实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器及其应用

摘要

本发明提供一种实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器及其应用，纳米传感器包括基底结构和传感单元；所述基底结构为由四条单链DNA经碱基互补配对形成的四面体框架结构，并能穿越活细胞膜；四个所述传感单元分别连接在所述基底结构的四个端点处；所述传感单元包括在ATP参与下发生分子置换反应的碱基对；所述传感单元发生分子置换之前，传感单元在特定波长的激发光照射下无荧光信号发出；所述传感单元发生分子置换之后，传感单元能在特定波长的激发光照射下发出荧光信号。本发明的一个技术效果在于，结构设计合理，其能够在不毒性损伤活细胞的前提下实时监测活细胞内ATP动态变化，操作方便。

权利要求

1.一种实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器的应用，其特征在于，所述纳米传感器包括：基底结构，所述基底结构为由四条单链DNA经碱基互补配对形成的四面体框架结构，并能穿越活细胞膜；基底结构的水动力直径维持在10nm‑15nm之间；基底结构的峰值水动力尺寸为8nm；

传感单元，所述传感单元由具有荧光基团修饰的ATP适配体核酸链与具有淬灭基团修饰的短链通过碱基互补配对结合而成；所述传感单元通过ATP适配体核酸链能够特异性地识别并结合ATP并与其发生分子置换反应，且淬灭基团修饰的短链从所述传感单元上脱离；

基底结构的四个端点处额外添加了15个poly‑T的碱基；传感单元的ATP适配体核酸链额外添加了15个poly‑A的碱基；

四个所述传感单元分别连接在所述基底结构的四个端点处；所述传感单元包括在ATP参与下发生分子置换反应的碱基对；

所述传感单元发生分子置换之前，荧光基团和猝灭基团之间发生共振能量转移，荧光基团在特定波长的激发光照射下无荧光信号发出；

所述传感单元发生分子置换之后，荧光基团能在特定波长的激发光照射下发出荧光信号；

四条单链DNA的摩尔数相同；

具有淬灭基团修饰的短链的长度小于具有荧光基团修饰的ATP适配体核酸链的长度；

所述基底结构上最远两点之间的距离为5nm‑15nm；

所述纳米传感器还包括连接短链，所述连接短链的一端连接所述基底结构的端点，另一端连接传感单元；所述连接短链包括多个碱基；

所述纳米传感器的应用包括如下步骤：

将纳米传感器与活细胞孵育培养，纳米传感器被被胞吞进入活细胞内；

当纳米传感器的传感单元检测到活细胞内的ATP后，传感单元发生分子置换反应；其中，传感单元的具有荧光基团修饰的ATP适配体核酸链特异性地识别并结合ATP，具有淬灭基团修饰的短链从所述传感单元上脱离；

在特定波长的激发光照射下，活细胞内结合有ATP的传感单元出荧光信号；

通过荧光显微镜对荧光信号进行观察，并通过酶标仪对荧光信号进行检测，以获取活细胞内ATP动态变化的实时监测结果。

2.根据权利要求1所述的实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器的应用，其特征在于，所述活细胞为细胞系；或者，所述活细胞为来源于活体组织的原代细胞或干细胞；或者，所述活细胞为干细胞培养后的类器官。

3.根据权利要求1所述的实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器的应用，其特征在于，通过荧光显微镜对荧光信号进行观察，包括：将活细胞放在共聚焦培养皿中培养过夜，并将稀释后的纳米传感器与活细胞在37℃无血清培养基中孵育2‑4小时，对处理后的活细胞进行保存，并采用共聚焦显微镜成像。

4.根据权利要求1所述的实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器的应用，其特征在于，通过酶标仪对荧光信号进行检测，包括：将活细胞接种到细胞培养板中培养过夜；用无血清培养基将纳米传感器稀释至10nM并与细胞孵育，每预设时间检测一次激发波长为530nm，发射波长为570nm的荧光信号的荧光强度，并形成ATP波动变化曲线。

说明书

实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于活细胞内ATP动态变化的监测技术领域，具体涉及一种实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器及其应用。

背景技术

[0002] 作为细胞内的能量货币，三磷酸腺苷 (ATP) 在许多细胞过程中例如细胞凋亡、细胞坏死和细胞毒性状态均起着关键作用。ATP是一种重要的调节因子，可以动态调节细胞活力和代谢活性。细胞内ATP的异常变化与许多疾病的发生和发展有关。因此，检测细胞内ATP的变化不仅可以作为基因通路或细胞生长状态的测量手段，而且可以作为追踪疾病进展和治疗效果的有效追踪工具。

[0003] 各种检测ATP方法的出现，促进了ATP检测试剂盒的商业化。但其在使用之前需要溶解细胞，只能检测到某时某刻下细胞的ATP值。显而易见，此种方法是非常不灵活的。这种方法有一个重要的缺陷，就是不能检测活细胞中ATP值的变化。而无论是在前沿研究中，还是重大疾病的监测诊疗中，细胞内ATP的变化是一直在持续发生的。传统的ATP检测试剂盒对于实时监测活细胞内ATP的动态变化是难以实现的。

[0004] 目前，尚无在活细胞中长期实时监测活细胞内ATP的公开技术。但是，在细胞系中进行实时的ATP监测主要有以下两类技术：

[0005] （1）特异性针是对ATP检测的各类荧光探针，通过与各类化合物的结合，而识别细胞内特定细胞器，例如溶酶体线粒体等，其荧光强度根据ATP与荧光探针在特定基团或化学键上的结合而变化，从而指示出检测到的细胞内的ATP。但是这类方法有较大的三个缺陷。首先由于引入了外来的化合物成分，导致其会造成不同程度的细胞损伤。浓度越高，或者其在活细胞内孵育的时间越久，损伤就越严重。其次这些荧光探针能够进入细胞的效率不高，导致其有大部分无法进入到细胞内部，检测效率较低。最后荧光探针极容易造成脱靶现象，特异性不强，且价格昂贵，从而造成荧光探针应用率不高。上述的缺陷决定了这种方式无法大规模的进行应用，因此只能用于有限的科研场合。

[0006] （2）ATP靶向适配体与各种纳米材料的结合，极大地解决了上述第一种方法中特异性不强以及进入细胞的通透性低的问题。但这种方法的致命缺陷在于：同第一种方法一样，由于引入了外来的纳米材料的成分，造成了整体结构与细胞的生物相容性低，因此不可避免对细胞带来一定程度的损伤。

发明内容

[0007] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器及其应用的新技术方案。

[0008] 根据本发明的第一方面，提供了一种实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器，包括：

[0009] 基底结构，所述基底结构为由四条单链DNA经碱基互补配对形成的四面体框架结构，并能穿越活细胞膜；

[0010] 传感单元，四个所述传感单元分别连接在所述基底结构的四个端点处；所述传感单元包括在ATP参与下发生分子置换反应的碱基对；

[0011] 所述传感单元发生分子置换之前，传感单元在特定波长的激发光照射下无荧光信号发出；

[0012] 所述传感单元发生分子置换之后，传感单元能在特定波长的激发光照射下发出荧光信号。

[0013] 可选地，四条单链DNA的摩尔数相同。

[0014] 可选地，所述传感单元由具有荧光基团修饰的ATP适配体核酸链与具有淬灭基团修饰的短链通过碱基互补配对结合而成；所述传感单元通过ATP适配体核酸链能够特异性地识别并结合ATP并与其发生分子置换反应，且淬灭基团修饰的短链从所述传感单元上脱离；

[0015] 所述传感单元发生分子置换之前，荧光基团和猝灭基团之间发生共振能量转移，荧光基团在特定波长的激发光照射下无荧光信号发出；

[0016] 所述传感单元发生分子置换之后，荧光基团能在特定波长的激发光照射下发出荧光信号。

[0017] 可选地，具有淬灭基团修饰的短链的长度小于具有荧光基团修饰的ATP适配体核酸链的长度。

[0018] 可选地，所述基底结构上最远两点之间的距离为5nm‑15nm。

[0019] 可选地，实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器还包括连接短链，所述连接短链的一端连接所述基底结构的端点，另一端连接传感单元；所述连接短链包括多个碱基。

[0020] 根据本发明的第二方面，提供了一种实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器的应用，包括如下步骤：

[0021] 将纳米传感器与活细胞孵育培养，纳米传感器被胞吞进入活细胞内；

[0022] 当纳米传感器的传感单元检测到活细胞内的ATP后，传感单元发生分子置换反应；其中，传感单元的具有荧光基团修饰的ATP适配体核酸链特异性地识别并结合ATP，具有淬灭基团修饰的短链从所述传感单元上脱离；

[0023] 在特定波长的激发光照射下，活细胞内结合有ATP的传感单元出荧光信号；

[0024] 通过荧光显微镜对荧光信号进行观察，并通过酶标仪对荧光信号进行检测，以获取活细胞内ATP动态变化的实时监测结果。

[0025] 可选地，所述活细胞为细胞系；或者，所述活细胞为来源于活体组织的原代细胞或干细胞；或者，所述活细胞为干细胞培养后的类器官。

[0026] 可选地，通过荧光显微镜对荧光信号进行观察，包括：

[0027] 将活细胞放在共聚焦培养皿中培养过夜，并将稀释后的纳米传感器与活细胞在37℃无血清培养基中孵育2‑4小时，对处理后的活细胞进行保存，并采用共聚焦显微镜成像。

[0028] 可选地，通过酶标仪对荧光信号进行检测，包括：

[0029] 将活细胞接种到细胞培养板中培养过夜；用无血清培养基将纳米传感器稀释至10nM并与细胞孵育，每预设时间检测一次激发波长为530nm，发射波长为570nm的荧光信号的荧光强度，并形成ATP波动变化曲线。

[0030] 本发明的一个技术效果在于：

[0031] 在本申请实施例中，基底结构为由四条单链DNA经碱基互补配对形成的四面体框架结构，并能穿越活细胞膜；四个传感单元分别连接在基底结构的四个端点处，且传感单元能够在ATP参与下发生分子置换反应。进一步地，传感单元发生分子置换之前，传感单元在特定波长的激发光照射下无荧光信号发出；而传感单元发生分子置换之后，传感单元能在特定波长的激发光照射下发出荧光信号。因此，该实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器存在如下优点：

[0032] （1）能够实现对活细胞的长期监测。在分子生物学领域和医学诊断领域中，其大大提高了监测装置与活细胞的生物相容性，不会对活细胞造成毒性损伤，保证脆弱细胞的高细胞活力，从而为对活细胞的监测带来了显著的优势。

[0033] （2）提高了监测装置进入活细胞的渗透效率。由于基底结构为由四条单链DNA经碱基互补配对形成的四面体框架结构，其特殊的形态以及大小相比于其他构型，可以以最大的效率被胞吞进入细胞，而无需其他转染方法辅助（例如化学转染，物理转染方法等等），从而能够较好地保护活细胞。当纳米传感器孵育活细胞时，可以主动进入活细胞内部，从而完成在活细胞内部的监测功能。

[0034] （3）提高了监测活细胞内ATP的灵敏度和特异性。四个传感单元分别连接在基底结构的四个端点处，相较于普通的ATP适配体检测链，其具有更高的灵敏度和特异性，保证了实时监测细胞内ATP的准确性。

[0035] 综上所述，该实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器采用了DNA折纸技术，可以通过基底结构和传感单元发挥各自的功能，实现了对活细胞内，特别是原代细胞或干细胞内的ATP变化的长期实时监测。这些优点都大大促进了实时ATP监测技术在临床样本上的应用，以期达到追踪人类类器官在整个生长周期的生长状态和药物反应的变化。

附图说明

[0036] 图1为本发明一实施例的一种实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器的结构示意图；

[0037] 图2为本发明一实施例的一种实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器的传感单元发生置换反应的示意图；

[0038] 图3为本发明一实施例的一种实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器进入活细胞内在ATP参与下发生分子置换反应的示意图。

[0039] 图中：1、基底结构；2、传感单元；21、ATP适配体核酸链；211、荧光基团；22、淬灭基团修饰的短链；221、淬灭基团；3、ATP分子；4、细胞核；5、细胞质。

具体实施方式

[0040] 现在将参照附图来详细描述本申请的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本申请的范围。

[0041] 下面将详细描述本申请的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

[0042] 参见图1至图3，根据本发明的第一方面，提供了一种实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器，其包括基底结构1和传感单元2。其中，基底结构1作为DNA构型，能够较稳定地支撑传感单元2，有利于传感单元2对活细胞内的ATP的准确检测。

[0043] 具体地，所述基底结构1为由四条单链DNA经碱基互补配对形成的四面体框架结构，并能穿越活细胞膜。基底结构1可以保持一定的稳定性，起到维持纳米传感器的基础构型。

[0044] 进一步具体地，四个所述传感单元分别连接在所述基底结构1的四个端点处；所述传感单元2包括在ATP参与下发生分子置换反应的碱基对，从而能够在活细胞内特异性识别ATP。

[0045] 如图3所示，活细胞内具有ATP分子3、细胞核4和细胞质5。传感单元2在ATP参与下发生分子置换反应，是传感单元的部分结构（例如核酸短链）与ATP分子3发生置换，为了便于表述，本文中的ATP均指ATP分子。

[0046] 在本申请中，由于纳米传感器的整体组成来源是DNA材料，保证了纳米传感器与活细胞的高生物相容性，确保其不对活细胞造成任何毒性损伤，从而完成对活细胞的长期监测。

[0047] 所述传感单元2发生分子置换之前，传感单元在特定波长的激发光照射下无荧光信号发出。所述传感单元2发生分子置换之后，传感单元能在特定波长的激发光照射下发出荧光信号。

[0048] 需要说明的是，纳米传感器的结构的形成依赖于DNA折纸技术。通过DNA折纸技术合成能够特异性识别ATP的米传感器，使得纳米传感器具有纳米尺度的精小结构以更好地穿越活细胞膜，从而能对活细胞内ATP动态变化进行实时监测。而且，纳米传感器的组成来源是DNA材料，保证了纳米传感器的整体结构的高生物相容性，从而使得能够在实现功能的同时，保证了活细胞的无毒性损伤。因此，本申请的纳米传感器能够实现长期且实时地监测活细胞（包括干细胞或原代细胞）内ATP的动态变化，监测结果比较准确。

[0049] 需要强调的是，对于传感单元来说，ATP参与下发生分子置换反应的碱基对是能够进行实时监测ATP的关键元件。为了起到检测ATP的作用，传感单元需要有一定的识别并和结合ATP的特异性。此外，为了能够使传感单元进入细胞内监测ATP，必须将其装载在基底结构1上，才能进入细胞内部进行监测ATP的变化，因此需要传感单元具备设计的灵活性，可以根据需要改造传感单元的核酸链。

[0050] 在本申请实施例中，该实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器存在如下优点：

[0051] （1）能够实现对活细胞的长期监测。在分子生物学领域和医学诊断领域中，其大大提高了监测装置与活细胞的生物相容性，不会对活细胞造成毒性损伤，保证脆弱细胞的高细胞活力，从而为对活细胞的监测带来了显著的优势。

[0052] （2）提高了监测装置进入活细胞的渗透效率。由于基底结构1为由四条单链DNA经碱基互补配对形成的四面体框架结构，其特殊的形态以及大小相比于其他构型，可以以最大的效率被胞吞进入细胞，而无需其他转染方法辅助（例如化学转染，物理转染方法等等），从而能够较好地保护活细胞。当纳米传感器孵育活细胞时，可以主动进入活细胞内部，从而完成在活细胞内部的监测功能。

[0053] （3）提高了监测活细胞内ATP的灵敏度和特异性。四个传感单元分别连接在基底结构1的四个端点处，相较于普通的ATP适配体检测链，其具有更高的灵敏度和特异性，保证了实时监测细胞内ATP的准确性。

[0054] 综上所述，该实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器采用了DNA折纸技术，可以通过基底结构1和传感单元2发挥各自的功能，实现了对活细胞内，特别是原代细胞或干细胞内的ATP变化的长期实时监测。这些优点都大大促进了实时ATP监测技术在临床样本上的应用，以期达到追踪人类类器官在整个生长周期的生长状态和药物反应的变化。

[0055] 在一个具体的实施方式中，基底结构1在凝胶核酸电泳中的核酸序列长度为250bp。其在原子力显微镜的测定中呈现出5nm的平均高度，使用马尔文分析仪测得的峰值水动力尺寸为8nm，该尺寸是能够高效通过活细胞的最佳尺寸。传感单元2在凝胶核酸电泳中的核酸序列长度为47bp。

[0056] 可选地，四条单链DNA的摩尔数相同，这使得四条单链DNA能够形成较为稳定的四面体框架结构，从而实现对传感单元的稳定的连接。

[0057] 在一个具体的实施方式中，基底结构1的水动力直径维持在10nm‑15nm之间，从而使得纳米传感器能够更好地穿越细胞膜进入细胞内。

[0058] 可选地，所述传感单元由具有荧光基团211修饰的ATP适配体核酸链21与具有淬灭基团修饰的短链22通过碱基互补配对结合而成；所述传感单元2通过ATP适配体核酸链21能够特异性地识别并结合ATP并与其发生分子置换反应，且淬灭基团修饰的短链22从所述传感单元2上脱离；

[0059] 所述传感单元2发生分子置换之前，荧光基团211和猝灭基团之间发生共振能量转移，荧光基团211在特定波长的激发光照射下无荧光信号发出；

[0060] 所述传感单元2发生分子置换之后，荧光基团211能在特定波长的激发光照射下发出荧光信号。

[0061] 在上述实施方式中，传感单元2通过ATP适配体核酸链21能够特异性的识别并结合ATP，从而与其发生分子置换反应，淬灭基团修饰的短链22被替换下来，从而使得纳米传感器在激发光的照射下发出荧光信号，从而实现对细胞内的ATP进行准确的检测。

[0062] 可选地，具有淬灭基团修饰的短链22的长度小于具有荧光基团211修饰的ATP适配体核酸链21的长度，从而便于ATP适配体核酸链21识别并结合ATP，同时也有利于淬灭基团修饰的短链22从传感单元上脱离。

[0063] 可选地，所述基底结构1上最远两点之间的距离为5nm‑15nm。这使得基底结构1的整体较小，能够较好地穿越活细胞膜，有助于保证纳米传感器具有较强的渗透性。

[0064] 可选地，实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器还包括连接短链，所述连接短链的一端连接所述基底结构1的端点，另一端连接传感单元；所述连接短链包括多个碱基。

[0065] 在上述实施方式中，基底结构1的端点位置需要具备设计的灵活性，根据需要可以改造其上短链的延伸长度，例如，通过增加碱基的个数以形成连接短链并连接在基底结构1和传感单元之间，从而较好地发挥连接在基底结构1上的传感单元的检测功能。

[0066] 在一个具体的实施方式中，提供了一种实时监测活细胞内ATP动态变化的监测系统，其包括上述的纳米传感器、荧光显微镜、图像处理设备以及酶标仪。首先，通过将纳米传感器与活细胞孵育培养；其次，通过荧光显微镜对荧光信号进行观察，并通过酶标仪对荧光信号进行检测，以获取活细胞内ATP动态变化的实时监测结果。其中，图像处理设备能够对ATP动态变化的图像进行处理。

[0067] 因此，当监测活细胞内的ATP变化时，由于传感单元2具有合适的荧光基团211修饰，从而使用荧光显微镜或酶标仪能够在相应的激发光和发射光波长下检测DNA纳米传感器的荧光信号，从而实现对活细胞内ATP动态变化的实时监测。

[0068] 根据本发明的第二方面，提供了一种实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器的应用，包括如下步骤：

[0069] 将纳米传感器与活细胞孵育培养，纳米传感器被胞吞进入活细胞内。

[0070] 由于基底结构1为由四条单链DNA经碱基互补配对形成的四面体框架结构，其具有高效的穿越活细胞膜的通透性，因此能够较容易地被胞吞进入活细胞内。

[0071] 当纳米传感器的传感单元2检测到活细胞内的ATP后，传感单元2发生分子置换反应；其中，传感单元2的具有荧光基团211修饰的ATP适配体核酸链21特异性地识别并结合ATP，具有淬灭基团修饰的短链22从所述传感单元2上脱离。也即，具有淬灭基团修饰的短链22与具有荧光基团211修饰的ATP适配体核酸链21分离，从而使得传感单元能在特定波长的激发光照射下发出荧光信号，荧光信号可以被荧光显微镜观察到，也可以被酶标仪检测到，从而实现对活细胞内ATP动态变化的实时监测。在特定波长的激发光照射下，活细胞内结合有ATP的传感单元2出荧光信号；

[0072] 通过荧光显微镜对荧光信号进行观察，并通过酶标仪对荧光信号进行检测，以获取活细胞内ATP动态变化的实时监测结果。

[0073] 在上述实施方式中，实时监测活细胞内ATP动态变化的纳米传感器的应用比较简单，能够实时监测活细胞内ATP动态变化，准确率较高。进一步地，依据实时监测的结果，可以进行活细胞内ATP变化的分析，从而判断活细胞的生长状态，为后续的追踪疾病进展和治疗效果提供有效的工具。

[0074] 可选地，所述活细胞为细胞系；或者，所述活细胞为来源于活体组织的原代细胞或干细胞；或者，所述活细胞为干细胞培养后的类器官。这使得对活细胞内ATP动态变化的应用范围比较广泛，为后续的追踪疾病进展和治疗效果提供较好的依据。

[0075] 可选地，通过荧光显微镜对荧光信号进行观察，包括：

[0076] 将活细胞放在共聚焦培养皿中培养过夜，并将稀释后的纳米传感器与活细胞在37℃无血清培养基中孵育2‑4小时，对处理后的活细胞进行保存，并采用共聚焦显微镜成像。

[0077] 在上述实施方式中，有利于实现荧光显微镜对荧光信号进行准确的观察，从而较好地保证了观察效果。

[0078] 可选地，通过酶标仪对荧光信号进行检测，包括：

[0079] 将活细胞接种到细胞培养板中培养过夜；用无血清培养基将纳米传感器稀释至10nM并与细胞孵育，每预设时间检测一次激发波长为530nm，发射波长为570nm的荧光信号的荧光强度，并形成ATP波动变化曲线。

[0080] 在上述实施方式中，通过酶标仪对荧光信号进行清晰且准确的检测，有助于形成ATP波动变化曲线，保证实时监测活细胞内ATP动态变化的监测效果。

[0081] 在本申请实施例中，纳米传感器的制造方法如下：

[0082] 需要说明的是，由如下制作工艺已经成功制造出了本发明所述纳米传感器。给出具体制作方法是为了帮助本领域技术人员理解本发明的制造方法，而并不是对本发明所述器件的材料、尺寸和制造方法做出限定。

[0083] 第一步，对于传感单元2来说，在预先制备的反应缓冲液(10mM的Tris，1mM的EDTA，12.5mM的MgCl2)中，分别将荧光基团211修饰的ATP适配体核酸链21和淬灭基团修饰的短链
22调整到1:1的摩尔比。将上述混合物在PCR仪中加热至70℃，以3min/℃的速率退火至25℃，然后在4℃保存。其中，传感单元2的ATP适配体核酸链21被延长额外添加了15个poly‑(A)的碱基。

[0084] 对于基底结构1来说，将四条等摩尔分子的长链单链DNA链在PCR仪中95℃加热5分钟，然后以3min/℃的速率退火到25℃，然后在4℃保存。其中，在基底结构1的四个端点处通过额外添加了了15个poly‑(T)的碱基而被延长。

[0085] 第二步，将基底结构1与传感单元2按照以1:4浓度比混合在100μL反应缓冲体系中。混合物以10min/℃的速率从37℃缓慢冷却到25℃，然后在4℃保存。由此合成了纳米传感器。

[0086] 在上述制作方法中，使用原子力显微镜测定了纳米传感器的形貌体征，体现为四面体构型，平均高度为6nm；峰值水动力尺寸为10nm；凝胶核酸电泳测得的其核酸序列长度约为300bp。

[0087] 在一个具体的实施方式中，当活细胞为细胞系时，荧光图像监测的方式如下：活细胞在共聚焦培养皿中培养过夜，稀释后的纳米传感器（10 nM）与活细胞在37℃无血清培养基中孵育2小时。所有处理的活细胞保存在1xPBS中，用共聚焦显微镜成像。

[0088] 酶标仪采集ATP波动变化曲线的方式如下：将细胞接种到96孔细胞培养板中培养过夜。用无血清培养基将纳米传感器稀释至10nM并与活细胞孵育。每12小时检测一次激发波长为530nm，发射波长为570nm的荧光信号的荧光强度，72小时后受细胞密度影响终止检测。

[0089] 当活细胞为原代细胞或干细胞时，需要将原代细胞或干细胞按照以下步骤操作，培养一周后开始监测。

[0090] 首先，原代细胞或干细胞来自于手术切除的新鲜的临床样本，PBS清洗后，用外科3
剪刀将临床样本在10厘米的培养皿上切成1‑2mm的立方体。然后，将这些样本片段在预先制备的消化缓冲液(10ml)中37℃孵育60分钟。当组织游离时，加入2ml血清停止消化。接着，离心(300g，5分钟)后，将细胞重悬于冰冷的完全类器官培养基 (每10μL培养基中含有1.5 
4
 3 * 10 个细胞)中。将两倍体积的凝胶添加到细胞悬液中。因此，细胞‑凝胶滴液被滴加~
在35毫米共聚焦培养皿或96孔板中。为保证凝胶的凝固，将共聚焦培养皿反置于37℃培养箱中30分钟后，正常放置共聚焦培养皿，加入完整的类器官培养基。最后，采用荧光显微镜或酶标仪进行监测。

[0091] 荧光图像监测的方式如下：细胞在共聚焦培养皿中培养过夜，稀释后的DNA纳米传感器（10nM）与活细胞在37℃无血清培养基中孵育2‑4小时。所有处理的细胞保存在1xPBS中，用共聚焦显微镜成像。

[0092] 酶标仪采集ATP波动变化曲线的方式如下：将细胞接种到96孔细胞培养板中培养过夜。用无血清培养基将DNA纳米传感器稀释至10nM，与细胞孵育。每3天检测一次激发波长为530nm，发射波长为570nm的荧光强度，直到细胞死亡。

[0093] 另外，可采用纳米传感器对活细胞内ATP动态变化进行监测，通过监测结果反映原代细胞或干细胞的正常生长状态及其药物响应。反映原代细胞或干细胞的正常生长状态及其药物响应的具体方法：

[0094] 将原代细胞或干细胞培养6天后，从第7天开始，每3天在活细胞中添加纳米传感器。每3天测量一次其荧光信号的荧光强度，并归一化到第7天测量的荧光信号的荧光强度（即以第7天测量的荧光信号的荧光强度为对比标准），之后直至其生长达到最佳状态，在慢慢死亡的全过程均被纳米传感器精确的追踪。纳米传感器追踪到的ATP的变化与干细胞的生长状态一致。

[0095] 除了正常培养监测外，还用纳米传感器监测原代细胞或干细胞的药物反应。同理，原代细胞或干细胞培养6天后，从第7天开始，细胞内每2天加入12μM化疗药物紫杉醇，每2天加入纳米传感器。每2天测量一次原代细胞或干细胞的荧光强度，并归一化到第7天测量的荧光信号的荧光强度，之后直至其生长被药物抑制，在慢慢死亡的全过程均被纳米传感器精确地追踪。纳米传感器追踪ATP的变化反映了化疗药物的治疗效果。

[0096] 可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。