一种透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物胶束及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物胶束及其制备方法与应用。本发明利用双硫键将透明质酸寡糖与聚多肽接枝，制备出一种两亲性聚合物，这种两亲性聚合物可以在水中自组装形成球形纳米胶束，并实现对阿霉素的负载；该胶束具有明显的谷胱甘肽刺激响应释放性能，能够在肿瘤微环境高效释放透明质酸寡糖，具有靶向肿瘤细胞的效果，且聚合物形成的胶束能高效负载活性物质，所释放的透明质酸寡糖与负载的活性物质产生协同增效作用，呈现出更强的肿瘤细胞抑制率。本发明制备的两亲性聚合物胶束还可以实现对油溶性超顺磁性氧化铁和阿霉素的同时负载，有望应用于肿瘤成像领域。

权利要求

1.一种透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物，其特征在于制备方法包括如下步骤：（1）在透明质酸寡糖中加入缩合剂活化，之后加入胱胺二盐酸盐反应，得到胱胺化透明质酸；

（2）在谷氨酸酯苄酯环内酸酐中加入引发剂进行反应，得到PBLG；

（3）在步骤（2）制备的PBLG中加入三乙胺，然后加入催化剂混匀，再加入步骤（1）制备的胱胺化透明质酸，反应得到透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物；

步骤（1）中所述的透明质酸寡糖的重复单元与胱胺二盐酸盐的摩尔比为1：1～8；

步骤（1）所述的透明质酸寡糖的重复单元与缩合剂的摩尔比为1:8～16；

步骤（1）所述的缩合剂包括酰胺缩合剂中的至少一种；

步骤（2）中所述的谷氨酸酯苄酯环内酸酐与引发剂的摩尔比为5:0.1～0.3；

步骤（2）中所述的引发剂为L‑谷氨酸；

步骤（3）中所述的三乙胺的加入量为按每1g PBLG加入50～200μL；

步骤（3）中所述的PBLG与催化剂的质量比为1:0.2～0.4；

步骤（3）中所述的PBLG与胱胺化透明质酸的质量比为1:2～5；

步骤（3）中所述的催化剂包括酰胺缩合剂中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物，其特征在于：步骤（1）中所述的透明质酸寡糖为透明质酸寡糖溶液；

步骤（1）中所述的活化的条件为活化1～3h；

步骤（1）中所述的胱胺二盐酸盐为胱胺二盐酸盐溶液；

步骤（1）中所述的反应的时间为12～36h；

步骤（1）中所述的反应的温度为室温；

步骤（2）中所述的谷氨酸酯苄酯环内酸酐为谷氨酸酯苄酯环内酸酐溶液；

步骤（2）中所述的反应是在保护气氛下进行的；

步骤（2）中所述的反应的时间为2～4天；

步骤（2）中所述的反应的温度为室温；

步骤（3）中所述的PBLG为PBLG溶液；

步骤（3）中所述的胱胺化透明质酸为预先溶解于有机溶剂中的胱胺化透明质酸；

步骤（3）中所述的反应的温度为室温；

步骤（3）中所述的反应的时间为12～36 h。

3.一种透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物胶束，其特征在于制备方法包括以下步骤：将权利要求1或2所述的透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物溶于溶剂，透析后得到透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物胶束；

所述的透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物与溶剂的质量/体积比为0.01g：1～2mL；

所述的透析为使用截留分子量为8000～12000的透析袋透析；

所述的透析的时间为3～5天。

4.一种肿瘤治疗药物，其特征在于：是在权利要求1或2所述的透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物上负载阿霉素得到的。

5.一种负载超顺磁性氧化铁的透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物胶束的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将权利要求3所述的透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物胶束分散，加入超顺磁性氧化铁溶液，超声至均匀，透析，过滤，得到负载超顺磁性氧化铁的透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物胶束。

6.权利要求1或2所述的透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物或权利要求3所述的透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物胶束在作为药物载体制备药物中的应用。

说明书

一种透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物胶束及其制备方法与

应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药材料技术领域，特别涉及一种透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物胶束及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 乳腺癌是危害全球女性健康的恶性肿瘤之一，在女性肿瘤死亡原因中居第二位，乳腺癌的临床治疗通常采用手术切除，并结合放疗与化疗，肿瘤靶向药物开始应用于临床，乳腺癌患者的生存率以及预后效果显著提高(Veronesi U,et al.Lancet,2005,365,1727‑1741)。

[0003] 透明质酸(HA)是细胞外基质的主要成分之一，具有良好的生物相容性、可生物降解性和非免疫原性，分子结构中还富含可供进一步化学修饰改性的羧基、羟基等反应性功能基团，近年来已成为设计和制备抗肿瘤药物递送载体的原材料。透明质酸(hyaluronic acid，HA)是由N‑乙酰氨基葡糖和D‑葡糖醛酸双糖重复单位通过β‑(1→4)糖苷键和β‑(1→3)糖苷键构成的无分支高分子糖胺聚糖，广泛存在于动物的组织细胞间质和某些细菌的荚
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膜中。其相对分子质量(Mr)一般为1×10～1×10 D，分子中两种单糖的摩尔比为1∶1。HA常用的制备方法有动物组织提取法和细菌发酵法。人们对HA的结构、性质和生理功能都进行了较为充分的研究，其在临床上的应用也同益广泛。目前所用的HA的平均Mr一般都大于1×
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10D。

[0004] 透明质酸寡糖(oligosaccharides of hyaluronan，o‑HA)是Mr1×104D以下、单糖残基数量为2～40的HA分子片段。o‑HA属于小分子多糖，其性质与普通HA有很大不同，甚至具有完全相反的作用。

发明内容

[0005] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，通过酰胺化反应制备了含二硫键的胱胺化透明质酸衍生物，而后用L‑谷氨酸引发谷氨酸酯苄酯环内酸酐单体进行开环聚合，得到聚多肽；将两者接枝反应，得到了一种透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物。

[0006] 本发明的另一目的在于，采用透析法制备得到一种透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物胶束，该胶束具有良好的生物相容性和生物降解性。

[0007] 本发明的另一目的在于，提供上述透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物及其胶束的应用。

[0008] 本发明的另一目的在于，提供一种肿瘤治疗药物，在肿瘤治疗方面显示出良好的应用前景。

[0009] 本发明的再一目的在于，提供一种负载超顺磁性氧化铁的谷胱甘肽响应型透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物胶束，该胶束生物相容性好，可生物降解，在肿瘤成像研究方面显示出良好的应用前景。

[0010] 本发明的目的通过下述技术方案实现：

[0011] 一种透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物的制备方法，包括如下步骤：

[0012] (1)在透明质酸寡糖中加入缩合剂活化，之后加入胱胺二盐酸盐反应，得到胱胺化透明质酸(HA‑Cys)；

[0013] (2)在谷氨酸酯苄酯环内酸酐(BLG‑NCA)中加入引发剂进行反应，得到PBLG(聚(γ‑苄酯‑L‑谷氨酸酯))；

[0014] (3)在步骤(2)制备的PBLG中加入三乙胺，然后加入催化剂混匀，再加入步骤(1)制备的胱胺化透明质酸，反应得到透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物(含二硫键透明质酸接枝聚(γ‑苄酯‑L‑谷氨酸酯))。

[0015] 步骤(1)中所述的透明质酸寡糖为透明质酸寡糖溶液；溶剂优选为包括水性溶剂中的至少一种；更优选为磷酸盐缓冲液。

[0016] 上述的透明质酸寡糖溶液中透明质酸寡糖与溶剂的质量/体积比(质量浓度，w/v)为1∶15～50，优选为1∶25。

[0017] 步骤(1)中所述的透明质酸寡糖的平均分子量为6～7kDa，优选为6.4kDa。

[0018] 步骤(1)中所述的活化的条件为活化1～3h，优选为2h。

[0019] 步骤(1)中所述的胱胺二盐酸盐为胱胺二盐酸盐溶液，溶剂优选为水。

[0020] 上述的胱胺二盐酸盐溶液中的胱胺二盐酸盐与去离子水的质量/体积比(质量浓度，w/v)为2.25：5～15，优选为2.25：10。

[0021] 步骤(1)中所述的透明质酸寡糖的重复单元与胱胺二盐酸盐的摩尔比为1：1～8，优选为1：4。

[0022] 步骤(1)所述的缩合剂包括酰胺缩合剂中的至少一种；优选为HATU、HBTU、EDCI/HOBt中的至少一种；更优选为EDCI/HOBt。

[0023] 上述的EDCI/HOBt中EDCI和HOBt的摩尔比为1～2：1～2，优选为1:1。

[0024] 步骤(1)所述的透明质酸寡糖的重复单元与缩合剂的摩尔比为1:8～16，优选为1:8。

[0025] 步骤(1)中所述的反应的时间为12～36h，优选为24h。

[0026] 步骤(1)中所述的反应的温度为室温。

[0027] 优选地，步骤(1)中反应后还包含干燥和透析步骤。

[0028] 上述的透析为使用截留分子量为1000～3000的透析袋透析，优选为使用截留分子量为2000的透析袋透析。

[0029] 上述的透析的时间为3～5天，优选为3天。

[0030] 步骤(2)中所述的谷氨酸酯苄酯环内酸酐为谷氨酸酯苄酯环内酸酐溶液；溶剂优选为DMF。

[0031] 步骤(2)中所述的引发剂为L‑谷氨酸。

[0032] 步骤(2)中所述的谷氨酸酯苄酯环内酸酐与引发剂的摩尔比为5:0.1～0.3，优选为5:0.2。

[0033] 步骤(2)中所述的反应是在保护气氛下进行的，优选为氮气氛围下进行。

[0034] 步骤(2)中所述的反应的时间为2～4天，优选为3天。

[0035] 步骤(2)中所述的反应的温度为室温。

[0036] 优选地，步骤(2)中反应后还包括沉淀、过滤、洗涤、干燥步骤。

[0037] 上述的沉淀为使用无水乙醚沉淀。

[0038] 步骤(3)中所述的PBLG为PBLG溶液，溶剂优选为包括有机溶剂中的至少一种，更优选为二甲基亚砜。

[0039] 上述的PBLG与溶剂的质量/体积比(质量浓度，w/v)为0.1：5～15，优选为0.1：10。

[0040] 步骤(3)中所述的三乙胺的加入量为按每1g PBLG加入50～200μL(36.4mg～145.6mg)，优选为每1g加入100μL(72.8mg)。

[0041] 步骤(3)中所述的催化剂包括酰胺缩合剂中的至少一种；优选为HATU、HBTU/HOBt、EDCI/HOBt中的至少一种；更优选为HBTU/HOBt。

[0042] 上述的HBTU/HOBt中HBTU和HOBt的摩尔比为1～2:1；优选为1.1:1。

[0043] 步骤(3)中所述的PBLG与催化剂的质量比为1:0.2～0.4；优选为1:0.28。

[0044] 步骤(3)中所述的PBLG与胱胺化透明质酸的质量比为1:2～5；优选为1:3。

[0045] 步骤(3)中所述的胱胺化透明质酸为预先溶解于有机溶剂中的胱胺化透明质酸；优选为溶解于DMSO中。

[0046] 步骤(3)中所述的反应的温度为室温。

[0047] 步骤(3)中所述的反应的时间为12～36h，优选为24h。

[0048] 优选地，步骤(3)中的反应后还包含透析、过滤、冻干步骤。

[0049] 上述的透析为使用截留分子量为8000～12000的透析袋透析，优选为使用截留分子量为10000的透析袋透析。

[0050] 上述的透析的时间为3～5天，优选为3天。

[0051] 一种透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物，通过上述制备方法制备得到。

[0052] 所述的透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物具有谷胱甘肽响应功能。

[0053] 所述的透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物能够负载活性物质。

[0054] 一种透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物胶束的制备方法，包括以下步骤：

[0055] 将上述透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物溶于溶剂，透析后得到透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物胶束。

[0056] 所述的透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物与溶剂的质量/体积比(质量浓度，w/v)为0.01：1～2，优选为0.01:1。

[0057] 所述的透析为使用截留分子量为8000～12000的透析袋透析，优选为使用截留分子量为10000的透析袋透析。

[0058] 所述的透析的时间为3～5天，优选为3天。

[0059] 一种透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物胶束，通过上述制备方法制备得到。

[0060] 一种肿瘤治疗药物，是在所述的透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物上负载活性成分得到的。

[0061] 上述肿瘤治疗药物的制备方法，包括以下步骤：

[0062] 将上述透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物与活性物质溶于溶剂，透析后得到肿瘤治疗药物。

[0063] 所述的活性物质包括抗肿瘤药物中的至少一种，优选为阿霉素。

[0064] 所述的透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物与载药的质量比为1～2:1，优选为2:1。

[0065] 所述的肿瘤治疗药物能够响应环境中的谷胱甘肽释放负载的活性物质，实现靶向治疗效果。

[0066] 一种负载超顺磁性氧化铁的透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物胶束的制备方法，包括以下步骤：

[0067] 将上述透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物胶束分散，加入超顺磁性氧化铁溶液，超声至均匀，透析，过滤，得到负载超顺磁性氧化铁的透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物胶束。

[0068] 所述的超顺磁性氧化铁溶液为超顺磁性氧化铁的四氢呋喃分散液。

[0069] 所述的超顺磁性氧化铁溶液的浓度为20～30mg/mL，优选为25mg/mL。

[0070] 所述的透析为使用截留分子量为8000～12000的透析袋透析，优选为使用截留分子量为10000的透析袋透析。

[0071] 所述的透析的时间为2～5天，优选为2天。

[0072] 所述的过滤为使用滤膜过滤。

[0073] 所述的滤膜的孔径大小为0.40～0.50μm，优选为0.45μm。

[0074] 一种负载超顺磁性氧化铁的透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物胶束，通过上述制备方法制备得到。

[0075] 上述负载超顺磁性氧化铁的透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物胶束在肿瘤成像中的应用。

[0076] 透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物及其胶束在作为药物载体制备药物中的应用。

[0077] 所述的药物为乳腺癌治疗药物。

[0078] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0079] (1)本发明制备采用的原料透明质酸来源丰富、具优良生物安全性和可生物降解性。

[0080] (2)本发明制备的透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物具有两亲性，可以在水中自组装形成球形纳米胶束，能够保护聚合物本身和负载物不被并实现对油溶性超顺磁性氧化铁和阿霉素的同时负载，在体外展现出良好的磁共振弛豫效果。

[0081] (3)本发明制备的透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物具有明显的谷胱甘肽刺激响应释放性能，能够在肿瘤微环境高效释放透明质酸寡糖，具有靶向肿瘤细胞的效果，且聚合物形成的胶束能高效负载活性物质，所释放的透明质酸寡糖与负载的活性物质产生协同增效作用，呈现出更强的肿瘤细胞抑制率。

附图说明

[0082] 图1是实施例4中含二硫键透明质酸接枝聚(γ‑苄酯‑L‑谷氨酸酯)的核磁共振氢谱谱图。

[0083] 图2是实施例6中负载阿霉素和超顺磁性氧化铁的胶束粒径分布图。

[0084] 图3是实施例7中负载阿霉素和超顺磁性氧化铁的胶束的透射电镜图。

[0085] 图4是实施例5中制备的只负载阿霉素的两种聚合物胶束在不同GSH浓度条件下的阿霉素释放曲线图。

[0086] 图5是实施例5只负载阿霉素的聚合物胶束的细胞摄取情况激光共聚焦成像图。

[0087] 图6是实施例5中制备的只负载阿霉素的两种聚合物胶束的细胞毒性结果图。

[0088] 图7是通过实施例11中通过细胞毒性结果计算的得到的阿霉素、透明质酸寡糖以及两者联合应用情况下相应的阿霉素IC50结果图。

[0089] 图8是通过实施例11中通过计算的得到的阿霉素与透明质酸寡糖的CI值(联合指数值)结果图。

[0090] 图9是通过实施例12中通过细胞毒性结果计算的得到的空白阿霉素以及负载阿霉素的两种聚合物胶束相应的阿霉素IC50结果图。

具体实施方式

[0091] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。下述实施例中所使用的各原料以及试剂，除特别指出的以外，均可由市售获得。

[0092] 实施例1

[0093] 称取1.00g透明质酸寡糖(平均分子量6.4kDa，其中重复单元的分子量为379.3，购自山东福瑞达生物科技有限公司)于双口烧瓶中，加入25mL pH 7.0的磷酸盐缓冲液，搅拌使之完全溶解，而后加入过量的EDCI(1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐，1.91g，10.0mmol)和HOBt(1‑羟基苯并三唑，1.35g，10.0mmol)活化羧基2h，逐滴加入提前溶解好的胱胺二盐酸盐(Cys，2.25g，10.0mmol)溶液，室温下反应24h，透析3天(透析袋截留分子量2000)除去未反应的胱胺二盐酸盐，EDCI和HOBt等，冻干得到的白色产物命名为胱胺化透明质酸(HA‑Cys)。

[0094] 为了更好的证明双硫键的作用，将胱胺二盐酸盐换成等摩尔量的己二酸二酰肼(1.74g，10.0mmol)，其他原料加入的量不变，采用同样的合成方法，制备了侧链端基为氨基但不含二硫键的肼化透明质酸(HA‑ADH)作为对照组。

[0095] 实施例2

[0096] 谷氨酸酯苄酯环内酸酐(BLG‑NCA)的制备：

[0097] 在250毫升两口烧瓶中加入100毫升无水四氢呋喃(THF)，通氮气鼓泡以除去溶剂中溶解的氧气，并加热到50℃，然后加入4gγ‑苄酯‑L‑谷氨酸酯(BLG)和3g三光气，搅拌加热直到反应液澄清透明，再继续反应1h，停止加热，氮气氛围下冷却至室温。减压蒸馏除去THF得到的淡黄色的油状物，加入乙酸乙酯溶解，用冷的5％碳酸氢钠溶液洗涤2次，转入梨形分液漏斗分离出有机相，用无水硫酸镁干燥过夜，过滤后旋转蒸干得到的白色针状的粗产物，将1g粗产品室温下溶于乙酸乙酯至饱和，得到淡黄色的透明溶液，在‑16℃下结晶析出，等到白色颗粒晶体，过滤，室温下重新溶于少量乙酸乙酯，低温下重结晶得到白色针状晶体。命名为谷氨酸酯苄酯环内酸酐(BLG‑NCA)，产物收率为86.6％。(具体制备过程参照文献Huang J,Bonduelle C,Julie Thévenot,et al.Biologically Active Polymersomes from Amphiphilic Glycopeptides[J].Journal of the American Chemical Society,2011.)

[0098] 实施例3

[0099] 利用L‑谷氨酸引发谷氨酸酯苄酯环内酸酐单体进行开环聚合反应制备聚(γ‑苄酯‑L‑谷氨酸酯)(PBLG)。

[0100] 氮气氛围下，将1.32g实施例2所制备的BLG‑NCA用无水DMF溶解(5mmol)，加入不同量的引发剂制备不同聚合度的PBLG(具体投料比详见表1)，在室温下反应3天。反应结束后用无水乙醚沉淀，过滤得到白色固体，洗涤2次，真空干燥得到白色产物PBLG。

[0101] 表1 PBLG制备投料比

[0102]

[0103] 实施例4

[0104] 含二硫键透明质酸接枝聚(γ‑苄酯‑L‑谷氨酸酯)的制备。

[0105] 将0.10g实施例3中制备的PBLG样品2溶于10mL DMSO中，升温至40摄氏度，待完全溶解后加入10μL三乙胺，称取0.21g HBTU(O‑苯并三氮唑‑四甲基脲六氟磷酸，0.55mmol)和0.07g HOBt(0.50mmol)加入上述反应液中，待混合均匀后加入提前在10mL DMSO中溶解的
0.30g实施例1中制备的HA‑Cys，室温下反应24h，透析，过滤除去不溶的杂质，冻干得到白色产物，得到透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物含二硫键透明质酸接枝聚(γ‑苄酯‑L‑谷氨酸酯)(HA‑ss‑PBLG)，产物的核磁氢谱如图1所示。

[0106] 使用上文同样的方法，采用实施例1中制备侧链端基为氨基但不含二硫键的肼化透明质酸(HA‑ADH)制备得到不含二硫键透明质酸接枝聚(γ‑苄酯‑L‑谷氨酸酯)(HA‑g‑PBLG)。

[0107] 实施例5

[0108] (1)采用透析法制备未载药的两亲性聚合物胶束，分别将10mg实施例4中制备的含二硫键透明质酸接枝聚(γ‑苄酯‑L‑谷氨酸酯)(HA‑ss‑PBLG)溶于1mL DMSO中，待其完全溶解后转移入截留分子量为10000的透析袋中，采用去离子水透析3天除去DMSO，然后将所得两亲性胶束分散液定容至5mL，配置浓度为2mg/mL的未载药的HA‑ss‑PBLG聚合物胶束分散液。

[0109] 采用同样的方法，使用实施例4中制备的HA‑g‑PBLG制备得到未载药的HA‑g‑PBLG聚合物胶束分散液。

[0110] (2)在步骤(1)中制备得到的未载药的HA‑ss‑PBLG聚合物胶束分散液中加入5mg盐酸阿霉素，采用截留分子量为10000的透析袋去离子水透析3天制备得到负载阿霉素的HA‑ss‑PBLG聚合物胶束分散液。

[0111] 采用同样的方法制备负载阿霉素的HA‑g‑PBLG聚合物胶束分散液。

[0112] (3)冰浴下，使用探头超声(超声功率为100W，10min)重新分散步骤(2)中制备得到的负载阿霉素的HA‑ss‑PBLG聚合物胶束分散液，缓慢滴加100μL超顺磁性氧化铁(制备方法参照Sun S，et.al.Journal of the American Chemical Society,2002,124(28):8204‑8205)的四氢呋喃分散液(25mg/mL)，超声(10min)至分散均匀，溶液装入截留分子量为
10000的透析袋中用超纯水透析2天，经0.45μm滤膜过滤，除去沉淀物得到同时负载阿霉素和超顺磁性氧化铁的HA‑ss‑PBLG聚合物胶束分散液。

[0113] 采用同样的方法制备同时负载阿霉素和超顺磁性氧化铁的HA‑g‑PBLG聚合物胶束分散液。

[0114] 实施例6

[0115] 取实施例5步骤(3)制备得到的负载阿霉素和超顺磁性氧化铁的胶束分散液用超纯水稀释至0.1mg/mL。用ZetaPALS zeta电位仪(Brookhaven，美国)进行DLS测试，分析胶束粒径分布。激光波长为532nm，散射角为90°，所有测试在25℃下进行，结果如图2所示。

[0116] 实施例7

[0117] 取实施例5步骤(3)制备得到的负载阿霉素和超顺磁性氧化铁的胶束分散液用超纯水稀释至0.1mg/mL。取10μL稀释的胶束分散液滴于200目表面涂有碳膜的铜网上，1min后，用滤纸吸走多余液体，自然干燥后用JEM100CX透射式电子显微镜(JEOL，日本)对胶束粒子的形貌进行观察。结果如图3所示，照片显示透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物成功组装形成球形纳米胶束，形态均匀，状态稳定。

[0118] 实施例8

[0119] 分别取1mL实施例5步骤(2)中制备的两种负载阿霉素的胶束分散液密封于透析袋中(截留分子量3000)，然后置于装有20mL释放液的离心管内，释放液分别为谷胱甘肽浓度0、5以及10mM的水溶液，两种分散液三种浓度共六个离心管，置于37℃恒温振荡器避光震荡，在设定的时间间隔内取出2mL透析液并补加2mL新的释放液，取出的透析液用紫外分光光度计检测480nm处的吸收值并计算得到药物的累积释放率。以上每组实验重复三次取平均值，通过计算得到阿霉素的体外释放曲线。如图4所示，含二硫键的HA‑ss‑PBLG聚合物胶束分散液显示出GSH刺激响应性释放行为，且阿霉素的相对释放量要更高。

[0120] 实施例9

[0121] MD‑MBA‑231细胞对聚合物胶束的摄取情况。

[0122] 采用细胞培养基(αMEM)将MD‑MBA‑231(上海碧云天生物技术有限公司)细胞培养5
至对数生长期后，将细胞接种于12孔板中，接种密度为5×10 个/孔，以PBS作为空白对照组，取实施例5步骤(2)制备得到的两种负载阿霉素的胶束分散液和阿霉素纯品配制不同浓度的溶液，所配制的溶液中最终阿霉素浓度均为1μg/mL，将上述溶液加入接种了MD‑MBA‑
231细胞的12孔板中，在37℃，5％CO2条件下孵育4h后，小心吸走培养液，并用PBS洗2～3遍，而后用4％多聚甲醛溶液固定细胞并用DAPI和LysoTracker(溶酶体探针)染色，置于莱卡TCS SP8激光共聚焦成像系统(Leica，德国)下观察。结果如图5所示，在1h时，大部分胶束粒子被摄取后集中在细胞内的溶酶体内，24h后大部分胶束逃逸溶酶体转移到了细胞核，表明胶束粒子可以有效地被细胞摄取进而释放出负载的阿霉素。

[0123] 实施例10

[0124] MTT法考察相同药物浓度下阿霉素和负载阿霉素的聚合物胶束的细胞毒性。

[0125] 采用细胞培养基(αMEM)将MD‑MBA‑231细胞培养至对数生长期后，将细胞接种到964
孔板，接种密度为1×10个/孔。以PBS作为空白对照组，取实施例5步骤(2)制备得到的两种负载阿霉素的胶束分散液和阿霉素纯品配制不同浓度的溶液，分别设置DOX终浓度为0.1，
1.0，10，50，100μg/mL的阿霉素和负载阿霉素的聚合物胶的2组溶液，每个浓度设置4个复孔，将上述溶液加入接种了MD‑MBA‑231细胞的96孔板中，在37℃，5％CO2环境下分别孵育48和72小时，用MTT法检测各组的细胞毒性。结果如图6所示，在相同的阿霉素浓度下，负载有阿霉素的含二硫键的HA‑ss‑PBLG聚合物胶束显示出更强的细胞毒性。

[0126] 实施例11

[0127] 中位药效法研究DOX与透明质酸寡糖(oHA)的协同作用。

[0128] 为了进一步研究oHA与DOX的抗肿瘤协同作用，我们将oHA也视为一种抗肿瘤药物，研究oHA与DOX的抗肿瘤协同作用，采用MTT法检测二者单独或者联合应用时对体外培养的人乳腺癌细胞MDA‑MB 231增殖的抑制作用。采用细胞培养基(αMEM)将MD‑MBA‑231细胞培养4
至对数生长期后，将细胞接种到96孔板，接种密度为1×10 个/孔。以PBS作为空白对照组，设置第一组只加DOX，浓度分别为0.01，0.1，0.5，5，10，50μg/mL；第二组只加oHA，浓度分别为0.05，0.5，2，5，20，50，200μg/mL；第三组为联合用药组，两种药物同时给药，DOX浓度分别为0.01，0.1，0.5，5，10，50μg/mL，同时对应加入oHA浓度分别为0.05，0.5，2，5，20，50μg/mL。
每个浓度设置4个复孔，将上述溶液加入接种了MD‑MBA‑231细胞的96孔板中，在37℃，5％CO2环境下分别孵育24小时，用MTT法检测各组的细胞毒性。通过中位药效法对细胞毒性结果进行计算，得到阿霉素的中效浓度，其结果如图7所示。单用透明质酸寡糖时，对肿瘤细胞几乎没有抑制效果，而单用DOX的中效浓度为4.8μg/mL，与oHA联用后中效浓度降低至2.0μg/mL。

[0129] 在已知联合使用药物数目以及使用计量比的条件下，通过检测细胞存活率可以对药物协同作用进行定性及定量描述。CI值(联合指数值)的数值大小可以定量判断药物间相互作用的强度以及性质(CI>1为拮抗作用，CI＝1为相加作用，0.7

[0130] 实施例12

[0131] 中位药效法计算法考察聚合物胶束包覆对阿霉素的中效浓度的影响。

[0132] 采用细胞培养基(αMEM)将MD‑MBA‑231细胞培养至对数生长期后，将细胞接种到964
孔板，接种密度为1×10个/孔。以PBS作为空白对照组，取实施例5步骤(2)制备得到的两种负载阿霉素的胶束分散液和阿霉素纯品配制不同浓度的溶液，分别设置DOX终浓度为0.01，
0.1，0.5，5，10，50μg/mL的阿霉素和负载阿霉素的聚合物胶的2组溶液，每个浓度设置4个复孔，将上述溶液加入接种了MD‑MBA‑231细胞的96孔板中，在37℃，5％CO2环境下分别孵育24小时，用MTT法检测各组的细胞毒性。通过中位药效法对细胞毒性结果进行计算，得到阿霉素的中效浓度，其结果如图9所示。单用DOX的中效浓度为4.8μg/mL，而通过含二硫键的聚合物胶束负载后，DOX浓度达到1.2μg/mL时就能起到类似的肿瘤细胞抑制率，效果不仅大大优于单用DOX，也远优于不含二硫键的聚合物胶束负载阿霉素。证明本发明制备的含二硫键的透明质酸接枝聚多肽两亲性聚合物胶束通过负载阿霉素，能够有效降低阿霉素的中效浓度，极大地提高了载药的抗癌作用。

[0133] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。