一种适用于连续分析多种棕榈酰基肽的HPLC分析方法转让专利
申请号 : CN202211227514.1
文献号 : CN115453005B
文献日 : 2023-06-02
发明人 : 王海梅 , 张志乾 , 王嘉鹏 , 吴奕瑞 , 朱家平 , 傅玮 , 江翱 , 邱益 , 王帆 , 崔华 , 谭洪群 , 郭羽 , 苏立俊
申请人 : 广州市乾相生物科技有限公司 , 态创生物科技(广州)有限公司
摘要 :
本发明涉及一种适用于连续分析多种棕榈酰基肽的HPLC分析方法,其特征在于:第一步:配制一个或多个待测棕榈酰基肽样品的溶液,所述棕榈酰基肽样品可以是单一种棕榈酰基肽或多种棕榈酰基肽的混合物;第二步:根据配制的待测棕榈酰基肽样品的种类,设定液相色谱条件;第三步:配制分析用流动相;第四步:采用分析程序对其中一个待测棕榈酰基肽样品进行测定;第五步:采用流动相B清洗色谱柱1~5min;第六步:重复第四步和第五步,对其他未测的待测棕榈酰基肽样品依次进行测定。本发明的适用于连续分析多种棕榈酰基肽的HPLC分析方法可以连续地分析多种棕榈酰基肽以及连续地对多个未知浓度的棕榈酰基肽样品进行浓度测定。
权利要求 :
1.一种适用于连续分析多种棕榈酰基肽的HPLC分析方法,其特征在于:第一步:配制多个待测棕榈酰基肽样品的溶液;
第二步:根据配制的待测棕榈酰基肽样品的种类,设定液相色谱条件;
第三步: 配制分析用流动相;
第四步: 采用分析程序对其中一个待测棕榈酰基肽样品进行测定;
第五步: 采用流动相B清洗色谱柱1 5min;
~
第六步: 重复第四步和第五步,对其他未测的待测棕榈酰基肽样品依次进行测定;
其中:
对于所述分析用流动相,流动相A为20mM KH2PO4水溶液; 流动相B为甲醇;
分析程序为等度洗脱,洗脱浓度: 流动相A:20% ,流动相B:80%;
采用填料为C18的色谱柱;
所述棕榈酰基肽为棕榈酰三肽‑1、棕榈酰三肽‑5、棕榈酰三肽‑8、棕榈酰四肽‑7和棕榈酰五肽‑4。
2.根据权利要求1所述的适用于连续分析多种棕榈酰基肽的HPLC分析方法,其特征在于:所述待测棕榈酰基肽样品依照如下比例进行配制,称取0.001 0.030g棕榈酰基肽,加入~
8.5mL甲醇,再加入0.2mL磷酸,所述棕榈酰基肽溶解后加入超纯水补充至10mL,或者称取
0.001 0.030g棕榈酰基肽,加入10mL超纯水溶解,溶解后即得浓度为0.0001 0.0030g/ml的~ ~所述待测棕榈酰基肽样品的溶液。
3.根据权利要求1或2所述的适用于连续分析多种棕榈酰基肽的HPLC分析方法,其特征在于:波长范围为200 300nm。
~
4.根据权利要求1或2所述的适用于连续分析多种棕榈酰基肽的HPLC分析方法,其特征在于:流速为1 mL/min 。
5.根据权利要求1或2所述的适用于连续分析多种棕榈酰基肽的HPLC分析方法,其特征在于:色谱柱柱温为室温,进样量为8 15μL,进样器温度为环境温度,待测样品采集时间为~
10 30min。
~
说明书 :
一种适用于连续分析多种棕榈酰基肽的HPLC分析方法
技术领域
[0001] 本发明属于分析化学领域,具体涉及一种适用于连续分析多种棕榈酰基肽的高效液相色谱(HPLC)分析方法。
背景技术
[0002] 现有技术中,对于肽类的HPLC分析方法已有很多报道,然而,关于棕榈酰基肽的分析方法鲜有报道。棕榈酰基肽由于较正常肽类多了一个棕榈酰基修饰,导致肽本身的性质发生了较大变化,通常用的肽类分析方法已不再适用于棕榈酰基肽。现有技术文件CN106546673A中公开了一种利用高效液相色谱法分离棕榈酰五胜肽‑3的方法,然而,该方法为了改善色谱峰峰形和分离效果,在流动相里添加三氟乙酸。这样会导致最终产品中酸类或三氟乙酸有残留,使产品呈现酸性并能闻到明显的酸味,而一些肽类实际在酸性条件下并不稳定,影响其储存时间。再者,由于三氟乙酸是强酸,对色谱柱的耐受性有很高要求,一般色谱柱无法承受强酸,需采用强化型色谱柱。
[0003] 此外,现有技术中也鲜有使用一种通用的HPLC方法进行多种肽的连续分析测定。一般是每种肽对应一个专一的方法,不仅使得流动相配制工作繁琐,而且所需试剂种类繁多,无论从管理上还是从所需空间上都需要很大的投入。例如:肽1用的流动相是甲醇和水,而用的分析程序是程序1,用的色谱柱是硅胶柱,分析时间为10min;而肽2用的流动相是乙腈和水,而用的分析程序是程序2,用的色谱柱为十八烷基柱,分析时间为10min。当分析完肽1后切换成分析肽2时,不仅要对硅胶柱进行清洗,然后换成十八烷基柱,更要配制乙腈和水流动相,再对十八烷基柱进行前期清洗,而后再对其进行平衡,这就需要花费大概2小时的时间。然而分析时间其实只需要10min,这前后会造成大量的时间成本浪费。如果能对其方法进行统一,由于更换方法导致的2小时的浪费时间里还可以分析12个样品。
[0004] 已有相关文献报道:不同的肽类使用不同的流动相,如:乙腈或甲醇与水的配比从而达到分离的目的。同时也有使用纯有机试剂或无机盐的相关报道。但这些方法均只能满足一种肽或蛋白,并不通用于大部分肽类或蛋白质类。在以往的工作中,肽类分析时很容易出现几种肽不能完全分离的情况,而在分析肽类含量时又要求必须完全分离,否则无法准确计算肽的含量。同时,分析多种肽类时通常每种肽对应一种方法,包括分析程序,流动相成分及配比。使得操作步骤复杂繁琐。
[0005] 本发明人经过长期深入的研究,发现了一种可以连续分析多种棕榈酰基肽的HPLC分析方法,其采用特定流动相即用三乙胺调节至特定pH的磷酸溶液。然而,虽然该方法,可以连续地分析分析多种棕榈酰基肽,但仍然存在一些缺陷。例如,通过该方法连续测量棕榈酰三肽‑1等时,理论塔板数比较低,虽然也可以得到线性图形,但误差较大。理论塔板数是色谱的柱效参数之一,用于定量表示色谱柱的分离效率。当色谱柱长度相同时,理论塔板数越大说明柱效越高,峰形越好,相应地,可以获得更加准确的线性图形,从而为未知样品中棕榈酰基肽的含量测定提供更加准确的标准曲线。
[0006] 因此,亟待研究探寻一种更加通用的高效液相色谱法,不仅对更多种类的棕榈酰基肽具有普适性,而且还可以提供更好的峰形以获得更高的理论塔板数,从而能够为未知浓度样品中棕榈酰基肽的含量测定提供更加准确的标准曲线,进而可以实现连续地对多个未知浓度样品中棕榈酰基肽的含量进行测定。
发明内容
[0007] 发明要解决的问题
[0008] 针对现有技术存在的问题,本发明的目的之一是解决对多种棕榈酰基肽样品连续进行HPLC方法分析测定时,需要更换或清洗色谱柱、更换流动相、重新进行平衡等工序,造成时间成本上的浪费的问题。
[0009] 本发明的再一目的是对多种棕榈酰基肽样品连续进行HPLC方法分析测定方法的优化,该方法提供了更好的峰形以获得更高的理论塔板数,从而能够为未知样品中棕榈酰基肽的含量测定提供更加准确的标准曲线,使得可以连续地对多个未知浓度样品中棕榈酰基肽的含量进行测量。
[0010] 此外,本发明解决现有技术中为了改善色谱峰峰形添加的三氟乙酸对色谱柱的负担的问题。
[0011] 用于解决问题的方案
[0012] 本发明涉及:
[0013] 1、一种适用于连续分析多种棕榈酰基肽的HPLC分析方法,其特征在于:
[0014] 第一步:配制一个或多个待测棕榈酰基肽样品的溶液,所述棕榈酰基肽样品可以是单一种棕榈酰基肽或多种棕榈酰基肽的混合物;
[0015] 第二步:根据配制的待测棕榈酰基肽样品的种类,设定液相色谱条件;
[0016] 第三步:配制分析用流动相;
[0017] 第四步:采用分析程序对其中一个待测棕榈酰基肽样品进行测定;
[0018] 第五步:采用流动相B清洗色谱柱1~5min;
[0019] 第六步:重复第四步和第五步,对其他未测的待测棕榈酰基肽样品依次进行测定;
[0020] 其中:
[0021] 对于所述分析用流动相,流动相A为20mM KH2PO4水溶液;流动相B为甲醇;
[0022] 分析程序为等度洗脱,洗脱浓度:流动相A:20%,流动相B:80%。
[0023] 2、根据项目1所述的适用于连续分析多种棕榈酰基肽的HPLC分析方法,其特征在于:所述待测棕榈酰基肽样品依照如下比例进行配制,称取0.001~0.030g棕榈酰基肽,根据需要加入0~8.5mL甲醇,再加入0.2mL磷酸,所述棕榈酰基肽溶解后加入超纯水补充至10mL,溶解后即得浓度为0.0001~0.0030g/ml的所述待测棕榈酰基肽样品的溶液。
[0024] 3、根据项目1或2所述的适用于连续分析多种棕榈酰基肽的HPLC分析方法,其特征在于:波长范围为200~300nm。
[0025] 4、根据项目1或2所述的适用于连续分析多种棕榈酰基肽的HPLC分析方法,其特征在于:色谱柱为填料为C18的色谱柱,流速为1mL/min。
[0026] 5、根据项目1或2所述的适用于连续分析多种棕榈酰基肽的HPLC分析方法,其特征在于:色谱柱柱温为室温,进样量为8~15μL,进样器温度为环境温度,待测样品采集时间为10~30min。
[0027] 6、根据项目1或2所述的适用于连续分析多种棕榈酰基肽的HPLC分析方法,其特征在于:所述棕榈酰基肽为棕榈酰三肽‑1、棕榈酰三肽‑5、棕榈酰三肽‑8、棕榈酰四肽‑7、棕榈酰五肽‑4。
[0028] 发明的效果
[0029] 本发明发现了一种适用于连续分析多种棕榈酰基肽的HPLC分析方法,将多种棕榈酰基肽的分析方法统一化,减少分析时人力和物力的消耗。不同的棕榈酰基肽分析时无需更换色谱柱,仅需对色谱柱进行清洗即可,无需改变检测波长,也无需改变色谱柱温度,更无需重新配制流动相和重新进行脱气,就可以实现对多种棕榈酰基肽的分析和纯度计算。
[0030] 其次,本发明的适用于连续分析多种棕榈酰基肽的HPLC分析方法,在实现对多种棕榈酰基肽的连续分析测定的同时,改善了峰形,在不添加三氟乙酸的情况下,当色谱柱长度相同时,理论塔板数大幅提高,从而获得更加准确的线性图形,为未知样品中棕榈酰基肽的含量测定提供更加准确的标准曲线,从而可以实现连续地对未知浓度的多种棕榈酰基肽进行标定。
[0031] 本发明的适用于连续分析多种棕榈酰基肽的HPLC分析方法操作简单,连续分析测定多种棕榈酰基肽时,节约大量的时间成本和经济成本,大大简化了操作的复杂性。该技术可大大节省流动相配制的时间和切换肽类分析时所消耗的等待时间,不仅能够节省时间成本,同时也可节省流动相储存及色谱瓶储存所占用的空间和配制及切换过程中劳动力的消耗,从而使得利用此方法更利于全程自动化的实现。
附图说明
[0032] 图1为实施例1中的棕榈酰三肽‑1的HPLC色谱图。
[0033] 图2为实施例1中的棕榈酰三肽‑1的标曲图。
[0034] 图3为实施例2中的棕榈酰三肽‑5的HPLC色谱图。
[0035] 图4为实施例2中的棕榈酰三肽‑5的标曲图。
[0036] 图5为实施例3中的棕榈酰三肽‑8的HPLC色谱图。
[0037] 图6为实施例3中的棕榈酰三肽‑8的标曲图。
[0038] 图7为实施例4中的棕榈酰四肽‑7的HPLC色谱图。
[0039] 图8为实施例4中的棕榈酰四肽‑7的标曲图。
[0040] 图9为实施例5中的棕榈酰五肽‑4的HPLC色谱图。
[0041] 图10为实施例5中的棕榈酰五肽‑4的标曲图。
[0042] 图11为比较例1的棕榈酰三肽‑1的HPLC色谱图。
[0043] 图12为比较例2的棕榈酰三肽‑5的HPLC色谱图。
[0044] 图13为比较例3的棕榈酰五肽‑4的HPLC色谱图。
具体实施方式
[0045] 本发明的适用于连续分析多种棕榈酰基肽的HPLC分析方法包括以下步骤:
[0046] 第一步:配制一个或多个待测棕榈酰基肽样品的溶液,所述棕榈酰基肽样品可以是单一种棕榈酰基肽或多种棕榈酰基肽的混合物;
[0047] 第二步:根据配制的待测棕榈酰基肽样品的种类,设定液相色谱条件;
[0048] 第三步:配制分析用流动相;
[0049] 第四步:采用分析程序对其中一个待测棕榈酰基肽样品进行测定;
[0050] 第五步:采用流动相B清洗色谱柱1~5min;
[0051] 第六步:重复第四步和第五步,对其他未测的待测棕榈酰基肽样品依次进行测定。
[0052] 所述棕榈酰基肽可以为但不限于例如棕榈酰三肽‑1、棕榈酰三肽‑5、棕榈酰三肽‑8、棕榈酰四肽‑7、棕榈酰五肽‑4等。
[0053] 流动相为:A相:20mM KH2PO4水溶液;B相:甲醇。分析程序为等度洗脱,洗脱浓度:流动相A:20%,流动相B:80%。选择该范围能够获得最好分析效果。其它范围的流动相虽然也可达到分析效果,但分析效果和分析效率差于该流动相所能达到的效果。
[0054] 所述待测棕榈酰基肽样品的浓度为0.0001~0.0030g/ml。与现有技术相比,连续测量的浓度范围得到了大幅提高,并且在该测定范围内,为使目标肽的峰能够完全显现,肽浓度不宜过高,否则会导致目标峰封顶,从而即使在峰顶处有杂峰出现也无法判断;但浓度也不能太低,否则即使有杂峰出现时,由于峰高过低会被误判断为基线不平所致。所以待测棕榈酰基肽样品的浓度为0.0001~0.0030g/ml。
[0055] 棕榈酰基肽不同于普通的短肽,因为结构上较普通肽多了一个棕榈酰基(十六碳酰基)修饰,从而使得肽本身的性质发生了很大的变化,即从水溶性变为脂溶性,但也有极少数肽因为本身氨基酸亲水性强于棕榈酰基疏水性,即使带有棕榈酰基仍然表现为水溶性,如棕榈酰三肽‑5。HPLC测定要求棕榈酰基肽完全溶解才能检测,但大部分棕榈酰基肽无法溶于水,在溶剂选择上既要考虑肽能够完全溶解,又要考虑所选溶剂本身对肽的分析不会有影响,即溶剂本身的光吸收与肽的光吸收不会重叠,还要考虑溶剂不会对HPLC分析系统造成腐蚀。因此,HPLC分析时,棕榈酰基肽样品的配制变得尤为重要。
[0056] 所述待测棕榈酰基肽样品依照如下比例进行配制:称取0.001~0.030g棕榈酰基肽,根据需要加入0~8.5mL甲醇,再加入0.2mL磷酸,所述棕榈酰基肽溶解后加入超纯水补充至10mL,即得0.0001~0.0030g/ml的所述待测棕榈酰基肽样品的溶液。特别地称取棕榈酰三肽‑5 0.001~0.030g,溶于10mL超纯水,溶解后即得浓度为0.0001~0.0030g/ml的所述待测棕榈酰三肽‑5样品的溶液。
[0057] 检测波长由待测的肽类本身性质所决定,不受分析条件影响。但优选波长范围为200~300nm,更优选210~230nm、260~280nm,特别优选215nm。原因是:对所有棕榈酰基肽进行全波长扫描,大多数棕榈酰基肽均在215nm有较强的光吸收,故最优选215nm作为HPLC分析的检测波长。
[0058] 色谱柱为常规使用的色谱柱,优选填料为C18的色谱柱,例如Agilent ZORBAX SB‑C18。
[0059] 采用等度洗脱,洗脱浓度:A相20%;B相80%。
[0060] 流速一般设定为0.3~5mL/min,优选1mL/min。
[0061] 色谱柱柱温为25℃,进样量为10~15μL,优选10μL。
[0062] 进样器温度为环境温度,待测样品采集时间为10~30min,优选15min。
[0063] 下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述说明。
[0064] 以下结合附图,通过实施例进一步说明本发明,但不作为对本发明的限制。但是,应理解,这些实施例仅仅是示例性的,并不意图限制本发明。如无特殊说明,本发明的实施例中所采用的原材料均为本领域常用的原材料,实施例中所采用的方法,均为本领域的常规方法。
[0065] 实施例
[0066] 仪器与条件:
[0067] 采用Agilent1260InfinityII LC高效液相色谱仪及OpenLabCDS2软件系统;以Agilent ZORBAX SB‑C18(250×4.6mm)为分离柱,柱温25℃;紫外检测波长为215nm。
[0068] 实验步骤:
[0069] 将榈酰三肽‑1(实施例1)、棕榈酰三肽‑8(实施例3)和棕榈酰四肽‑7(实施例4)以0.002g、0.004g、0.006g、0.008g、0.01g的量,棕榈酰三肽‑5(实施例2,比较例1)和棕榈酰五肽‑4(实施例5,比较例2)以0.005g、0.010g、0.015g、0.020g、0.030g的量分别称取五组样品。将称取的棕榈酰三肽‑1(实施例1)、棕榈酰三肽‑8(实施例3)、棕榈酰四肽‑7(实施例4)、棕榈酰五肽‑4(实施例5)的各组样品中的各样品,分别加入8.5mL甲醇,再加入0.2mL磷酸,溶解后加入超纯水补充至10mL,即得各组样品的0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L的肽溶液或0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L、3.0g/L的肽溶液。将称取的0.005g、0.010g、
0.015g、0.020g、0.030g的棕榈酰三肽‑5分别溶于10mL超纯水,溶解后即得棕榈酰三肽‑5的
0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L、3.0g/L的肽溶液。以上五种肽均为经北京百态派克生物科技有限公司验证肽序和分子量的源自态创生物科技(广州)有限公司的产品。
0.015g、0.020g、0.030g的棕榈酰三肽‑5分别溶于10mL超纯水,溶解后即得棕榈酰三肽‑5的
0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L、3.0g/L的肽溶液。以上五种肽均为经北京百态派克生物科技有限公司验证肽序和分子量的源自态创生物科技(广州)有限公司的产品。
[0070] 流动相:A:20mM KH2PO4水溶液;B:甲醇,HPLC级。
[0071] 洗脱浓度:流动相A:20%,流动相B:80%。
[0072] 流速:1.0mL/min。
[0073] 温度:25℃。
[0074] 进样量:10uL。
[0075] 分析程序:等度洗脱;洗脱浓度:流动相A:20%,流动相B:80%。
[0076] 按照上述色谱条件连续对实施例1~5进行高效液相色谱分析,记录色谱图,而在更换测试样品进行测试时,除了使用甲醇对色谱柱进行清洗之外,中间没有进行更换色谱柱、改变检测波长、改变色谱柱温度等操作,更无需进行重新配制流动相和重新进行脱气等操作。
[0077] 实施例1.棕榈酰三肽‑1的分析
[0078] 参照以上分析条件,对本公司产品棕榈酰三肽‑1的浓度分别为0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L的肽溶液进行HPLC分析,结果如图1所示,其线性标曲图如图2所示。
各浓度的棕榈酰三肽‑1的保留时间和理论塔板数如下表所示。
各浓度的棕榈酰三肽‑1的保留时间和理论塔板数如下表所示。
[0079]浓度g/L 保留时间min 单位理论塔板数
0.2 2.592 9699.77
0.4 2.592 9081.18
0.6 2.580 8605.70
0.8 2.579 8141.41
1.0 2.606 7727.90
0.2 2.592 9699.77
0.4 2.592 9081.18
0.6 2.580 8605.70
0.8 2.579 8141.41
1.0 2.606 7727.90
[0080] 实施例2.棕榈酰三肽‑5的分析
[0081] 参照以上分析条件,对本公司产品棕榈酰三肽‑5的浓度分别为0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、3g/L的肽溶液进行HPLC分析,结果如图3所示,其线性标曲图如图4所示。各浓度的棕榈酰三肽‑5的保留时间和理论塔板数如下表所示。
[0082]浓度g/L 保留时间min 单位理论塔板数
0.5 14.894 4308.39
1.0 14.835 3844.97
1.5 14.719 3324.51
2.0 14.597 3346.70
3.0 14.241 3305.75
0.5 14.894 4308.39
1.0 14.835 3844.97
1.5 14.719 3324.51
2.0 14.597 3346.70
3.0 14.241 3305.75
[0083] 实施例3.棕榈酰三肽‑8的分析
[0084] 参照以上分析条件,对本公司产品榈酰三肽‑8的浓度分别为0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L的肽溶液进行HPLC分析,结果如图5所示,其线性标曲图如图6所示。
各浓度的榈酰三肽‑8的保留时间和理论塔板数如下表所示。
各浓度的榈酰三肽‑8的保留时间和理论塔板数如下表所示。
[0085]浓度g/L 保留时间min 单位理论塔板数
0.2 11.890 8702.97
0.4 11.790 7128.74
0.6 11.723 6084.31
0.8 11.656 5275.24
1.0 11.605 4771.69
0.2 11.890 8702.97
0.4 11.790 7128.74
0.6 11.723 6084.31
0.8 11.656 5275.24
1.0 11.605 4771.69
[0086] 实施例4.棕榈酰四肽‑7的分析
[0087] 参照以上分析条件,对本公司产品棕榈酰四肽‑7的浓度分别为0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L的肽溶液进行HPLC分析,结果如图7所示,其线性标曲图如图8所示。
各浓度的棕榈酰四肽‑7的保留时间和理论塔板数如下表所示。
各浓度的棕榈酰四肽‑7的保留时间和理论塔板数如下表所示。
[0088]浓度g/L 保留时间min 单位理论塔板数
0.2 13.934 10633.37
0.4 13.963 8519.72
0.6 13.952 10417.15
0.8 13.956 10259.01
1.0 13.967 10094.72
0.2 13.934 10633.37
0.4 13.963 8519.72
0.6 13.952 10417.15
0.8 13.956 10259.01
1.0 13.967 10094.72
[0089] 实施例5.棕榈酰五肽‑4的分析
[0090] 参照以上分析条件,对本公司产品棕榈酰五肽‑4的浓度分别为0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L、3.0g/L的肽溶液进行HPLC分析,结果如图9所示,其线性标曲图如图10所示。各浓度的棕榈酰五肽‑4的保留时间和理论塔板数如下表所示。
[0091]浓度g/L 保留时间min 单位理论塔板数
0.5 11.119 6991.48
1.0 11.069 6234.31
1.5 10.985 5140.46
2.0 10.909 4459.21
3.0 10.772 3587.07
0.5 11.119 6991.48
1.0 11.069 6234.31
1.5 10.985 5140.46
2.0 10.909 4459.21
3.0 10.772 3587.07
[0092] 比较例1
[0093] 除了将流动相A:20mM KH2PO4水溶液替换成用三乙胺调pH至3.5的0.2%磷酸水溶液之外,用以与实施例1相同的方式,对棕榈酰三肽‑1样品的1.0g/L的肽溶液进行了HPLC分析,结果如图11所示,保留时间和理论塔板数分别为9.585min和941.18。
[0094] 比较例2
[0095] 除了将流动相A:20mM KH2PO4水溶液替换成用三乙胺调pH至3.5的0.2%磷酸水溶液之外,用以与实施例2相同的方式,对棕榈酰三肽‑5样品的1.0g/L的肽溶液进行了HPLC分析,结果如图12所示。
[0096] 比较例3
[0097] 除了将流动相A:20mM KH2PO4水溶液替换成用三乙胺调pH至3.5的0.2%磷酸水溶液之外,用以与实施例5相同的方式,对棕榈酰五肽‑4样品的1.0g/L的肽溶液进行HPLC分析,结果如图13所示,保留时间和理论塔板数分别为9.287min和1109.23。
[0098] 从实施例1和比较例1,实施例2和比较例2,以及实施例5和比较例3的比较结果可以看出,采用本发明的HPLC方法进行分析测定时,理论塔板数得到了大幅提高,峰形得到极大的改善,而且应用的浓度范围明显提高,并且得到了很好的线性。
[0099] 该结果表明:采用本发明的适用于连续分析多种棕榈酰基肽的HPLC分析方法除了可以连续地分析多种棕榈酰基肽之外,基于本方法的标准曲线,还可以连续地对多个未知浓度的棕榈酰基肽样品进行浓度测定。
[0100] 本发明的技术可大大节省流动相配制的时间和切换肽类分析时所消耗的等待时间,不仅能够节省时间成本,同时也可节省流动相储存及色谱瓶储存所占用的空间和配制及切换过程中劳动力的消耗,从而使得利用此方法更利于全程自动化的实现。
[0101] 用本发明的适用于连续分析多种棕榈酰基肽的HPLC分析方法,对于实施例1~5的五种棕榈酰基肽,分析方法完全统一,在每种棕榈酰基肽均能得到很好的验证,而且可以连续测量大量的样品,从而可以满足工业上的批量测量。
[0102] 综上可知,本发明的适用于连续分析多种棕榈酰基肽的HPLC分析方法操作简单,连续分析测定多种棕榈酰基肽时,节约大量的时间成本和经济成本,大大简化了操作的复杂性,对棕榈酰基肽类具有普适性。