有紫罗兰花香，是一种商业价值较高的香料，《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》(GB 2760‑2014)中，α‑紫罗兰酮被归类于食品用合成香料。其分子式为C13H20O，结构式如下：

[0006]

[0007] 目前的研究表明，除了香味特性，α‑紫罗兰酮还具有抗氧化、抗炎、抗菌、修复皮肤损伤、缓解肌肉萎缩、诱导细胞凋亡及阻滞细胞周期、抗害虫和化感作用等多种生物活性(葛怡青,仝涛.食品用香料α‑紫罗兰酮的生物活性研究进展.食品工业科技,2022:1‑13)。

[0008] 迄今为止，未见关于α‑紫罗兰酮可以改善紫外线暴露引起的肾脏损伤的相关报道。

发明内容

[0009] 本发明的目的在于提供一种可以改善紫外线暴露引起的肾脏损伤的可食用物质，将其开发成可用于预防和/或治疗紫外线暴露引起肾脏损伤的药物。

[0010] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0011] 本发明提供了α‑紫罗兰酮或其盐在制备抗紫外线暴露引起肾脏损伤的药物中的应用。

[0012] 所述紫外线暴露包括慢性紫外线辐照和急性紫外线辐照。

[0013] 紫外线暴露是指受到紫外线(包括UVA、UVB、UVC)的辐射，研究显示，无论是急性紫外线辐照(大剂量短时间内的辐照)还是慢性紫外线辐照(长期小剂量的辐照)都会引起肾脏组织的损伤。

[0014] 所述肾脏损伤包括肾炎症、肾纤维化、肾实质损伤中的一种或多种。

[0015] 本发明研究表明，通过补充α‑紫罗兰酮可显著改善上述肾脏损伤症状。

[0016] 具体的，所述肾炎症表现为：肾脏巨噬细胞浸润增加，炎症因子如TNF‑α、INF‑γ表达量增加。

[0017] 结合α‑紫罗兰酮或其盐治疗可以改善紫外线暴露尤其是慢性紫外线暴露引起的肾脏巨噬细胞浸润增加、肾炎症因子表达增加。

[0018] 所述肾纤维化表现为：肾组织中出现明显的纤维化区域(肾组织切片Masson阳性面积增加)，MMP基因表达显著降低，胶原纤维相关基因(如COL1A1基因、COL1A2基因、COL3A1基因)表达量增加。

[0019] 结合α‑紫罗兰酮或其盐治疗可以显著改善紫外线暴露尤其是慢性紫外线暴露引起的肾脏纤维化。

[0020] 所述肾实质损伤表现为：肾实质损伤标志物(如CXCL12、E‑selectin、Lipocalin)表达量增加。

[0021] 结合α‑紫罗兰酮或其盐治疗可以显著降低紫外线暴露尤其是慢性紫外线暴露引起的肾组织中CXCL12基因、E‑selectin基因、Lipocalin基因表达量增加。

[0022] α‑紫罗兰酮为已知的食品用香料，具备生物安全性，有望将其开发成用于预防或治疗因紫外线暴露引起肾脏损伤的药物。

[0023] 具体的，本发明提供了一种预防和/或治疗紫外线暴露引起肾脏损伤的药物组合物，所述药物组合物包括有效剂量的α‑紫罗兰酮或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料。

[0024] 所述药物组合物以α‑紫罗兰酮或其药学上可接受的盐为主要活性成分，添加药剂学上可接受的辅料制成，可按照药剂学上记载的制剂制备方法制成制剂。

[0025] 所述药学上可接受的辅料可以为载体、稀释剂、包衣、佐剂、赋形剂或媒介，如防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、乳液稳定剂、悬浮剂、等渗剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、着色剂、抗细菌剂、抗真菌剂、其他治疗剂、润滑剂、吸附延缓或促进剂、分配剂等。

[0026] 药物组合物制剂形式包括但不限于：片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、粉剂、水溶液或悬浮液、注射溶液、酏剂、糖浆等。

[0027] 优选的，药物组合物的制剂形式为口服制剂。

[0028] 本发明研究表明，100mg/kg/d的α‑紫罗兰酮处理为改善慢性UVB辐照实验小鼠肾脏损伤的有效剂量，且没有明显的毒副作用。

[0029] 术语说明：

[0030] 术语“包括”为开放式表达，即包含本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

[0031] 术语“预防”指获病或障碍的风险的减少(即：使疾病的至少一种临床症状在受试者内停止发展，该受试者可能面对或预先倾向面对这种疾病，但还没有经历或表现出疾病的症状)。

[0032] 术语“治疗”，在其中一些实施方案中指改善疾病或病症(即减缓或阻止或减轻疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一些实施方案中指缓和或改善至少一种身体参数，包括可能不为受试者所察觉的身体参数。在另一些实施方案中指从身体上(例如稳定可察觉的症状)或生理学上(例如稳定身体的参数)或上述两方面调节疾病或病症。在另一些实施方案中指预防或延迟疾病或病症的发生、发作或恶化。

[0033] 术语“有效剂量”是指当施用受试者来治疗疾病时，化合物的分量足够对这种疾病的治疗起效。有效剂量可以随着疾病的严重程度，以及有待治疗的受试者的身体条件，年龄，体重，性别等而改变。

[0034] 术语“药学上可接受的辅料”是指能够递送本发明有效剂量活性物质，不干扰活性物质的生物活性并且对宿主或受试者无毒副作用的任何制剂或载体介质。

[0035] 本发明具备的有益效果：

[0036] 本发明首次公开α‑紫罗兰酮具有改善紫外线暴露引起肾脏损伤方面的功能。本发明通过试验证明，通过补充α‑紫罗兰酮可以显著改善慢性UVB辐照引发的肾脏损伤，包括肾炎症、肾纤维化、肾实质损伤。因此，α‑紫罗兰酮可用于制备预防和/或治疗紫外线暴露引起肾脏损伤的药物，具有良好的开发前景。

附图说明

[0037] 图1为肾组织F4/80染色图片。

[0038] 图2为F4/80阳性面积统计。

[0039] 图3为肾组织中TNF‑α基因mRNA相对表达量。

[0040] 图4为肾组织中INF‑γ基因mRNA相对表达量。

[0041] 图5为肾组织Masson染色图片。

[0042] 图6为Masson阳性面积统计。

[0043] 图7为肾组织中MMP‑3基因mRNA相对表达量。

[0044] 图8为肾组织中MMP‑9基因mRNA相对表达量。

[0045] 图9为肾组织中COL1A1基因mRNA相对表达量。

[0046] 图10为肾组织中COL1A2基因mRNA相对表达量。

[0047] 图11为肾组织中COL3A1基因mRNA相对表达量。

[0048] 图12为肾组织中CXCL12基因mRNA相对表达量。

[0049] 图13为肾组织中E‑selectin基因mRNA相对表达量。

[0050] 图14为肾组织中Lipocalin基因mRNA相对表达量。

[0051] 图15为各实验组小鼠14周体重变化情况。

[0052] 图16为小鼠肾脏重量。

[0053] 图17为小鼠肝脏重量。

[0054] 图18为小鼠脾脏重量。

[0055] 图19为小鼠肺重量。

[0056] 注：上图中，*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001；****表示p<0.0001；ns表示不显著(p>0.05)。

具体实施方式

[0057] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

[0058] 下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

[0059] 实施例1

[0060] 1、本研究选用30只7周龄C57/BL6N雄性小鼠，预饲养1周后，将小鼠分为3组，每组10只，分别为：1、Control组(不给予UVB照射和α‑紫罗兰酮处理)；2、UVB组(给予UVB照射但不给予α‑紫罗兰酮处理)；3、α‑ionone组(给予UVB照射和100mg/kg/dα‑紫罗兰酮处理)。

[0061] 自制UVB辐照灯箱，箱中装有飞利浦UVB宽波灯管(型号为TL40W/12RS SLV/25)，照射高度为30cm，用UVB辐照强度测试仪(北京师范大学光电仪器厂)检测UVB灯管发出的UV强2 2 2
度(mW/cm)，根据公式：辐照时间(s)＝辐照能量(mJ/cm)/辐照功率(mW/cm)，计算辐照时长。

[0062] Control组小鼠不接受紫外辐照，UVB组小鼠和α‑ionone组小鼠接受14周紫外辐照，辐照程序为在距离UVB光源30cm处，给予小鼠UVB辐照，每周3次，UVB辐照强度从1个最小2
红斑剂量(最小红斑剂量经测定为100mJ/cm)开始，每周增加1个最小红斑量，增加至3个最
2
小红斑剂量并保持剂量不变，14周后停止UVB辐照。实验过程中的最大辐照剂量300mJ/cm相当于北京户外暴露约0.5‑1小时接收的太阳辐照(2021年北京平均日辐照能量：154J/
2
cm/d)。

[0063] 上述各实验组每天给予每组实验小鼠AIN93G饮食或含α‑紫罗兰酮的AIN93G饮食，饲料配方见表1。

[0064] 表1小鼠饲粮组成(g/kg)

[0065]成分 Control组和UVB组 α‑ionone组
玉米淀粉 397.486 396.486
酪蛋白 200 200
麦芽糖糊精 132 132
蔗糖 100 100
大豆油 70 70
纤维素 50 50
矿物质复合物 35 35
维生素复合物 10 10
L‑胱氨酸 3 3
酒石酸胆碱 2.5 2.5
抗氧化剂 0.014 0.014
α‑紫罗兰酮 ‑ 1

[0066] 每周记录体重。14周实验结束后，小鼠禁食6h后，摘眼球取血，对肾、肝、脾、肺组织进行称重并记录。收集肾组织，保存在‑80℃和10％多聚甲醛中以待后续分析。将血液样品在室温静置一段时间后，在4℃，以3000rpm离心15min后得血清，保存在‑80℃。

[0067] 2、组织学检查和图像分析

[0068] 取适量肾组织，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，用10％中性甲醛溶液固定，石蜡包埋。将切片切成5μm切片并使用常规方法进行F4/80和Masson染色。在光学显微镜下观察肾脏的组织病理学变化。使用Image J软件版本1.53(Rasband,W.S.,ImageJ,U.S.National Institutes of Health,Bethesda,MD,USA)统计F4/80阳性面积和胶原纤维阳性面积。

[0069] 3、RNA提取和实时定量PCR(RT‑qPCR)

[0070] 使用Trizol试剂提取肾RNA。用Nano 300分光光度计(AllshengCo.，Ltd.，杭州，中国)检测RNA质量和浓度。cDNA根据FastKing RT Kit(With gDNase)(TransGen Biotech,Beijing,China)产品说明书合成。RT‑qPCR根据SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(TransGen Biotech,Beijing,China)产品说明书进行。

[0071] RT‑qPCR的引物序列如表2所示。用β‑actin表达量标准化目标mRNA表达量。

[0072] 表2引物序列

[0073]

[0074] 4、统计分析

[0075] 数据表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。对于统计分析，使用t test确定两组之间差异的显著性。GraphPad Prism 8软件(San Diego，CA，USA)用于统计分析。在所有统计检验中，显著性设定为*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001；ns，不显著(p>0.05)。

[0076] 5、实验结果

[0077] 5.1肾脏巨噬细胞浸润情况

[0078] 用肾F4/80染色反映肾脏巨噬细胞浸润情况，F4/80蛋白表达于多种成熟的巨噬细胞中，是巨噬细胞表面标志物之一。

[0079] 结果如图1所示，与control组相比，慢性UVB辐照组出现明显的F4/80阳性区域(红色)。补充α‑紫罗兰酮后，与UVB造模组相比，肾中F4/80阳性区域减少。

[0080] 如图2所示，用Image J统计图1中F4/80阳性区域面积。与control组相比，慢性UVB辐照组F4/80阳性区域面积极显著高于正常组。补充α‑紫罗兰酮后，与UVB造模组相比，肾中F4/80阳性区域面积显著减少。

[0081] 实验结论：补充α‑紫罗兰酮显著改善慢性UVB暴露引起的肾脏巨噬细胞浸润。

[0082] 5.2肾组织中TNF‑α基因mRNA相对表达量

[0083] 用TNF‑α的mRNA表达量反映肾脏炎症情况。结果如图3所示，与control组相比，慢性UVB辐照组TNF‑α的mRNA表达水平极显著高于control组。补充α‑紫罗兰酮后，肾中TNF‑α的mRNA表达水平极显著降低。

[0084] 实验结论：补充α‑紫罗兰酮显著改善慢性UVB暴露引起的肾脏炎症。

[0085] 5.3肾组织中INF‑γ基因mRNA相对表达量

[0086] 用INF‑γ的mRNA表达量反映肾脏炎症情况。结果如图4所示，与control组相比，慢性UVB辐照组INF‑γ的mRNA表达水平极显著高于control组。补充α‑紫罗兰酮后，肾中INF‑γ的mRNA表达水平极显著降低。

[0087] 实验结论：补充α‑紫罗兰酮显著改善慢性UVB暴露引起的肾脏炎症。

[0088] 5.4肾纤维化情况

[0089] 用肾Masson染色反映肾纤维化情况，Masson染色将胶原纤维染成蓝色。

[0090] 结果如图5所示，与control组相比，慢性UVB辐照组出现明显的纤维化区域(蓝色)。补充α‑紫罗兰酮后，与UVB造模组相比，肾中纤维化区域减少。

[0091] 如图6所示，用Image J统计图5中Masson阳性区域面积。与control组相比，慢性UVB辐照组Masson阳性区域面积极显著高于正常组。补充α‑紫罗兰酮后，与UVB造模组相比，肾中Masson阳性区域面积极显著减少。

[0092] 实验结论：补充α‑紫罗兰酮显著改善慢性UVB暴露引起的肾脏纤维化。

[0093] 5.5肾组织中MMP‑3基因mRNA相对表达量

[0094] 用MMP‑3的mRNA表达量反映肾脏纤维化情况。结果如图7所示，与control组相比，慢性UVB辐照组MMP‑3的mRNA表达水平显著低于control组。补充α‑紫罗兰酮后，肾中MMP‑3的mRNA表达水平显著升高。

[0095] 实验结论：补充α‑紫罗兰酮显著改善慢性UVB暴露引起的肾脏纤维化。

[0096] 5.6肾组织中MMP‑9基因mRNA相对表达量

[0097] 用MMP‑9的mRNA表达量反映肾脏纤维化情况。结果如图8所示，与control组相比，慢性UVB辐照组MMP‑9的mRNA表达水平极显著低于control组。补充α‑紫罗兰酮后，肾中MMP‑9的mRNA表达水平极显著升高。

[0098] 实验结论：补充α‑紫罗兰酮显著改善慢性UVB暴露引起的肾脏纤维化。

[0099] 5.7肾组织中COL1A1基因mRNA相对表达量

[0100] 用COL1A1的mRNA表达量反映肾脏纤维化情况。结果如图9所示，与control组相比，慢性UVB辐照组COL1A1的mRNA表达水平极显著高于control组。补充α‑紫罗兰酮后，肾中COL1A1的mRNA表达水平极显著降低。

[0101] 实验结论：补充α‑紫罗兰酮显著改善慢性UVB暴露引起的肾脏纤维化。

[0102] 5.8肾组织中COL1A2基因mRNA相对表达量

[0103] 用COL1A2的mRNA表达量反映肾脏纤维化情况。结果如图10所示，与control组相比，慢性UVB辐照组COL1A2的mRNA表达水平显著高于control组。补充α‑紫罗兰酮后，肾中COL1A2的mRNA表达水平极显著降低。

[0104] 实验结论：补充α‑紫罗兰酮显著改善慢性UVB暴露引起的肾脏纤维化。

[0105] 5.9肾组织中COL3A1基因mRNA相对表达量

[0106] 用COL3A1的mRNA表达量反映肾脏纤维化情况。结果如图11所示，与control组相比，慢性UVB辐照组COL3A1的mRNA表达水平显著高于control组。补充α‑紫罗兰酮后，肾中COL3A1的mRNA表达水平极显著降低。

[0107] 实验结论：补充α‑紫罗兰酮显著改善慢性UVB暴露引起的肾脏纤维化。

[0108] 5.10肾组织中CXCL12基因mRNA相对表达量

[0109] 用CXCL12(肾小球和小管分泌的一种趋化因子，肾损伤标志物之一)的mRNA表达量反映肾实质损伤情况。结果如图12所示，与control组相比，慢性UVB辐照组CXCL12的mRNA表达水平显著高于control组。补充α‑紫罗兰酮后，肾中CXCL12的mRNA表达水平显著降低。

[0110] 实验结论：补充α‑紫罗兰酮显著改善慢性UVB暴露引起的肾实质损伤。

[0111] 5.11肾组织中E‑selectin基因mRNA相对表达量

[0112] 用E‑selectin(肾损伤标志物之一)的mRNA表达量反映肾实质损伤情况。结果如图13所示，与control组相比，慢性UVB辐照组E‑selectin的mRNA表达水平极显著高于control组。补充α‑紫罗兰酮后，肾中E‑selectin的mRNA表达水平显著降低。

[0113] 实验结论：补充α‑紫罗兰酮显著改善慢性UVB暴露引起的肾实质损伤。

[0114] 5.12肾组织中Lipocalin基因mRNA相对表达量

[0115] 用Lipocalin(肾损伤标志物之一)的mRNA表达量反映肾实质损伤情况。结果如图14所示，与control组相比，慢性UVB辐照组Lipocalin的mRNA表达水平显著高于control组。
补充α‑紫罗兰酮后，肾中Lipocalin的mRNA表达水平显著降低。

[0116] 实验结论：补充α‑紫罗兰酮显著改善慢性UVB暴露引起的肾实质损伤。

[0117] 5.13体重及各脏器重量

[0118] 结果如图15‑19所示，慢性UVB暴露从第四周开始极显著降低小鼠体重，补充α‑紫罗兰酮对小鼠体重无影响。慢性UVB暴露不影响小鼠肾、脾和肺重量，但显著增加小鼠肝重。补充α‑紫罗兰酮对小鼠肾、肝和脾重量无影响，但显著降低小鼠肺重量。

[0119] 实验结论：在100mg/kg/d剂量的α‑紫罗兰酮处理下对机体没有明显的毒副作用。根据Reagan‑Shaw等人推荐的体表面积标准化计算(Reagan‑Shaw,S.；Nihal,M.；Ahmad,N.Dose translation from animal to human studies revisited.Faseb J.2008,22,
659‑661.)，小鼠中100mg/kg/d剂量相当于人体中大约8mg/kg/d。

[0120] 实施例2片剂制备

[0121] 配方：α‑紫罗兰酮100mg，乳糖100mg，微晶纤维素100mg，羧甲基纤维素钠5mg，硬脂酸镁2mg。

[0122] 按照常规的片剂制备方法进行混料、干燥、压片，制得含有α‑紫罗兰酮的片剂。

[0123] 实施例3胶囊剂制备

[0124] 配方：α‑紫罗兰酮100mg，淀粉50mg，乳糖50mg，微晶纤维素100mg，羧甲基纤维素钠5mg，硬脂酸镁2mg。

[0125] 按照常规的胶囊剂制备方法进行制粒、干燥、整粒，填充至胶囊中制备含有α‑紫罗兰酮的胶囊剂。

[0126] 实施例4丸剂制备

[0127] 配方：α‑紫罗兰酮100mg，乳糖150mg，甘油100mg，木糖醇50mg，淀粉500mg。

[0128] 按照常规的丸剂制备方法进行混料、干燥、整粒，制得含有α‑紫罗兰酮的丸剂。

[0129] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。