红参中一种新的氨基酸衍生物分离鉴定及其新用途

摘要

本发明涉及天然药物化学领域，具体公开了一种红参(Red ginseng)中的新的氨基酸衍生物类化合物分离纯化及新用途。本发明采用氨基酸自动分析仪、核磁共振及正负离子质谱对此化合物进行结构鉴定，推导出其分子式及结构式，并最终命名为组氨酸双糖苷(Histidinyl‑fructosyl‑glucose，HFG)。进一步体外细胞活性筛选结果表明，HFG对葡萄糖诱导的HUVECs细胞损伤具有较好的保护作用，可以用于制备保护心血管疾病药物中应用。

权利要求

1.一种化合物，其特征在于，所述的化合物命名为组氨酸双糖苷，其分子式为：C18H29N3O12，结构式如下：

2.根据权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

A.取红参粉碎，过20目筛，以料液比g/mL为5倍的无水乙醇常温搅拌提取12h，转速为

1000rpm，重复提取三次，弃去乙醇液；以料液比g/mL为10倍的蒸馏水常温搅拌提取8h，转速为1000rpm，重复蒸馏水提取步骤五次，合并提取液，室温减压浓缩至较小体积，为10g/mL；

B.以体积比为80％乙醇/水溶液进行醇沉，上清液除醇、浓缩至10g/mL后过大孔树脂，以水洗脱，收集水洗脱部分，浓缩冻干；

C.取上述步骤B获得的冻干粉，按浓度为1g/mL溶于双重蒸馏水，过SephadexLH‑20柱，以双重蒸馏水洗脱，收集茚三酮阳性反应部分并浓缩冻干；

D.取上述步骤C获得的冻干粉，按浓度为1g/mL溶于体积比为0.2％冰醋酸水溶液，过Bio‑gelP‑2柱，以0.2％冰醋酸洗脱，收集Rf＝0.18组分，冻干，得到化合物组氨酸双糖苷。

3.根据权利要求1所述的化合物组氨酸双糖苷，为淡黄白色固体，室温条件下不稳定，易吸潮分解，密封后可长期保存于‑20℃中。

4.根据权利要求1所述的化合物组氨酸双糖苷，经L‑8800全自动氨基酸分析仪检测分析，该化合物吸收峰的保留时间为12.52min。

5.根据权利要求1所述的化合物在制备保护心血管疾病药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用为在制备预防、治疗或改善糖尿病诱导的血管损伤药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用，所述血管损伤包括动脉粥样硬化、血管断裂、血管痉挛、血管挫伤、血管受压。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述血管断裂包括血管完全断裂或血管部分断裂。

9.一种药物组合物，所述药物组合物含有权利要求1所述的化合物，还任选包括一种以上的辅料，所述辅料包括赋形剂，所述赋形剂包括粘合剂、填充剂、润滑剂中的任意一种或几种。

说明书

红参中一种新的氨基酸衍生物分离鉴定及其新用途

技术领域：

[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及红参中一种新的氨基酸衍生物及其分离与制备方法。背景技术：

[0002] 红参(Ginseng Radix et RhizomaRubra)系五加科植物人参Panaxginseng C.A.Mey.的栽培品经蒸制后的干燥根和根茎，是一种传统中药，具悠久的应用历史。性温，味甘、微苦，具有大补元气，复脉固脱，益气摄血的功效，用于体虚欲脱，肢冷脉微，气不摄血，崩漏下血等症。

[0003] 人参作为名贵中药材之一，本身富含有多种成分，在蒸制过程中发生了一系列的变化，使红参中所含成分呈现多样性。值得注意的是，在诸多产生的化合物中，一些氨基酸类成分发生了美拉德反应，主要是与还原糖发生羰醛缩合反应，经Amadori重排而生成。1996年郑毅男教授首次在红参中发现并分离纯化了一种全新的氨基酸衍生物—AFG(arginyl‑fructosyl‑glucose)和AF(arginyl‑fructose)，并指出其为人参炮制过程中发生美拉德反应形成的美拉德产物之一，初步揭示了红参中非皂苷类成分的多样性。

[0004] 目前，心血管疾病是全球各地区健康损失的一个重要因素，越来越多的研究致力于寻找全新、有效的可用于预防和治疗心血管疾病的药物。基于红参的传统功效，其对于心血管的保护作用已被广泛研究，主要单体成分AFG与人参皂苷Rb1、Rg1等已被证明具有保护作用。

[0005] 到目前为止，根据有关红参的化学成分研究文献报道，未见有关化合物组氨酸双糖苷的研究报道。发明内容：

[0006] 本发明创新发现并分离了组氨酸与麦芽糖的衍生物—组氨酸双糖苷(Histidinyl‑fructosyl‑glucose，HFG)。

[0007] 本发明中化合物组氨酸双糖苷HFG，初步证实具有心血管保护作用。

[0008] 本发明提供了红参中的一种化合物，同时也提供了从红参中分离该化合物的方法。

[0009] 本发明首先提供了一种新化合物，所述的化合物命名为组氨酸双糖苷，分子式为：C18H29N3O12，结构式如图：

[0010]

[0011] 本发明所述化合物的分离方法由以下步骤组成：

[0012] A.提取：称取红参粉末(过20目筛)，以5倍无水乙醇(料液比：g/mL)常温搅拌提取12h(转速1000rpm)，重复提取三次，弃去乙醇液；

[0013] 以10倍蒸馏水常温搅拌提取8h(料液比：g/mL，转速1000rpm)，重复蒸馏水提取五次，合并提取液，低温浓缩至较小体积，约为10g/mL。

[0014] B.除糖和皂苷：以体积比为80％乙醇/水溶液进行醇沉，除去大部分糖，上清液除醇、浓缩至小体积(约为10g/mL)后过大孔树脂，以水洗脱，收集水洗脱部分，浓缩冻干。

[0015] C.取上述冻干粉，溶于双重蒸馏水(浓度：1g/mL)，过Sephadex LH‑20柱，以双重蒸馏水洗脱，收集茚三酮阳性反应部分并浓缩冻干。

[0016] D.取上述冻干粉，溶于体积比为0.2％冰醋酸水溶液中，使成为1g/mL溶液，过Bio‑gel P‑2柱，以0.2％冰醋酸洗脱，流速0.3mL/min，收集Rf＝0.18组分，冻干，得到所述化合物HFG。

[0017] 本发明进一步提供了所述化合物在制备保护心血管疾病药物中的应用，具体地，在制备预防、治疗或改善糖尿病诱导的血管损伤药物中的应用。

[0018] 作为本发明的一种优选技术方案，所述的应用，所述血管损伤包括动脉粥样硬化、血管断裂、血管痉挛、血管挫伤、血管受压。

[0019] 作为本发明的一种优选技术方案，所述血管断裂包括血管完全断裂或血管部分断裂。

[0020] 本发明进一步提供了药物组合物，所述药物组合物还任选包括一种以上的辅料，所述辅料包括赋形剂，所述赋形剂包括粘合剂、填充剂、润滑剂中的任意一种或几种。

[0021] 本发明相对于现有技术的有益效果在于：

[0022] 本发明从红参中分离得到一种新的氨基酸糖苷类化合物HFG，该化合物对葡萄糖诱导的HUVECs细胞损伤具有较好的保护作用，本发明为保护心血管疾病药物的开发利用奠定了基础。附图说明：

[0023] 图1为本发明的HFG的氨基酸自动分析仪谱图

[0024] 图2为本发明的HFG的HPLC‑ELSD谱图

[0025] 图3为本发明的HFG的1H‑NMR谱图

[0026] 图4为本发明的HFG的13C‑NMR谱图

[0027] 图5为本发明的HFG的HMBC谱图

[0028] 图6为本发明的HFG的HSQC谱图

[0029] 图7为本发明的HFG的HR‑ESI‑MS谱图

[0030] 图8为HFG改善葡萄糖致HUVECs细胞损伤

[0031] 图9为AFG对葡萄糖致HUVECs细胞损伤的影响具体实施方式：

[0032] 下面将结合具体实施例对本发明所述的分离纯化方法进行进一步说明，但本发明所保护的范围并不限于此。

[0033] 实施例1本发明化合物HFG的分离制备

[0034] 本实施例的化合物HFG的结构式如下：

[0035]

[0036] 1.该化合物HFG的分离制备方法，包括以下步骤：

[0037] A.取红参粉末(过20目筛)，以5倍量无水乙醇(料液比：g/mL)，在常温条件下搅拌提取12h(转速1000rpm)，重复提取三次，弃去乙醇液；剩余沉淀以10倍量蒸馏水在常温条件下搅拌提取8h(转速1000rpm)，重复蒸馏水提取五次，离心后合并提取液，低温浓缩至较小体积，红参与液体比例约为10g/mL。

[0038] B.取步骤A得到的提取浓缩液，以体积比为80％乙醇/水溶液进行沉淀，4℃环境中静置24h后离心，保留上清液，以除去大部分糖。将上清液除醇、浓缩至小体积(体积比约为10g/mL)，过NKA大孔树脂，以水洗脱，收集水洗脱部分，浓缩冻干。

[0039] C.取步骤B得到的冻干粉，溶于双重蒸馏水，使成为1g/mL溶液，过Sephadex LH‑20柱，以双重蒸馏水洗脱，通过TLC分析，收集茚三酮阳性反应部分并浓缩冻干。

[0040] D.取上述冻干粉，溶于体积比为0.2％冰醋酸水溶液中，使成为1g/mL溶液，过Bio‑gel P‑2柱，以0.2％冰醋酸洗脱，流速0.3mL/min，收集Rf＝0.18组分，冻干，得到所述化合物HFG。

[0041] 化合物HFG为淡黄白色固体，经L‑8800型全自动氨基酸分析仪检测分析，如图1，该化合物吸收峰的保留时间为12.52min。经HPLC‑ELSD检测，如图2，该化合物吸收峰保留时间为24.21min。

[0042] 2.运用现代核磁技术及高分辨质谱HR‑ESI‑MS对该单体化合物进行结构鉴定[0043] 如图1至7及表1所示，根据HR‑ESI‑MS m/z：480.1813[M+H]+(计算值：480.1785)，结合NMR谱确定其分子式为C18H29N3O12。经鉴定，化合物结构为式(I)。

[0044] 表1化合物HFG的1H和13C‑NMR(600/100MHZ，D2O)数据(ppm)

[0045]

[0046] 实施例2本发明化合物HFG对葡萄糖诱导的人脐静脉内皮细胞HUVECs细胞损伤的保护作用。

[0047] 1、药物配制

[0048] HFG用DMEM高糖培养基溶解，使成为1mM/mL的母液，分别稀释至浓度：1.0μM/mL，2.0μM/mL，4.0μM/L，8.0μM/mL。分析纯级葡萄糖用DMEM高糖培养基溶解，使成为150mM/mL溶液。HFG本身性质不稳定，配制需做到现用现配，且整个过程均在无菌条件下完成，都需要过滤膜方能使用。

[0049] 另取同为红参中特有成分的精氨酸双糖苷(AFG)进行平行实验，具体过程同上。

[0050] 2、细胞培养

[0051] HUVECs细胞生长于含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，并在5％CO2、饱和湿度和37℃的培养箱中贴壁培养，取对数生长期细胞用于实验。

[0052] 3、MTT法测试HFG对细胞活力的影响

[0053] HUVECs细胞以1.5×105个/mL的密度接种与96孔板，培养箱内孵育24h后弃上清液，使用不同浓度的HFG和AFG分别进行预给药，对照组和模型组给予等量DMEM高糖培养基，培养箱内孵育24h后弃上清液，使用150mM/mL的葡萄糖进行造模，对照组给予等量DMEM高糖培养基，培养箱内孵育24h后每孔在避光条件下加入20μL MTT溶液(5mg/mL)溶液，培养箱内孵育3.5h后弃上清液每孔加入150μL DMSO，充分振板后用酶标仪测定在490nm处的吸光度(OD值)。

[0054] 4、数据处理

[0055] 实验数据的组间分析比较采用平均值标准差(Mean±S.D.)，采用单因素方差分析法(ANOVA)进行统计分析，p<0.05或p<0.01具备统计学意义，并采用GraphPadPrism 9.0.0软件进行柱状图的分析。

[0056] 5、结果

[0057] HFG对葡萄糖诱导的人脐静脉内皮细胞HUVECs细胞损伤的保护作用见图8。MTT结果显示，HFG剂量在1‑2μM的时候呈现出明显的保护作用(p<0.05，p<0.01)。AFG组实验结果见图9。MTT结果显示，AFG对高糖诱导的HUVECs细胞损伤无明显的保护作用。

[0058] 由此得出，HFG在对葡萄糖诱导的HUVECs细胞损伤的保护作用方面具有较好的优势。

[0059] 以上结合优选实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明。不过需要声明的是，这些具体实施方式仅是对本发明的阐述性解释，并不对本发明的保护范围构成任何限制。在不超出本发明精神和保护范围的情况下，可以对本发明技术内容及其实施方式进行各种改进、等价替换或修饰，这些均落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。