黑曲霉发酵液转化Rb1为CK的方法

摘要

本发明涉及一种黑曲霉发酵液转化Rb1为CK的方法，属于中药技术领域。本发明的黑曲霉发酵液转化Rb1为CK的方法中所述黑曲霉为黑曲霉Aspergillus niger AS3.0739，保藏号CGMCC 3.739。本发明首次采用黑曲霉Aspergillus niger AS3.0739分泌的胞外酶转化人参皂苷Rb1为人参皂苷CK的方法，底物来源广，底物浓度可达50g/L。本发明还优化黑曲霉Aspergillus niger AS3.0739培养条件，其分泌的胞外酶能够催CK转化率高达到90％，远高于现有文献报道。

权利要求

1.黑曲霉发酵液转化Rb1为CK的方法，其特征在于包括如下步骤：将人参皂苷Rb1、黑曲霉发酵液、有机溶剂混合得到转化溶液，搅拌，于45～50℃，反应24～240h，得到含CK的溶液；其中，反应过程中还添加磷酸盐缓冲液维持转化溶液的pH4.8，所述磷酸缓冲盐的浓度为0.1～0.2M；

其中，所述黑曲霉为黑曲霉Aspergillus niger AS3.0739，保藏号CGMCC 3.739；

所述黑曲霉发酵液的制备方法包括：将黑曲霉接种到培养基中，再在25～37℃发酵1～

16d，然后将发酵液固液分离后，取上清作为反应溶液；所述培养基为：玉米浆1.0～5.0g/L，酵母粉2.0～10.0g/L，硫酸铵5.0～9.0g/L，磷酸二氢钾4.0～8.0g/L，硫酸镁1.0～3.0g/L，二水氯化钙0.5～2.0g/L，磷酸氢二钾0～8.0g/L，其余为水；

所述人参皂苷Rb1在转化溶液中的浓度为10～20g/L；所述有机溶剂为DMSO，所述DMSO的添加量为转化溶液的2～5wt％。

2.根据权利要求1所述的黑曲霉发酵液转化Rb1为CK的方法，其特征在于：培养基中所述水为蒸馏水。

3.根据权利要求1或2所述的黑曲霉发酵液转化Rb1为CK的方法，其特征在于，所述方法还包括将含CK的溶液进行纯化得到纯度98％以上的CK；所述纯化的方法为将含CK的溶液经过有机溶剂萃取、Sephadex G‑200凝胶柱纯化、结晶。

说明书

黑曲霉发酵液转化Rb1为CK的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种黑曲霉发酵液转化Rb1为CK的方法，属于中药技术领域。

背景技术

[0002] 人参在我国的药用历史悠久，素有“神草”、“百草之王”等美誉。据我国最早的药学专著《神农本草经》记载，人参具有“主补五脏、安精神、止惊悸、除邪气、明目、开心益智，久服轻身延年等功效”。皂苷是人参的主要有效成分之一，人参皂苷Compound K是原人参二醇型人参皂苷在人体内主要代谢物以及发挥药效的实体物质，其具有多种生物活性包括抗肿瘤，抗炎，抗过敏等。

[0003] 人参中皂苷成分种类繁多，但主要成分是人参皂苷Rg1、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和三七皂苷R1等，稀有皂苷如人参皂苷CK，Rg3和Rh2等含量甚微。人参皂苷CK制备分为化学法和生物法，传统思路是利用酸碱水解的化学方法水解C‑3和C‑20位糖基得到CK，此方法存在诸多弊端如耗资大，产率低，副产物多等。生物法具备立体选择性高、得率高、副产物少且可以得到稀有人参皂苷等优点，是生产稀有人参皂苷最有潜力的方法。

[0004] 现有关于人参皂苷CK生物法制备的专利主要包括以下几方面：(1)在对野生型的β‑葡萄糖苷酶进行基因改造，提高其合成人参皂苷CK的活力；(CN 103805581)(2)酶法和生物法结合制备人参皂苷CK，CN 105838770A介绍了氧化微杆菌(保藏编号为CCTCC AB205576)发酵培养结合杂多酸酸HxYW12O40·nH2O催化剂制备人参皂苷CK；(3)CN 106047978以天然菌种紫芝为发酵菌，进行发酵培养，制备人参皂苷CK，但底物总皂苷浓度
2mg/mL，人参皂苷CK转化率不足1％，人参皂苷CK最高产量11.4mg/L，产量低；(4)CN 
105296587 A介绍了一种来自B.breve ATCC 15700双歧杆菌的β‑葡萄糖苷酶，人参皂苷Rb1浓度10g/L，CK转化率62～68％，但中间涉及到β‑葡萄糖苷酶的纯化步骤，较为繁琐。(5)CN 
109536561A中介绍了一种人参内生菌催化人参皂苷Rb1制备CK，人参皂苷Rb1底物浓度为
0.25mg/mL，继续振荡培养5～10天，得到稀有人参皂苷CK。

[0005] 高娟，周安东，原野，等.黑曲霉降解人参皂苷Rb1制备稀有皂苷Compound K[J].生物技术进展，2016，6(2)：98‑104.公开了从东北农耕土壤中分离出9株真菌,系统研究了其转化人参皂苷Rb1制备CK的能力。其中，黑曲霉Aspergillus niger sp.J7能够高效转化人参皂苷Rb1生成CK，转化途径为Rb1→Rd→F2→CK。对黑曲霉J7转化Rb1制备CK的条件进行优化，最适底物浓度1mg/mL，12h Rb1可完全转化成CK；然而底物浓度增大到2mg/L，12h Rb1不能完全转化。将该转化体系扩大到200mL，最适条件下，60h内可将Rb1转化成CK，转化率为74.7％，该文献报道工艺体系底物浓度较低，不利于扩大生产。

[0006] 霉菌在食品工业应用中常作为分解淀粉糖的商品酶来源，许多霉菌生产的酶制剂可作为食品和保健品行业的加工助剂使用。

[0007] 黑曲霉Aspergillus niger AS3.0739是一种常见的产糖化酶菌株。

发明内容

[0008] 本发明要解决的问题是提供一种新的黑曲霉发酵液转化Rb1为CK的方法。

[0009] 为解决本发明的技术问题，所述黑曲霉发酵液转化Rb1为CK的方法中所述黑曲霉为黑曲霉Aspergillus niger AS3.0739，保藏号CGMCC 3.739。

[0010] 在一种具体实施方式中，所述黑曲霉发酵液的制备方法包括采用如下培养基：玉米浆1.0～5.0g/L，酵母粉2.0～10.0g/L，硫酸铵5.0～9.0g/L，磷酸二氢钾4.0～8.0g/L，硫酸镁1.0～3.0g/L，二水氯化钙0.5～2.0g/L，磷酸氢二钾0～8.0g/L，其余为水；所述水优选为蒸馏水。

[0011] 在一种具体实施方式中，所述黑曲霉发酵液的制备方法包括：将黑曲霉接种到培养基中，再在25～37℃发酵1～16d。

[0012] 在一种具体实施方式中，所述黑曲霉发酵液的制备方法还包括将发酵后的溶液静置、离心、取上清液即得黑曲霉发酵液。

[0013] 在一种具体实施方式中，所述黑曲霉发酵液转化Rb1为CK的方法包括：将人参皂苷Rb1、黑曲霉发酵液、有机溶剂混合得到转化溶液，搅拌，反应得到含CK的溶液。

[0014] 人参皂苷Rb1标品或含Rb1的人参皂苷粗品均可以作为本发明的底物人参皂苷Rb1进行反应；例如人参皂苷粗品可以是不同纯度人参皂苷Rb1粗品，人参皂苷Rb1标品可以是市售的98％以上的标品；人参皂苷Rb1粗品是指含人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd和人参皂苷F2等二醇类人参皂苷的提取物。

[0015] 在一种具体实施方式中，所述人参皂苷Rb1在转化溶液中的浓度为5～50g/L，优选为10～20g/L。

[0016] 在一种具体实施方式中，所述有机溶剂为DMSO，优选所述DMSO的添加量为转化溶液的2～10wt％，更优选2～5wt％。

[0017] 在一种具体实施方式中，所述反应的温度为25～55℃，更优选45～50℃；所述反应的时间为24～240h。

[0018] 在一种具体实施方式中，所述方法还包括维持转化溶液的pH4.0～7.0，优选维持pH4.8；

[0019] 所述维持pH的方法为添加缓冲盐维持pH，优选所述缓冲盐为磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，缓冲盐的浓度为0～0.2M；优选所述缓冲盐的浓度为0.05～0.2M，更优选0.1～0.2M。所述磷酸盐优选为分析纯的磷酸盐。

[0020] 在一种具体实施方式中，所述方法还包括将含CK的溶液进行纯化得到纯度98％以上的CK；所述纯化的方法为将含CK的溶液经过有机溶剂萃取、Sephadex G‑200凝胶柱纯化、结晶。

[0021] 有益效果：

[0022] (1)本发明首次采用黑曲霉Aspergillus niger AS3.0739分泌的胞外酶转化人参皂苷Rb1为人参皂苷CK的方法，底物浓度可达50g/L。

[0023] (2)黑曲霉Aspergillus niger AS3.0739为发酵菌种，实验结果经过多次验证和工艺优化，采用本发明的培养条件，其分泌的胞外酶能够催化CK相对百分含量高达到90％，远高于现有文献报道。

[0024] (3)本发明所使用的原料广泛，可以是人参皂苷Rb1 98％标品，含有人参皂苷Rb1、Rd、F2的原人参二醇皂苷混合物，也可以是含人参皂苷Rb1的粗提物。

[0025] (4)黑曲霉Aspergillus niger AS3.0739发酵液不用经过复杂的纯化工艺，即可作为反应催化剂，节省大量纯化成本和时间。

[0026] (5)本发明的生产工艺具有反应条件温和、有机溶剂耗用少、工业废水少，转化率高、可规模化生产等特点。

附图说明

[0027] 图1为纯度98％人参皂苷Rb1为底物，经过黑曲霉Aspergillus niger AS3.0739发酵液转化前后的液相色谱图，A为底物，B为酶转化后样品图谱。

[0028] 图2为人参皂苷Rb1粗品为底物，经过黑曲霉Aspergillus niger AS3.0739发酵液转化前后的液相色谱图，A为底物，B为酶转化后样品图谱。

[0029] 图3为标准样品液相色谱图。

[0030] 图4‑1为得到的人参皂苷CK样品的碳谱全视图，其中151，136，125附近的三个大峰是溶剂吡啶峰，峰值较高，后面信号峰是正常的；峰太多，数字容易重叠，在此说明图4‑1中的与峰部分重叠的数字是0.90和16.95。

[0031] 图4‑2为得到的人参皂苷CK样品的局部放大图。

[0032] 图5‑1为得到的人参皂苷CK样品的氢谱全视图。

[0033] 图5‑2为得到的人参皂苷CK样品的氢谱局部放大图；CK有60多个H，每个氢都会出信号，所以会重叠，在此说明图5‑2中与峰重叠的数字为是1.573。

[0034] 图6为制备的人参皂苷CK样品的质谱图；图6中681.3是CK的信号峰，由于部分峰较密集，数字与峰部分重叠，在此说明图6中与峰部分重叠的是659.2、668.2、682.3。

[0035] 图7为实施例1的不同培养基酶活力比较；定义M3培养基发酵所产酶液的水解Rb1的活力为100％。

[0036] 图8为黑曲霉在PDA固体培养基生长形态图；PDA固体培养基：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH值自然。

[0037] 图9为实施例1部分培养基中的菌体生长形态；从左到右依次是PD培养基(对照)，M1培养基，M2培养基，M3培养基，M4培养基；其中，PD培养基:马铃薯20g，葡萄糖2.0g，水100mL，pH值自然。

[0038] 图10为实施例2人参皂苷CK百分含量。

[0039] 图11为实施例3人参皂苷CK百分含量。

[0040] 图12为实施例4人参皂苷CK百分含量。

[0041] 图13为实施例5人参皂苷CK百分含量。

[0042] 图14为实施例6人参皂苷CK百分含量。

[0043] 图15为实施例7人参皂苷CK百分含量。

[0044] 图16为实施例8人参皂苷CK百分含量。

具体实施方式

[0045] 为解决本发明的技术问题，所述黑曲霉发酵液转化Rb1为CK的方法中所述黑曲霉为黑曲霉Aspergillus niger AS3.0739，保藏号CGMCC 3.739。

[0046] 在一种具体实施方式中，所述黑曲霉发酵液的制备方法包括采用如下培养基：玉米浆1.0～5.0g/L，酵母粉2.0～10.0g/L，硫酸铵5.0～9.0g/L，磷酸二氢钾4.0～8.0g/L，硫酸镁1.0～3.0g/L，二水氯化钙0.5～2.0g/L，磷酸氢二钾0～8.0g/L，其余为水；所述水优选为蒸馏水。

[0047] 在一种具体实施方式中，所述黑曲霉发酵液的制备方法包括采用如下培养基：玉米浆3g/L，酵母粉5g/L，硫酸铵7g/L，磷酸二氢钾6g/L，硫酸镁1g/L，二水氯化钙1g/L，其余为水。

[0048] 在一种具体实施方式中，所述黑曲霉发酵液的制备方法包括：将黑曲霉接种到培养基中，再在25～37℃发酵1～16d。

[0049] 在一种具体实施方式中，所述黑曲霉发酵液的制备方法还包括将发酵后的溶液静置、离心、取上清液即得黑曲霉发酵液。

[0050] 在一种具体实施方式中，所述黑曲霉发酵液转化Rb1为CK的方法包括：将人参皂苷Rb1、黑曲霉发酵液、有机溶剂混合得到转化溶液，搅拌，反应得到含CK的溶液。

[0051] 人参皂苷Rb1标品或含Rb1的人参皂苷粗品均可以作为本发明的底物人参皂苷Rb1进行反应；例如人参皂苷粗品可以是不同纯度人参皂苷Rb1粗品，人参皂苷Rb1标品可以是市售的98％以上的标品；人参皂苷Rb1粗品是指含人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd和人参皂苷F2等二醇类人参皂苷的提取物。

[0052] 在一种具体实施方式中，所述人参皂苷Rb1在转化溶液中的浓度为5～50g/L，优选为10～20g/L。

[0053] 在一种具体实施方式中，所述有机溶剂为DMSO，优选所述DMSO的添加量为转化溶液的2～10wt％，更优选2～5wt％。

[0054] 在一种具体实施方式中，所述反应的温度为25～55℃，更优选45～50℃；所述反应的时间为24～240h。

[0055] 在一种具体实施方式中，所述方法还包括维持转化溶液的pH4.0～7.0，优选维持pH4.8；

[0056] 所述维持pH的方法为添加缓冲盐维pH，优选所述缓冲盐为磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，缓冲盐的浓度为0～0.2M；优选所述缓冲盐的浓度为0.05～0.2M，更优选0.1～0.2M。所述磷酸盐优选为分析纯的磷酸盐。

[0057] 在一种具体实施方式中，所述方法还包括将含CK的溶液进行纯化得到纯度98％以上的CK；所述纯化的方法为将含CK的溶液经过有机溶剂萃取、Sephadex G‑200凝胶柱纯化、结晶。

[0058] 下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

[0059] 所有实施例中，人参皂苷原料中CK百分含量近似为0。衡量指标CK转化率计算如下：

[0060] CK转化率＝实际转化得到CK/理论转化得到CK*100％

[0061] 实施例1

[0062] 将经过分离纯化的黑曲霉Aspergillus niger AS 3.0739(购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号CGMCC3.739)(见图8)，接入不同培养基中，30℃培养6天后(见图9)，固液分离，收集上清液备用。

[0063] 培养基的具体成份如下：

[0064] M1培养基：蔗糖1.0g/L，黄豆粉1.0g/L，硝酸钠0.3g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，磷酸氢二钾0.2g/L。

[0065] M2培养基：玉米浆2.0g/L，酵母粉6.0g/L，硫酸铵6.0g/L，磷酸二氢钾6.0g/L，硫酸镁2.0g/L，二水氯化钙1.0g/L。

[0066] M3培养基：蔗糖30.0g/L，硝酸钠3.0g/L，七水硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.5g/L，四水氯化铁0.01g/L，磷酸氢二钾1.0g/L。

[0067] M4培养基：葡萄糖100.0g/L，蛋白胨5.0g/L，硝酸钾5.0g/L，碳酸钙30.0g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，七水硫酸镁0.7g/L，氯化钾0.5g/L。

[0068] M5号培养基：玉米粉30.0g/L，麸质粉10.0g/L，酵母粉5.0g/L，硫酸铵7.0g/L，磷酸二氢钾6.0g/L，七水硫酸镁1.0g/L，二水氯化钙1.0g/L，Twwen‑80 0.1g/L。

[0069] M6号培养基：蔗糖15g/L，牛肉膏12g/L，硫酸铵1.0g/L，磷酸二氢钾2g/L，七水硫酸镁0.1g/L。

[0070] M7号培养基：魔芋粉20g/L，麸质粉30g/L，玉米浆60g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁2.5g/L。

[0071] M8培养基(M2‑V1)：玉米浆3.5g/L，酵母粉6.0g/L，硫酸铵7.0g/L，磷酸二氢钾6.0g/L，硫酸镁2.0g/L，二水氯化钙1.0g/L，碳酸钙12.5g/L。

[0072] M9培养基(M2‑V2)：玉米浆3.0g/L，酵母粉6.0g/L，硫酸铵7.0g/L，磷酸二氢钾6.0g/L，硫酸镁2.0g/L，二水氯化钙1.0g/L，磷酸氢二钾6.0g/L。

[0073] M10培养基(M2‑V3)：玉米浆3.0g/L，酵母粉6.0g/L，硫酸铵7.0g/L，磷酸二氢钾6.0g/L，硫酸镁2.0g/L，二水氯化钙1.0g/L，蔗糖15g/L。

[0074] 将收集的上清液作为反应催化剂，加入98％Rb1，5wt％DMSO助溶，20mM柠檬酸‑柠檬酸酸钠维持pH＝4.5，反应液中底物终浓度为10g/L，50℃反应48h。反应液采用HPLC检测，以人参皂苷CK转化率为衡量指标，具体数据如图7所示。结果表明，M4培养基转化效果最差，人参皂苷CK转化率仅有3.8％；人参皂苷，M2和M9培养基效果好，转化率分别为68.7％和61.1％。因此，M2为最优培养基。

[0075] 实施例2

[0076] 发酵液的制备：以M2培养基：玉米浆2.0g/L，酵母粉6.0g/L，硫酸铵6.0g/L，磷酸二氢钾6.0g/L，硫酸镁2.0g/L，二水氯化钙1.0g/L。培养基配制时一种用自来水，另一种用蒸馏水，37℃发酵3天，得到上清液备用。

[0077] 称取1kg人参皂苷粗品(纯度50％)，加入2wt％DMSO助溶，加入发酵得到的上清液98L，底物浓度5g/L。反应温度50℃，pH值4.8，磷酸盐浓度0.2M，反应72h，以液相色谱检测CK相对百分含量为衡量指标。具体数据如图10所示，自来水和蒸馏水发酵的酶液催化反应CK的转化率分别为52.72％和77.31％。经过有机溶剂萃取、Sephadex G‑200凝胶柱纯化、结晶，得到98％的人参皂苷CK质量分别为123.6g和188.6g。因此，蒸馏水制备的酶制剂催化反应CK的效果明显优于自来水。

[0078] 实施例3

[0079] 发酵液的制备：以M2培养基：玉米浆2.0g/L，酵母粉6.0g/L，硫酸铵6.0g/L，磷酸二氢钾6.0g/L，硫酸镁2.0g/L，二水氯化钙1.0g/L。培养基配制时用自来水，37℃发酵3天，得到上清液备用。

[0080] 在上清液加磷酸盐缓冲液调节pH值，使反应体系分别处于pH4.8、pH6.0和pH8.0条件，原料人参皂苷Rb1纯度98％，加入2wt％DMSO助溶，底物浓度10g/L，磷酸盐浓度0.2M，反应温度50℃，定时取样测定，以液相色谱检测CK转化率为衡量指标。具体数据如图11所示，pH4.8、pH6.0和pH8.0条件，72h CK转化率分别为97.67％、88.23％和1.13％。pH 4.8酸性条件下人参皂苷CK转化率最高。

[0081] 实施例4

[0082] 发酵液的制备：以M2培养基：玉米浆2.0g/L，酵母粉6.0g/L，硫酸铵6.0g/L，磷酸二氢钾6.0g/L，硫酸镁2.0g/L，二水氯化钙1.0g/L。培养基配制时用自来水，37℃发酵3天，得到上清液备用。

[0083] 在上述上清液中加入原料人参皂苷Rb1纯度50％的粗品，2wt％DMSO助溶，底物浓度10g/L，磷酸盐浓度0.2M，pH4.8，反应48h，反应温度室温45℃、50℃、55℃分别反映，以液相色谱检测CK转化率为衡量指标。定时取样测定，实验结果如图12所示，反应96h，50℃，人参皂苷CK转化率为88.5％；55℃时CK转化率最高只有22.2％；45℃，CK转化率76.9％。25℃反应240h，CK转化率达到63.4％。

[0084] 实施例5

[0085] 发酵液的制备：以M2培养基：玉米浆2.0g/L，酵母粉6.0g/L，硫酸铵6.0g/L，磷酸二氢钾6.0g/L，硫酸镁2.0g/L，二水氯化钙1.0g/L。培养基配制时用自来水，37℃发酵3天，得到上清液备用。

[0086] 在上述上清液中加入原料人参皂苷Rb1纯度50％的粗品，2wt％DMSO助溶，磷酸盐浓度0.2M，pH4.8，反应温度50℃，反应96h。底物人参皂苷Rb1，浓度选择10g/L、20g/L和50g/L三个梯度，以液相色谱检测CK转化率为衡量指标。具体数据如图13所示，96h时，10g/L、20g/L和50g/L的CK转化率为91.45％、81.29％和42.66％。

[0087] 实施例6

[0088] 发酵液的制备：以M2培养基：玉米浆2.0g/L，酵母粉6.0g/L，硫酸铵6.0g/L，磷酸二氢钾6.0g/L，硫酸镁2.0g/L，二水氯化钙1.0g/L。培养基配制时用自来水，37℃发酵3天，得到上清液备用。

[0089] 在上述上清液中加入原料人参皂苷Rb1纯度50％的粗品，DMSO助溶，考察因素DMSO加入量分别为2wt％、5wt％和10wt％，底物浓度10g/L，磷酸盐浓度0.2M，pH4.8，反应温度50℃，反应96h，以液相色谱检测CK相对百分含量为衡量指标。具体数据如图14所示，96h，DMSO加入量为2wt％、5wt％和10wt％，CK转化率分别为91.45％、88.81％和51.67％。

[0090] 实施例7

[0091] 发酵液的制备：以M2培养基：玉米浆2.0g/L，酵母粉6.0g/L，硫酸铵6.0g/L，磷酸二氢钾6.0g/L，硫酸镁2.0g/L，二水氯化钙1.0g/L。培养基配制时用自来水，37℃发酵3天，得到上清液备用。

[0092] 在上述上清液中加入原料人参皂苷Rb1纯度50％的粗品，2wt％DMSO助溶，底物浓度10g/L，pH4.8，反应温度50℃，以液相色谱检测CK相对百分含量为衡量指标。考察磷酸盐不同等级对CK百分含量的影响，磷酸盐选分别选用分析纯、工业级和不添加磷酸盐调节pH，磷酸盐浓度0.2M，具体结果如图15所示，102h，采用分析纯和工业级磷酸盐和不添加磷酸盐的CK转化率分别为92.39％、56.32％和86.63％。工业级磷酸盐杂质较多，严重影响酶反应效果，选用分析纯；工业化生产为节约成本计，酶反应阶段可不添加磷酸盐。

[0093] 实施例8

[0094] 发酵液的制备：以M2培养基：玉米浆2.0g/L，酵母粉6.0g/L，硫酸铵6.0g/L，磷酸二氢钾6.0g/L，硫酸镁2.0g/L，二水氯化钙1.0g/L。培养基配制时用自来水，37℃发酵3天，得到上清液备用。

[0095] 在上述上清液中加入原料人参皂苷Rb1纯度50％的粗品，2wt％DMSO助溶，底物浓度10g/L，反应温度50℃，磷酸盐浓度试验了5个梯度，反应48h，具体数据见图16。磷酸盐浓度0、0.02M、0.05M、0.1M和0.2M，CK转化率分别为57.96％、58.82％、63.17％、70.67％和80.79％。