一种测定柿蒂中多成分的UPLC-Q-TOF-MS方法

摘要

的24种化学成分，为进一步研究柿蒂配方颗粒药本发明公开了一种测定柿蒂中多成分的 效物质基础及全面质量控制提供了依据。UPLC‑Q‑TOF‑MS方法，步骤为（1）取柿蒂配方颗粒研细，精密称定，与溶剂混合，称定重量；（2）将上述得到的柿蒂超声破碎，放冷，再称定重量，用上述溶剂补足减失的重量；（3）将超声过的柿蒂溶液摇匀，离心，滤过，取续滤液，得到待测样品；4）用超高效液相色谱分离上述待测样品，用质谱检测，得成分物质峰；（5）定性分析。本发明首

权利要求

1.一种测定柿蒂配方颗粒中多成分的UPLC‑Q‑TOF‑MS方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取柿蒂配方颗粒，研细，精密称定，置瓶中，与溶剂混合，密塞，称定重量；所述溶剂为水、30％体积分数的甲醇水溶液、50％体积分数的甲醇水溶液、70％体积分数的甲醇水溶液或甲醇；

(2)将上述得到的柿蒂配方颗粒溶液超声破碎，放冷，再称定重量，用将上述溶剂补足减失的重量；

(3)将上述超声过的柿蒂配方颗粒溶液摇匀，离心，滤过，取续滤液，得到待测样品；

(4)用超高效液相色谱分离上述待测样品，将分离后的化学成分用质谱检测，得成分物质峰；色谱分离条件包括如下参数：CORTECS T3液相色谱柱，150mm×2.1mm，1.6μm；色谱柱柱温为25‑35℃；洗脱系统流动相A为乙腈溶液，B为体积浓度0.01‑0.2％甲酸水溶液；洗脱的流速为0.25‑0.35ml/min；进样体积为0.5‑2μL；检测波长为190‑400nm；测定方法用的检测器为DAD检测器；流动相梯度洗脱程序如下：质谱条件包括：离子源为双喷ESI离子源，干燥气温度300℃，流量8L/min，雾化器压力

35psi；正离子模式下毛细管电压4000V，负离子模式下毛细管电压3500V，毛细管出口电压

175V，锥孔电压65V；采用高分辨模式进行数据采集，质荷比采集范围m/z100～2000，采样速度1spectra/s，采样时间1000ms/spectra；

(5)用Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00软件对所述成分物质峰进行定性分析，测得柿蒂配方颗粒中的成分包括琥珀酸，腺苷，鸟苷，没食子酸，芦丁，原儿茶酸，原花青素B1，儿茶素，表儿茶素，果糖，金丝桃苷，异槲皮苷，没食子酰金丝桃苷异构体，没食子酰金丝桃苷，木犀草苷，三叶豆苷，山柰酚3‑O‑(6”‑没食子酰基)‑B‑D‑吡喃葡萄糖苷，吕宋果内酯，槲皮素和山柰酚。

2.根据权利要求1所述的测定柿蒂配方颗粒中多成分的UPLC‑Q‑TOF‑MS方法，其特征在于，步骤(1)中所述柿蒂配方颗粒的用量为每0.2g样品加入20‑100ml的溶剂。

3.根据权利要求1所述的测定柿蒂配方颗粒中多成分的UPLC‑Q‑TOF‑MS方法，其特征在于，步骤(2)中超声时间为15～60min；所述超声的功率为200～250W；所述超声的频率为30～50kHz。

4.根据权利要求1所述的测定柿蒂配方颗粒中多成分的UPLC‑Q‑TOF‑MS方法，其特征在于，步骤(3)中所述离心的转速为11000～13000rpm，离心的时间为8～15min。

5.根据权利要求1所述的测定柿蒂配方颗粒中多成分的UPLC‑Q‑TOF‑MS方法，其特征在于，步骤(3)中滤过时取续滤液采用的是微孔滤膜。

6.根据权利要求1所述的测定柿蒂配方颗粒中多成分的UPLC‑Q‑TOF‑MS方法，其特征在于，步骤(5)中定性分析步骤具体为：(1)从质谱总离子流图中提取出物质峰，得到精确的分子量；(2)根据化合物峰的一级质谱离子碎片信息搜索数据库，得到数据库中与筛选的物质相匹配的质谱碎片信息；(3)将加合离子类别、分子量误差、保留时间、相关文献和步骤(2)中得到的质谱碎裂信息结合分析，得到化合物的结构。

说明书

一种测定柿蒂中多成分的UPLC‑Q‑TOF‑MS方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种检测柿蒂成分的方法，尤其涉及一种测定柿蒂中多成分的UPLC‑Q‑TOF‑MS方法。

背景技术

[0002] 柿蒂为柿树科植物柿Diospyros kaki Thunb.的干燥宿萼，味苦、涩，性平(国家药典委员会.中华人民共和国药典：2020版一部[M].北京:中国医药科技出版社,2020：261.)。柿蒂具有悠久的药用历史及文献记载历史，主要分布在四川、广西、广东、山西、福建等地。
据研究发现，柿蒂富含多种活性物质和营养成分，具有降气止呃、抗氧化功能(周本宏,魏嫣,等.柿蒂总鞣质的抗氧化活性研究[J].广东药学院学报,2010,26(6):599‑601.)，临床上用于治疗顽固性和手术后呃逆，反流性胃炎等症状(乔玉萍,柯影,张会证.大剂量柿蒂煎汤口服治疗顽固性呃逆疗效观察[J].中医药学报,1999,27(5):1.)。还有研究表明柿叶和柿蒂为原料制取的制剂、茶、提取物具有清热解毒、清血利尿、抑菌、止血、降血脂、降低胆固醇、抑制肿瘤生长等药理作用(郑皓,鲁周民,刘月梅,等.柿叶的药理作用研究进展及开发利用现状[J].西北农林科技大学学报:自然科学版,2007,35(12):6.)。国外也有一些研究证明柿蒂提取物具有镇静和抗心律失常的作用(杜广门,尚建华,马孝本.柿蒂的抗心律失常作用和镇静作用的研究[J].中成药,1987.)。

[0003] 但是柿蒂的上述作用与其活性成分之间的关系至今还不清楚，对其有效成分的研究报道也较少，其中的药效物质基础的研究也不够深入。现有文献中，潘旭从柿蒂中分离得到了4个化合物：24‑羟基齐墩果酸、19α‑24‑二羟基乌苏酸、白桦酸和barbinervic acid(潘旭,具敬娥,贾娴,等.柿蒂化学成分的分离与鉴定[J].沈阳药科大学学报,2008,25(5):4.)；宋娟娜用反相离子对高效液相色谱法测定了柿蒂中熊果酸与齐墩果酸的含量(宋娟娜,李楠,刘景明,等.反相离子对高效液相色谱法测定柿叶和柿蒂中的熊果酸与齐墩果酸[J].中国药师,2012,15(3):3.)；郑一敏测定了柿蒂中金丝桃苷与齐墩果酸的含量(郑一敏,胥秀英,杨艳红,等.HPLC法测定柿蒂中金丝桃苷与齐墩果酸的含量[J].药学实践杂志,
2005,23(3):163‑165.)；蒋莺等采用紫外分光光度‑比色法检测柿蒂中三萜类化合物的含量(蒋莺,钟晓红,陆英,等.紫外分光光度‑比色法检测柿蒂中三萜类化合物的含量[J].湖南农业科学,2013(5):4.)；熊海涛用火焰原子吸收光谱法测定了柿蒂中的微量元素的含量(熊海涛,唐志华,郑行望.火焰原子吸收光谱法测定柿蒂中微量元素[J].理化检验(化学分册),2010,46(10):1211‑1212.)。

[0004] 由此可见，已有的针对柿蒂成分的研究大多停留在三萜类成分，目前还尚未有学者对柿蒂特别是其作为中药在实际应用中能够被人体利用的有效成分进行系统性的物质基础研究，也没有有关高效、快速测定柿蒂中有效成分的报道。

发明内容

[0005] 发明目的：本发明旨在提供一种高效、快速、准确测定柿蒂中多成分的UPLC‑Q‑TOF‑MS方法。

[0006] 技术方案：本发明所述的测定柿蒂中多成分的UPLC‑Q‑TOF‑MS方法，包括以下步骤：

[0007] (1)取柿蒂配方颗粒，研细，精密称定，置瓶中，与溶剂混合，密塞，称定重量；

[0008] (2)将上述得到的柿蒂超声破碎，放冷，再称定重量，用将上述溶剂补足减失的重量；

[0009] (3)将所述上述超声过的柿蒂溶液摇匀，离心，滤过，取续滤液，得到待测样品；

[0010] (4)用超高效液相色谱分离上述待测样品，将分离后的化学成分用质谱检测，得成分物质峰；

[0011] (5)用Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00软件对所述成分物质峰进行定性分析。

[0012] 优选地，步骤(1)中所述溶剂为水、30％体积分数的甲醇水溶液、50％体积分数的甲醇水溶液、70％体积分数的甲醇水溶液或甲醇；所述柿蒂配方颗粒的用量为每0.2g样品加入20‑100ml的溶剂。

[0013] 优选地，步骤(2)中所述超声时间为15～60min；所述超声的功率为200～250W；所述超声的频率为30～50kHz。

[0014] 优选地，步骤(3)中所述离心的转速为11000～13000rpm，离心的时间为8～15min；所述滤过时取续滤液采用的是微孔滤膜。

[0015] 优选地，步骤(4)中所述色谱分离条件包括如下参数：色谱柱柱温为25‑35℃；洗脱系统流动相A为乙腈溶液，B为体积浓度0.01‑0.2％甲酸水溶液；洗脱的流速为0.25‑0.35ml/min；进样体积为0.5‑2μL；检测波长为190‑400nm；所述测定方法是用的检测器为DAD检测器；所述流动相梯度洗脱程序如下：

[0016]

[0017] 优选地，步骤(5)中所述定性分析步骤具体为：(1)从质谱总离子流图中提取出物质峰，得到精确的分子量；(2)根据化合物峰的一级质谱离子碎片信息搜索数据库，得到数据库中与筛选的物质相匹配的质谱碎片信息；(3)将加合离子类别、分子量误差、保留时间、相关文献和步骤(2)中得到的质谱碎裂信息结合分析，得到化合物的结构。

[0018] 所述物质峰是质谱能够检测到的峰。

[0019] 所述的数据库包括TCM‑database等数据库和自建数据库。

[0020] 所述加合离子类别包括M+H，M+NH4，M+Na，M+K等。

[0021] 所述分子量误差为绝对值小于10ppm。

[0022] 有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明采用UPLC‑QTOF‑MS技术对柿蒂配方颗粒中多种化学成分进行检测并定性，所述方法具有高效、快速、准确的特点。且将新的化学成分的研究和药效学实验相结合，进行中药谱效学研究，实现柿蒂配方颗粒质量与药效的统一；本发明共鉴定出24种化学成分，为进一步研究柿蒂配方颗粒药效物质基础及全面质量控制提供了依据。

附图说明

[0023] 图1为实施例1中柿蒂配方颗粒的正、负离子模式下总离子流色谱图(TIC)；

[0024] 图2为实施例1中m/z 289.0718提取离子流色谱图(EIC)；

[0025] 图3为实施例1中m/z 289.0718一级质谱图(MS)；

[0026] 图4为实施例1中m/z 447.0936提取离子流色谱图(EIC)；

[0027] 图5为实施例1中m/z447.0936一级质谱图(MS)；

[0028] 图6为实施例2中m/z169.0145一级质谱图(EIC)；

[0029] 图7为实施例2中m/z169.0145提取离子流色谱图(MS)；

[0030] 图8为实施例2中m/z171.0283提取离子流色谱图(MS)。

具体实施方式

[0031] 下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

[0032] 实施例1

[0033] 1、仪器

[0034] Agilent1290超高效液相色谱仪(Agilent,Mississauga,Ontario,USA)和质谱Agilent UPLC‑QTOF‑MS(Agilent,Mississauga,Ontario,USA)。

[0035] 2、柿蒂配方颗粒化学成分的提取

[0036] (1)取本品适量，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为30％的甲醇水溶液25ml，密塞，称定重量。

[0037] (2)超声处理(功率250W，频率40kHz)15min，放冷。

[0038] (3)再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀。

[0039] (4)12000rpm离心10min，过0.22μm滤膜后即可进行分析。

[0040] 3、样品的分离和检测

[0041] 色谱条件：CORTECS T3液相色谱柱(150mm×2.1mm，1.6μm)；柱温为30℃；洗脱系统流动相流动相A为乙腈溶液，B为体积浓度0.1％甲酸水溶液；流速为0.3ml/min；进样体积为1μL；检测波长为254nm；所述测定方法是用的检测器为DAD检测器。

[0042] 梯度洗脱程序如表1所示

[0043] 表1流动相梯度洗脱参数

[0044]

[0045] 质谱条件：离子源为双喷ESI离子源，干燥气温度300℃，流量8L/min，雾化器压力35psi；正离子模式下毛细管电压4000V，负离子模式下毛细管电压3500V，毛细管出口电压
175V，锥孔电压65V；采用高分辨模式进行数据采集，质荷比采集范围m/z100～2000，采样速度1spectra/s，采样时间1000ms/spectra；正离子采用嘌呤(121.050873)和HP‑0921(922.009798)进行质量数实时校准；负离子采用TFANH4(112.985587)和HP‑0921(1033.988109)进行质量数实时校准，雾化压力5psi。

[0046] 4、柿蒂配方颗粒中多种化学成分的定性分析

[0047] 采用Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00软件对柿蒂配方颗粒中多种化学成分物质进行定性。共分离鉴定出24种化学成分，包括有机酸类、黄酮类等，具体结果如表2所示。其中黄酮和黄酮苷类成分是其主要成分之一，本发明中以儿茶素、表儿茶素、木犀草苷、三叶豆苷等为代表的黄酮和黄酮苷类成分在正、负极下响应均较明显，黄酮类成分以儿茶素为例(图2)，该化合物的保留时间11.532min，其分子离子峰为m/z289.0718[M‑H]‑(图3)，除了能看到一级质谱准分子离子峰，还能观察到m/z245.0818[M‑‑H‑CO2]‑、m/z179.0352[M‑H‑C6H6O2]的碎片峰(图3)，根据分子量、离子碎片信息及化合物数据库推测该化合物为儿茶素，其分子式为C15H14O6。黄酮苷类成分以三叶豆苷为例(图4)，该‑
化合物的保留时间16.772min，其分子离子峰为m/z447.0936[M‑H] (图5)，除了能看到一级‑
质谱准分子离子峰，还能观察到285.0414[M‑H‑gluA]、895.1946[2M‑H]‑的碎片峰(图5)，根据分子量、离子碎片信息及化合物数据库推测该化合物为三叶豆苷，其分子式为C21H20O11。UPLC‑Q‑TOF/MS技术分析柿蒂颗粒中化学成分如表2所示。

[0048] 表2基于UPLC‑Q‑TOF/MS技术分析柿蒂颗粒中化学成分

[0049]

[0050]

[0051] [1]张晓凯.柿蒂活性成分的研究[D].湖北中医学院,2008.

[0052] [2]ShaoqingZhu,ShengGuo,Jin‑aoDuan,DaweiQian,HuiYan,XiuxiuSha,ZhenhuaZhu,Der ek J.McPhee.UHPLC‑TQ‑MS Coupled with Multivariate Statistical Analysis to Characterize Nucleosides,Nucleobases and Amino Acids in AngelicaeSinensis Radix Obtained by Different Drying Methods[J].Molecules,2017,22(6).

[0053] [3]潘旭.柿蒂化学成分研究和脱镁叶绿酸a甲酯的结构修饰研究[D].沈阳药科大学,2007.

[0054] [4]中国科学院上海有机化学研究所.化学专业数据库[DB/OL].Http://www.organchem.csdb.cn.(1978‑2021).

[0055] 实施例2

[0056] 1、仪器

[0057] Agilent1290超高效液相色谱仪(Agilent,Mississauga,Ontario,USA)和质谱Agilent UPLC‑QTOF‑MS(Agilent,Mississauga,Ontario,USA)。

[0058] 2、柿蒂配方颗粒化学成分的提取

[0059] (5)取本品适量，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为30％的甲醇水溶液50ml，密塞，称定重量。

[0060] (6)超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，放冷。

[0061] (7)再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀。

[0062] (8)13000rpm离心15min，过0.22μm滤膜后即可进行分析。

[0063] 3、样品的分离和检测

[0064] 色谱条件：CORTECS T3液相色谱柱(150mm×2.1mm，1.6μm)；柱温为30℃；洗脱系统流动相流动相A为乙腈溶液，B为体积浓度0.1％甲酸水溶液；流速为0.3ml/min；进样体积为1μL；检测波长为254nm；所述测定方法是用的检测器为DAD检测器。

[0065] 梯度洗脱程序同实施例1。

[0066] 质谱条件：离子源为双喷ESI离子源，干燥气温度300℃，流量8L/min，雾化器压力35psi；正离子模式下毛细管电压4000V，负离子模式下毛细管电压3500V，毛细管出口电压
175V，锥孔电压65V；采用高分辨模式进行数据采集，质荷比采集范围m/z100～2000，采样速度1spectra/s，采样时间1000ms/spectra；正离子采用嘌呤(121.050873)和HP‑0921(922.009798)进行质量数实时校准；负离子采用TFANH4(112.985587)和HP‑0921(1033.988109)进行质量数实时校准，雾化压力5psi。

[0067] 4、柿蒂配方颗粒中多种化学成分的定性分析

[0068] 采用Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00软件对柿蒂配方颗粒中多种化学成分物质进行定性。共分离鉴定出24种化学成分，包括有机酸类、黄酮类等，具体结果如表2所示。其中有机酸类成分是其主要成分之一，本发明中没食子酸、原儿茶酸均为有机酸类成分，以没食子酸为例(图6)，没食子酸在正负极下响应均较明显，在负里子模式下，该化合物的保留时间3.439min，其分子离子峰为m/z169.0145[M‑H]‑(图7)，除了能看到一级质谱准分子离子峰，还能观察到m/z125.0244、m/z153.0195的碎片峰，在正离子模式+下，能观察到m/z171.0283[M+H]的碎片例子(图8)，除了能看到一级质谱准分子离子峰，还能观察到m/z127.0385、136.0615的碎片峰，根据分子量、离子碎片信息及化合物数据库推测该化合物为没食子酸，其分子式为C7H6O5。