一种外泌体滴鼻制剂及其制备方法和应用

摘要

本申请涉及外泌体制剂的技术领域，具体公开了一种外泌体滴鼻制剂及其制备方法和应用。该外泌体滴鼻制剂包括以下重量份的组分：外泌体1‑2份；0.9%生理盐水1000‑1500份；人血清白蛋白1‑1.8份；透明质酸钠0.5‑0.9份；稳定剂0.05‑0.65份；所述稳定剂包括苯甲酸钠、2‑氯乙基乙烯基醚和诺氟沙星。本申请提供的外泌体滴鼻制剂能够有效降低癫痫的发作次数和发作时间，并能够降低阿尔兹海默症小鼠脑组织中炎症因子IL‑1β含量，减轻小鼠阿尔兹海默症的发病症状。

权利要求

1.一种外泌体滴鼻制剂，其特征在于，所述外泌体滴鼻制剂包括以下重量份的组分：外泌体1‑2份；

0.9％生理盐水1000‑1500份；

人血清白蛋白1‑1.8份；

透明质酸钠0.5‑0.9份；

还包括苯甲酸钠、2‑氯乙基乙烯基醚和诺氟沙星的总和0.05‑0.65份；

所述苯甲酸钠、2‑氯乙基乙烯基醚和诺氟沙星的总和中，苯甲酸钠4.5‑9.5份；2‑氯乙基乙烯基醚1.3‑2.1份；诺氟沙星0.5‑2.5份。

2.根据权利要求1所述的外泌体滴鼻制剂，其特征在于，所述苯甲酸钠、2‑氯乙基乙烯基醚和诺氟沙星的总和中，苯甲酸钠6.5‑7.5份；2‑氯乙基乙烯基醚1.5‑1.9份；诺氟沙星

1.5‑2份。

3.根据权利要求1所述的外泌体滴鼻制剂，其特征在于，所述外泌体滴鼻制剂中，所述苯甲酸钠、2‑氯乙基乙烯基醚和诺氟沙星的总和的重量份为0.25‑0.45份。

4.根据权利要求1所述的外泌体滴鼻制剂，其特征在于，所述外泌体的来源选自人诱导多能干细胞。

5.一种权利要求1所述的外泌体滴鼻制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：(1)按照上述各组分的添加量，将苯甲酸钠、2‑氯乙基乙烯基醚和诺氟沙星三者与

0.9％生理盐水混合均匀，获得第一混合液；

(2)向步骤(1)获得的第一混合液中加入人血清白蛋白，混合均匀，获得第二混合液；

(3)向步骤(2)获得的第二混合液中加入透明质酸钠，混合均匀，制得第三混合液；

(4)将步骤(3)获得的第三混合液与外泌体混合均匀，获得外泌体滴鼻制剂。

6.利用权利要求1‑4中任一项所述的外泌体滴鼻制剂在制备用于治疗癫痫或阿尔兹海默症的药物中的应用。

7.一种利用权利要求1‑4中任一项所述的外泌体滴鼻制剂制得的药物。

说明书

一种外泌体滴鼻制剂及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本申请涉及外泌体制剂的技术领域，更具体地说，涉及一种外泌体滴鼻制剂及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 癫痫（Epilepsy）是常见的神经系统疾病，即俗称的“羊角风”或“羊癫风”，是大脑神经元突发性异常放电，导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病。近年来，癫痫患者数量明显增加，癫痫已成为神经科仅次于头痛的第二大常见病。其中，30%为难治性癫痫。难治性癫痫指经过至少两种一线抗癫痫药物正规治疗后无效（血药浓度在有效范围），至少观察2年仍然不能控制且每月至少发作4次以上，严重影响患者日常生活，并且无进行性中枢神经系统疾病或占位性病变。

[0003] 阿尔兹海默症（Alzheimer's disease，AD）一般以两种形式发生，一种是由遗传决定的早发形式，另一种是非遗传的晚发形式。其中家族性AD是一种常染色体显性遗传疾病，编码淀粉样肽前体蛋白（APP）、早老素1（PSEN1）和早老素2（PSEN2）的基因突变会导致家族性AD。其中，PSEN1基因突变是大多数家族性疾病的原因。家族性AD患者的发病年龄小于65岁。65岁以前发病者，称早老性痴呆。迟发性AD占所有AD病例的95％以上，发病率随年龄的增加而增大，目前被认为是老年性痴呆的最常见形式。研究表明：年龄较大，动脉粥样硬化，2型糖尿病，神经创伤和感染以及炎症都是迟发性AD的危险因素。因此，迟发性AD可能是由遗传风险（载脂蛋白Eε4等位基因）和环境因素（毒素、细菌、真菌和病毒病原体等）之间复杂的相互作用所驱动。

[0004] 外泌体（exosome）是指携带多种蛋白质、mRNA、miRNA和脂质类物质的细胞外囊泡，具有完整的膜结构，直径为30‑150nm，主要负责细胞间的物质运输和信息传递。由于几乎所有细胞均可分泌外泌体，故外泌体广泛存在并分布于各种体液中。外泌体作为重要的信号传递分子，形成了一种全新的细胞‑细胞间信息传递系统，可参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程。尤其是来源于干细胞的外泌体具备干细胞的多种功能，具有重要的治疗作用且更加安全。近几年，干细胞衍生物外泌体的应用得到人们的广泛关注。

发明内容

[0005] 本申请提供一种外泌体滴鼻制剂及其制备方法和应用，能够有效降低癫痫的发作次数和发作时间，并能够降低阿尔兹海默症小鼠脑组织中炎症因子IL‑1β含量，减轻小鼠阿尔兹海默症的发病症状。

[0006] 本申请提供的一种外泌体滴鼻制剂采用如下的技术方案：

[0007] 一种外泌体滴鼻制剂，其特征在于，所述外泌体滴鼻制剂包括以下重量份的组分：

[0008] 外泌体1‑2份；

[0009] 0.9%生理盐水1000‑1500份；

[0010] 人血清白蛋白1‑1.8份；

[0011] 透明质酸钠0.5‑0.9份；

[0012] 稳定剂0.05‑0.65份；

[0013] 所述稳定剂包括苯甲酸钠、2‑氯乙基乙烯基醚和诺氟沙星。

[0014] 本申请通过利用苯甲酸钠、2‑氯乙基乙烯基醚和诺氟沙星三者复配作为稳定剂。相比利用PBS滴鼻制剂的效果，本申请提供的外泌体滴鼻制剂能够有效降低癫痫的发作次数和发作时间，并能够降低阿尔兹海默症小鼠脑组织中炎症因子IL‑1β含量。

[0015] 经过试验分析，单独使用苯甲酸钠、2‑氯乙基乙烯基醚和诺氟沙星中的任意一种或两种用于外泌体滴鼻制剂中，对降低癫痫的发作次数和发作时间以及阿尔兹海默症小鼠脑组织中炎症因子IL‑1β含量的效果远不如同时将三者应用于外泌体滴鼻制剂时对降低癫痫的发作次数和发作时间以及阿尔兹海默症小鼠脑组织中炎症因子IL‑1β含量的效果。因此，说明将三者复配使用，用于外泌体滴鼻制剂中，能够明显有效降低癫痫的发作次数和发作时间以及阿尔兹海默症小鼠脑组织中炎症因子IL‑1β含量。基于上述，本申请提供的外泌体滴鼻制剂能够有效降低癫痫的发作次数和发作时间，并能够降低阿尔兹海默症小鼠脑组织中炎症因子IL‑1β含量。

[0016] 优选的，所述稳定剂包括以下重量份的组分：苯甲酸钠4.5‑9.5份；2‑氯乙基乙烯基醚1.3‑2.1份；诺氟沙星0.5‑2.5份。

[0017] 优选的，所述稳定剂包括以下重量份的组分：苯甲酸钠6.5‑7.5份；2‑氯乙基乙烯基醚1.5‑1.9份；诺氟沙星1.5‑2份。

[0018] 在一个具体的实施方式中，苯甲酸钠的添加量可以是4.5份、6.5份、7份、7.5份、9.5份。

[0019] 在一些具体的实施方式中，苯甲酸钠的添加量可以是4.5‑6.5份、4.5‑7份、4.5‑7.5份、6.5‑7份、6.5‑9.5份、7‑7.5份、7‑9.5份、7.5‑9.5份。

[0020] 在一个具体的实施方式中，2‑氯乙基乙烯基醚的添加量可以是1.3份、1.5份、1.7份、1.9份、2.1份。

[0021] 在一些具体的实施方式中，2‑氯乙基乙烯基醚的添加量可以是1.3‑1.5份、1.3‑1.7份、1.3‑1.9份、1.5‑1.7份、1.5‑2.1份、1.7‑1.9份、1.7‑2.1份、1.9‑2.1份。

[0022] 在一个具体的实施方式中，诺氟沙星的添加量可以是0.5份、1.5份、1.75份、2份、2.5份。

[0023] 在一些具体的实施方式中，诺氟沙星的添加量可以是0.5‑1.5份、0.5‑1.75份、0.5‑2份、1.5‑1.75份、1.5‑2.5份、1.75‑2份、1.75‑2.5份、2‑2.5份。

[0024] 在一个具体的实施方式中，外泌体的添加量可以是1份、1.2份、1.5份、2份。

[0025] 在一些具体的实施方式中，外泌体的添加量可以是1‑1.2份、1‑1.5份、1.2‑1.5份、1.2‑2份、1.5‑2份。

[0026] 本申请对外泌体滴鼻制剂的稳定剂中苯甲酸钠、2‑氯乙基乙烯基醚和诺氟沙星的复配比例做了进一步探究。经过试验分析，将外泌体滴鼻制剂中三者的复配比例控制在上述范围内，能够进一步有效降低癫痫的发作次数和发作时间，并能够降低阿尔兹海默症小鼠脑组织中炎症因子IL‑1β含量。

[0027] 优选的，所述外泌体滴鼻制剂中，所述稳定剂的重量份为0.25‑0.45份。

[0028] 在一个具体的实施方式中，稳定剂的添加量可以是0.05份、0.25份、0.35份、0.45份、0.65份。

[0029] 在一些具体的实施方式中，稳定剂的添加量可以是0.05‑0.25份、0.05‑0.35份、0.05‑0.45份、0.25‑0.35份、0.25‑0.65份、0.35‑0.45份、0.35‑0.65份、0.45‑0.65份。

[0030] 经过试验分析，将外泌体滴鼻制剂中稳定剂的添加量控制在上述范围内，能够再进一步有效降低癫痫的发作次数和发作时间，并能够降低阿尔兹海默症小鼠脑组织中炎症因子IL‑1β含量。

[0031] 优选的，所述外泌体的来源选自人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）。

[0032] 经过试验分析，本申请选择来源为人诱导多能干细胞的外泌体制得的外泌体滴鼻制剂的效果更优于选择来源为人间充质干细胞的外泌体制得的外泌体滴鼻制剂的效果，能够有效降低癫痫的发作次数和发作时间，并能够降低阿尔兹海默症小鼠脑组织中炎症因子IL‑1β含量。

[0033] 第二方面，本申请提供一种外泌体滴鼻制剂的制备方法，采用如下的技术方案：

[0034] 一种外泌体滴鼻制剂的制备方法，具体包括以下步骤：

[0035] （1）按照上述各组分的添加量，将稳定剂与0.9%生理盐水混合均匀稳定剂，获得第一混合液；

[0036] （2）向步骤（1）获得的第一混合液中加入人血清白蛋白，混合均匀，获得第二混合液；

[0037] （3）向步骤（2）获得的第二混合液中加入透明质酸钠，混合均匀，制得第三混合液；

[0038] （4）将步骤（3）获得的第三混合液与外泌体混合均匀，获得外泌体滴鼻制剂。

[0039] 第三方面，本申请提供上述外泌体滴鼻制剂在制备用于治疗癫痫或阿尔兹海默症的药物中的应用。

[0040] 第四方面，本申请提供利用上述外泌体滴鼻制剂制得的药物。

[0041] 综上所述，本申请具有以下有益效果：

[0042] 本申请提供了一种外泌体滴鼻制剂，利用本申请提供的制备方法制得的外泌体滴鼻制剂能够有效减少小鼠癫痫的发作次数和发作时间，且能够有效减少阿尔兹海默症小鼠脑组织中炎症因子IL‑1β含量，减轻小鼠阿尔兹海默症的发病症状，为开发新型治疗癫痫和阿尔兹海默症的药物奠定了基础。

附图说明

[0043] 图1为施用实施例3提供的外泌体滴鼻制剂的SE模型小鼠的脑电图（三个图分别指不同的试验小鼠个体）。

[0044] 图2为施用对照组1提供的PBS滴鼻制剂的SE模型小鼠的脑电图（三个图分别指不同的试验小鼠个体）。

[0045] 图3为对照组2的试验小鼠的脑电图（两个图分别指不同的试验小鼠个体）。

[0046] 图4为施用对照组4提供的不加稳定剂的滴鼻制剂的SE模型小鼠的脑电图（三个图分别指不同的试验小鼠个体）。

[0047] 图5为本申请中SE模型小鼠施用实施例3提供的外泌体滴鼻制剂和对照组1提供的PBS滴鼻制剂的生存曲线。

[0048] 图6为本申请实施例3提供的外泌体滴鼻制剂的部分试验小鼠、对照组3使用PBS制剂的部分试验小鼠、对照组5使用不加稳定剂的滴鼻制剂的部分试验小鼠的旷场试验运动路径图。

[0049] 图7为本申请实施例3提供的外泌体滴鼻制剂的部分试验小鼠（外泌体滴鼻剂）、对照组3使用PBS制剂的部分试验小鼠（PBS滴鼻剂）、对照组5使用不加稳定剂的滴鼻制剂的部分试验小鼠（外泌体滴鼻剂‑无稳定剂）的旷场试验数据统计结果一。

[0050] 图8为本申请实施例3提供的外泌体滴鼻制剂的部分试验小鼠（外泌体滴鼻剂）、对照组3使用PBS制剂的部分试验小鼠（PBS滴鼻剂）、对照组5使用不加稳定剂的滴鼻制剂的部分试验小鼠（外泌体滴鼻剂‑无稳定剂）的旷场试验数据统计结果二。

具体实施方式

[0051] 本申请提供了一种外泌体滴鼻制剂。该外泌体滴鼻制剂包括以下重量份的组分：外泌体1‑2份；0.9%生理盐水1000‑1500份；人血清白蛋白1‑1.8份；透明质酸钠0.5‑0.9份；
稳定剂0.05‑0.65份。进一步地，上述稳定剂的重量份为0.25‑0.45份。

[0052] 其中，上述稳定剂包括苯甲酸钠、2‑氯乙基乙烯基醚和诺氟沙星。该稳定剂具体包括以下重量份的组分：苯甲酸钠4.5‑9.5份；2‑氯乙基乙烯基醚1.3‑2.1份；诺氟沙星0.5‑2.5份。进一步地，上述稳定剂包括以下重量份的组分：苯甲酸钠6.5‑7.5份；2‑氯乙基乙烯基醚1.5‑1.9份；诺氟沙星1.5‑2份。

[0053] 另外，本申请提供的外泌体滴鼻制剂中，外泌体的来源选自人诱导多能干细胞。

[0054] 本申请还提供了上述外泌体滴鼻制剂的制备方法。该制备方法具体包括以下步骤：

[0055] （1）按照上述各组分的添加量，将稳定剂与0.9%生理盐水混合均匀，获得第一混合液；

[0056] （2）向步骤（1）获得的第一混合液中加入人血清白蛋白，混合均匀，获得第二混合液；

[0057] （3）向步骤（2）获得的第二混合液中加入透明质酸钠，混合均匀，制得第三混合液；

[0058] （4）将步骤（3）获得的第三混合液与外泌体混合均匀，获得外泌体滴鼻制剂。

[0059] 本申请提供的外泌体制剂还能用于制备用于治疗癫痫或阿尔兹海默症的药物。本申请还提供了利用上述外泌体制剂制得的药物。

[0060] 以下结合制备例1‑2、实施例1‑20、对比例1‑12以及检测试验对本申请作进一步详细说明。

[0061] 制备例1

[0062] 本制备例提供了一种外泌体的制备方法。本制备例中外泌体的来源为人诱导多能干细胞。

[0063] （1）细胞培养：对iPSC细胞（国典（北京）医药科技有限公司商品）进行扩增培养（使TM用Essential 8  Medium试剂盒（购自Thermo fisher，货号：A1517001）进行常规扩增培养）至对数生长期且状态良好，按照Versene Solution试剂盒（购自Thermo Fisher公司，货号
15040066）的技术手册消化成小细胞团（3‑10个细胞），然后将其铺在玻连蛋白（购自Peprotech公司的Recombinant Human Vitronectin，货号140‑09）包被的10cm细胞培养皿中，贴壁后覆盖率达到60％～70％，37℃，95％空气和5％CO2气氛下培养过夜。如果iPSC贴壁状况良好，换液为GDEV培养基（国典(北京)医药科技有限公司商品），24h后换液收取细胞培养上清，重复上一步操作，一批细胞可收取3次。

[0064] （2）外泌体的分离：

[0065] 分别取步骤（1）诱导培养细胞获得的细胞培养上清在3000g条件下室温离心15min，去除死细胞和细胞碎片。收集上清液，0.22μm滤器过滤；将滤出液转移至Centricon Plus‑70（100kDa）超滤管中浓缩，3000g室温离心30min。用DPBS（杜氏磷酸盐缓冲液）将浓缩液按照约1：100进行稀释，然后使用相同的装置再次浓缩。即可得到较为纯净的外泌体溶液。

[0066] 制备例2

[0067] 本制备例提供了一种外泌体的制备方法。本制备例中外泌体的来源为人脐带间充质干细胞。

[0068] 上述制备方法具体包括以下步骤：

[0069] （1）样本处理：采集的新鲜10cm脐带组织，用含有青霉素‑链霉素溶液（双抗）（100×）（购自Gibco）的生理盐水清洗，用眼科剪切割为1mm²的小块，转移至细胞培养瓶中，加入含有体积分数为10%血清替代物、青霉素‑链霉素的DMEM/F12培养液（均购自Gibco），于5% CO2、37℃的培养箱中静置培养。

[0070] （2）细胞培养：步骤（1）原代培养过程中，1周后首次换液，此后3～4天换液1次。待细胞长至80%～90%融合时用胰蛋白酶/EDTA消化液（购自Gibco）消化传代，移入新培养皿进行培养。

[0071] （3）外泌体的分离：当细胞浓度生长至80‑90％时，换入人间充质干细胞无血清培养基（MSC NutriStem® XF Medium，购自Biological Industries），继续培养，24h后换液收取细胞培养上清，重复上一步操作，一批细胞可收取3次；将3次收取的细胞培养上清离心20min（3000g/min），去除细胞和细胞碎片，使用Centricon Plus‑70（100 kDa）超滤管（购自Sigma）3000g/min室温离心30 min，获得外泌体。
实施例

[0072] 实施例1‑13

[0073] 实施例1‑13分别提供了一种外泌体滴鼻制剂。上述实施例中用到的外泌体为利用制备例1提供的制备方法获得的外泌体。

[0074] 其中，实施例1‑13的不同之处在于：制备外泌体滴鼻制剂时所用稳定剂的组分以及各组分配比，稳定剂包括苯甲酸钠、2‑氯乙基乙烯基醚和诺氟沙星，具体如表1所示。

[0075] 上述外泌体滴鼻制剂的制备方法，具体包括以下步骤：

[0076] （1）按照各组分的添加量，将稳定剂0.35mg与0.9%生理盐水1.2ml混合均匀，获得第一混合液；

[0077] （2）向步骤（1）获得的第一混合液中加入人血清白蛋白1.5mg，混合均匀，获得第二混合液；

[0078] （3）向步骤（2）获得的第二混合液中加入透明质酸钠0.7mg，混合均匀，制得第三混合液；

[0079] （4）将步骤（3）获得的第三混合液与外泌体1.2mg混合均匀，获得外泌体滴鼻制剂。

[0080] 表1 实施例1‑13提供的外泌体滴鼻制剂中稳定剂各组分添加情况

[0081]

[0082] 实施例14‑17

[0083] 实施例14‑17分别提供了一种外泌体滴鼻制剂。

[0084] 上述实施例与实施例3的不同之处在于：外泌体滴鼻制剂中稳定剂的添加量，具体如表2所示。

[0085] 表2 实施例3、14‑17提供的外泌体滴鼻制剂中稳定剂各组分添加情况[0086]

[0087] 实施例18‑20

[0088] 实施例18‑20分别提供了一种外泌体滴鼻制剂。上述实施例与实施例3的不同之处在于：外泌体的添加量。具体如下：

[0089] 实施例18时，外泌体的添加量为1mg。

[0090] 实施例19时，外泌体的添加量为1.5mg。

[0091] 实施例20时，外泌体的添加量为2mg。

[0092] 对比例

[0093] 对比例1‑6

[0094] 对比例1‑6分别提供了一种外泌体滴鼻制剂。

[0095] 其中，对比例1‑6与实施例3的不同之处在于：制备外泌体滴鼻制剂时所用稳定剂的组分以及各组分配比，具体如表3所示。

[0096] 表3 对比例1‑6提供的外泌体滴鼻制剂中稳定剂各组分添加情况

[0097]

[0098] 对比例7

[0099] 对比例7提供了一种外泌体滴鼻制剂。

[0100] 本对比例与实施例3的不同之处在于：利用等量的脂肪胺聚氧乙烯醚代替2‑氯乙基乙烯基醚。

[0101] 对比例8

[0102] 对比例8提供了一种外泌体滴鼻制剂。

[0103] 本对比例与实施例3的不同之处在于：利用等量的环丙沙星代替诺氟沙星。

[0104] 对比例9

[0105] 对比例9提供了一种外泌体滴鼻制剂。

[0106] 本对比例与实施例3的不同之处在于：将等量的海藻糖代替透明质酸钠。

[0107] 对比例10‑11

[0108] 对比例10‑11分别提供了一种外泌体滴鼻制剂。上述对比例与实施例3的不同之处在于：外泌体的添加量。具体如下：

[0109] 对比例10时，外泌体的添加量为0.4mg。

[0110] 对比例11时，外泌体的添加量为2.2mg。

[0111] 对比例12

[0112] 对比例12提供了一种外泌体滴鼻制剂。本对比例与实施例3的不同之处在于：外泌体滴鼻制剂中外泌体的来源。本制备例中用到的外泌体为利用制备例2提供的制备方法获得的外泌体。

[0113] 性能检测试验

[0114] 以实施例1‑20、对比例1‑12制备的外泌体滴鼻制剂为检测对象，进行下列检测试验。

[0115] 一、小鼠试验——癫痫

[0116] 1.癫痫持续状态（status epilepticus，SE）模型小鼠的构建

[0117] 取6‑7周龄的雄性C57BL/6J小鼠饲养一周后，进行SE模型小鼠的构建。具体方法如下：

[0118] （1）按照1mg/kg的剂量皮下注射硝酸东莨菪碱（scopolamine methyl nitrate，溶于无菌生理盐水后进行注射，货号：S866852，购买于麦克林），用于降低盐酸匹罗卡品的外周胆碱能效应。

[0119] （2）注射完毕30min后，按照280mg/kg的剂量腹腔注射盐酸匹罗卡品（pilocarpine hydrochloride，溶于无菌生理盐水后进行注射，货号：HY‑B0726，购买于MCE），用于诱导SE模型。

[0120] （3）观察并记录小鼠癫痫发作的严重程度和持续时间；具体癫痫行为可划分为以下5个等级：

[0121] 第一级行为：小鼠面部肌肉抽搐、尾巴僵直和颤抖；

[0122] 第二级行为：小鼠面部肌肉抽搐严重、尾巴僵直和颤抖严重；

[0123] 第三级行为：除上述症状外，小鼠还伴有单侧前肢肌阵挛为特征的低强度紧张性阵挛性发作；

[0124] 第四级行为：小鼠增加双侧前肢肌阵挛性发作和后仰；

[0125] 第五级行为：小鼠双侧前后肢肌阵挛和短暂的姿势控制丧失。

[0126] （4）SE模型的筛选：通过步骤（3）的观察，将出现持续1h第四级行为的癫痫行为小鼠入组SE模型，癫痫行为较弱（第一级行为、第二级行为、第三级行为）或癫痫行为过度的小鼠（第五级行为）排出在试验外。

[0127] 2.试验小鼠

[0128] 取SE模型小鼠入组102只，分为34组，每组3只。每组分别对应实施例1‑20、对比例1‑12制备的外泌体滴鼻制剂（SE‑EV）。另外，单独设置3组小鼠作为对照组，分别为对照组1、对照组2和对照组4；对照组1（SE‑PBS）所用的制剂为PBS滴鼻制剂，对照组2（正常对照组naive control，NC）为未进行SE模型构建处理的6‑7周龄的雄性C57BL/6J小鼠，不使用滴鼻制剂，对照组4所用的制剂为不加稳定剂的滴鼻制剂。

[0129] 对照组1中PBS滴鼻制剂的制备方法与实施例3的不同之处在于：利用PBS（Thermo Fisher Scientific）溶液代替制备方法中的外泌体。

[0130] 对照组4中不加稳定剂的滴鼻制剂的制备方法与实施例3的不同之处在于：制备过程中不添加稳定剂。

[0131] 3.试验方法

[0132] （1）试验小鼠癫痫发作2h后，分别按照10mg/kg的剂量皮下注射安定注射液（diazepam，5mg/ml）终止癫痫发作；

[0133] （2）步骤（1）处理2h后，按照分组分别将上述实施例和对比例制备的外泌体滴鼻制剂以及PBS滴鼻制剂施用于小鼠，本申请中实施的操作为滴鼻；

[0134] 具体滴鼻操作如下：

[0135] 将外泌体滴鼻制剂从‑80℃冰箱中取出，融化后放4℃保存，21天内用完。

[0136] 给药时将小鼠头部朝下，使用10μl移液枪向SE模型小鼠的两个鼻孔交替滴加8‑10μl滴鼻制剂，每间隔5min后再次滴加，直至滴鼻制剂滴加总体积为50μl，当日计为D0；

[0137] 连续6d（D1‑6，第1天到第6天）分早、晚两次将上述实施例和对比例制备的外泌体滴鼻制剂或PBS滴鼻制剂施用于小鼠，滴加总体积为25μl/次；

[0138] D7‑9（第7天到第9天）每天给药1次，每次外泌体滴鼻制剂、PBS滴鼻制剂滴加的总体积为25μl；累计给药10天。

[0139] （3）步骤（2）中最后一次施用滴鼻制剂后，采用video‑EEG（脑电图仪）设备实时记录小鼠的脑电图，用于分析小鼠自发癫痫的频率和强度；并记录小鼠的生存曲线。

[0140] （4）统计小鼠自发癫痫的频率和时间时，参考正常小鼠和未发作事件的振幅确定基线，脑电波幅高于基线2.5倍且持续5s及以上的尖波放电，视为一次发作。在5s内发作且脑电图未恢复到基线的癫痫事件被定义为同一事件。

[0141] 4.试验结果

[0142] （1）统计各组试验小鼠D10（结束给药后的第一天）的癫痫发作次数和持续时间，并计算平均值。结果如表4所示。

[0143] 表4 试验结果——癫痫发作次数和持续时间

[0144]

[0145] 由表4的试验结果可知，通过将实施例1‑20、对比例1‑12与对照组进行对比可知，本申请提供的外泌体滴鼻制剂能够显著改善小鼠癫痫的发作次数和发作时间。说明本申请提供的外泌体滴鼻制剂对癫痫有较好的改善作用，能够减少自发癫痫的发生。

[0146] 通过对比实施例3、对比例1‑6、对照组4的检测结果可知，当外泌体滴鼻制剂中包括苯甲酸钠、2‑氯乙基乙烯基醚和诺氟沙星中一种或两种时，制得的外泌体滴鼻制剂对小鼠癫痫的发作次数和发作时间的改善作用较小。说明苯甲酸钠、2‑氯乙基乙烯基醚和诺氟沙星配合使用，能够有效减少自发癫痫的发生。

[0147] 通过对比实施例3、对比例7的检测结果可知，苯甲酸钠、脂肪胺聚氧乙烯醚和诺氟沙星一起使用制得的外泌体滴鼻制剂对小鼠癫痫的发作次数和发作时间的改善作用，远不如苯甲酸钠、2‑氯乙基乙烯基醚和诺氟沙星一起使用制得的外泌体滴鼻制剂对小鼠癫痫的发作次数和发作时间的改善作用。说明2‑氯乙基乙烯基醚与苯甲酸钠、诺氟沙星一起使用，能够有效减少自发癫痫的发生。

[0148] 通过对比实施例3、对比例8的检测结果可知，苯甲酸钠、2‑氯乙基乙烯基醚和环丙沙星一起使用制得的外泌体滴鼻制剂对小鼠癫痫的发作次数和发作时间的改善作用，远不如苯甲酸钠、2‑氯乙基乙烯基醚和诺氟沙星一起使用制得的外泌体滴鼻制剂对小鼠癫痫的发作次数和发作时间的改善作用。说明诺氟沙星与苯甲酸钠、2‑氯乙基乙烯基醚一起使用，能够有效减少自发癫痫的发生。

[0149] 通过对比实施例3、对比例9的检测结果可知，当外泌体滴鼻制剂中透明质酸钠换为海藻糖时制得的外泌体滴鼻制剂对小鼠癫痫的发作次数和发作时间的改善作用，远不如实施例3制得的外泌体滴鼻制剂对小鼠癫痫的发作次数和发作时间的改善作用。说明透明质酸钠与诺氟沙星与苯甲酸钠、2‑氯乙基乙烯基醚组成的稳定剂一起使用，能够有效减少自发癫痫的发生。

[0150] 通过对比实施例1‑5、对照组4的检测结果可知，将稳定剂中苯甲酸钠的添加量控制在4.5‑9.5份的范围内，能够有效减少小鼠癫痫的发作次数和发作时间。进一步地，将稳定剂中苯甲酸钠的添加量控制在6.5‑7.5份的范围内，能够进一步有效减少小鼠癫痫的发作次数和发作时间，降低自发癫痫的发生。

[0151] 通过对比实施例3、实施例6‑9、对照组4的检测结果可知，将稳定剂中2‑氯乙基乙烯基醚的添加量控制在1.3‑2.1份的范围内，能够有效减少小鼠癫痫的发作次数和发作时间。进一步地，将稳定剂中2‑氯乙基乙烯基醚的添加量控制在1.5‑1.9份的范围内，能够进一步有效减少小鼠癫痫的发作次数和发作时间，降低自发癫痫的发生。

[0152] 通过对比实施例3、实施例10‑13、对照组4的检测结果可知，将稳定剂中诺氟沙星的添加量控制在0.5‑2.5份的范围内，能够有效减少小鼠癫痫的发作次数和发作时间。进一步地，将稳定剂中诺氟沙星的添加量控制在1.5‑2份的范围内，能够进一步有效减少小鼠癫痫的发作次数和发作时间，降低自发癫痫的发生。

[0153] 通过对比实施例3、实施例14‑17的检测结果可知，将稳定剂的添加量控制在0.05‑0.65份的范围内，能够有效减少小鼠癫痫的发作次数和发作时间。进一步地，将稳定剂的添加量控制在0.25‑0.45份的范围内，能够进一步有效减少小鼠癫痫的发作次数和发作时间，降低自发癫痫的发生。

[0154] 通过对比实施例3、实施例18‑20、对比例10‑11的检测结果可知，将外泌体滴鼻制剂中外泌体的添加量控制在1‑2份的范围内，能够有效减少小鼠癫痫的发作次数和发作时间。

[0155] 通过对比实施例3、对比例12的检测结果可知，外泌体的来源和制备方法对小鼠癫痫的发作次数和发作时间有明显的影响。由上述可知，利用人诱导多能干细胞诱导获得的外泌体制得的外泌体滴鼻制剂能够有效减少小鼠癫痫的发作次数和发作时间，降低自发癫痫的发生。

[0156] （2）脑电图的监测结果

[0157] D9给药后开始利用EEG（脑电图仪）实时监测试验小鼠的脑电图。图1‑4为D9（第9天）给药后2h时试验小鼠脑电波的监测结果，监测时间为10s。

[0158] 图1为施用实施例3提供的外泌体滴鼻制剂的SE模型小鼠的脑电图（三个图分别指不同的试验小鼠个体）。

[0159] 图2为施用对照组1提供的PBS滴鼻制剂的SE模型小鼠的脑电图（三个图分别指不同的试验小鼠个体）。

[0160] 图3为对照组2的试验小鼠的脑电图（两个图分别指不同的试验小鼠个体）。

[0161] 图4为施用对照组4提供的不加稳定剂的滴鼻制剂的SE模型小鼠的脑电图（三个图分别指不同的试验小鼠个体）。

[0162] 通过对比图1、图2、图3、图4的脑电图，可知实施例3中SE模型小鼠经外泌体滴鼻制剂治疗10d后，异常脑电波的频率和强度（图1）明显低于对照组1（施用PBS滴鼻制剂）的脑电波的频率和强度（图2）和对照组4（施用不加稳定剂的滴鼻制剂）的脑电波的频率和强度（图4），且经外泌体滴鼻制剂治疗后与对照组2的脑电波的频率和强度（图3）类似。进一步对比图1中不同试验小鼠个体的脑电图，可以看出同组内不同的试验小鼠有类似的脑电波形。因此，说明本申请提供的外泌体滴鼻制剂能够有效降低SE模型小鼠的异常脑电波的频率和强度，表明本申请提供的外泌体滴鼻制剂可以有效缓解试验小鼠的癫痫情况。

[0163] （3）试验小鼠的生存曲线

[0164] 利用EEG监测小鼠脑电图的同时，记录小鼠的生存曲线，具体如图4所示。

[0165] 图5为本申请中SE模型小鼠施用实施例3提供的外泌体滴鼻制剂和对照组1提供的PBS滴鼻制剂的生存曲线。

[0166] 由图5可知，截止D14，施用实施例3提供的外泌体滴鼻制剂的试验小鼠的存活率为50%，而施用对照组1提供的PBS滴鼻制剂试验小鼠的存活率为20%。因此，说明本申请提供的外泌体滴鼻制剂能够有效降低自发癫痫引起的死亡率。

[0167] 二、小鼠试验——阿尔兹海默症

[0168] 1.试验小鼠

[0169] APP/PS1双转基因小鼠表达嵌合的小鼠/人淀粉样蛋白前体蛋白（Mo/Hu APP 695 swe）和突变的人早老蛋白1（PS1‑dE9），二者都定位于中枢神经系统CNS神经元，这两个突变都与早发型阿尔兹海默症相关。转基因小鼠在6‑7月龄时脑中出现β‑淀粉样蛋白沉积物。在6‑15月龄之间，小鼠表现出β‑淀粉样蛋白斑块在皮层与小脑中负荷增加，空间学习记忆能力降低，较好地模拟了AD的病理变化及行为学特征，可作为研究AD发病机制及开发AD防治药物的实验工具。

[0170] 取9‑12月龄的APP/PS1双转基因雄鼠（34832‑JAX）36只。分为3组，每组12只。一组对应实施例3制备的外泌体滴鼻制剂，另外两组分别作为对照组3和对照组5，对照组3使用PBS滴鼻制剂，对照组5所用的制剂为不加稳定剂的滴鼻制剂。

[0171] PBS滴鼻制剂的制备方法与实施例3的不同之处在于：利用PBS溶液（Thermo Fisher Scientific）代替制备方法中的外泌体。

[0172] 对照组5中不加稳定剂的滴鼻制剂的制备方法与实施例3的不同之处在于：制备过程中不添加稳定剂。

[0173] 2.试验方法

[0174] （1）按照分组，分别将上述实施例和对比例制备的外泌体滴鼻制剂以及PBS滴鼻制剂施用于小鼠，本申请中实施的操作为滴鼻；

[0175] 具体滴鼻操作如下：

[0176] 将外泌体滴鼻制剂从‑80℃冰箱中取出，融化后放4℃保存，21天内用完。试验期间内，若用完一管外泌体滴鼻制剂，及时从‑80℃冰箱中取出同批次新的一管外泌体滴鼻制剂，融化后4℃保存，继续试验。

[0177] 将小鼠头部朝下，使用10μl移液枪向试验小鼠的两个鼻孔交替滴加滴鼻制剂各5滴，每间隔1‑2min后再次滴加，直至滴鼻制剂滴加总体积为25μL（外泌体滴鼻制剂的滴加量中外泌体含量为20μg），仅在吸气时进行滴加操作，当日计为D0；

[0178] 分别在D0、D3、D7、D14、D21、D28、D35、D42、D49时将上述滴鼻制剂施用于小鼠，滴加总体积为25μL/次。

[0179] （2）D50进行治疗后评价：包括试验小鼠行为学评估和试验小鼠脑组织验证因子的检测。

[0180] 3.试验结果

[0181] （1）试验小鼠脑组织中炎症因子的含量检测

[0182] 取试验小鼠脑组织，加入PBS清洗，放入2ml离心管，均浆处理，用于检测炎性因子。

[0183] 使用MSD（多因子检测技术）检测试验小鼠脑组织中炎症因子的含量，检测结果如表5所示。

[0184] 表5 试验结果——脑组织中炎症因子的含量

[0185]

[0186] 由表5的试验结果可知，通过将实施例3与对照组3、对照组5进行对比可知，本申请提供的外泌体滴鼻制剂能够显著降低小鼠脑组织中炎症因子IL‑1β含量，说明本申请提供的外泌体滴鼻制剂能够有效降低阿尔兹海默症小鼠的脑组织炎症。

[0187] （2）旷场试验

[0188] 旷场试验是用来观察小鼠自发性探索运动活性和焦虑行为。本试验使用摄像机测量试验小鼠在旷场反应箱的外围和中心区域的运动情况。

[0189] 旷场试验的试验装置包括旷场反应箱（箱高30cm，底面边长72cm×72cm，内壁涂黑）和数据自动采集和处理系统（利用计算机软件设计不同的观察参数）两部分组成。试验在安静的环境下进行，将小鼠放入箱内底面，同时进行摄像和计时，观察5min后停止摄像，通过计算机获取需检测的各项观察参数。

[0190] 下面以施用实施例3提供的外泌体滴鼻制剂的试验小鼠、对照组3使用PBS制剂的试验小鼠、对照组5使用不加稳定剂的滴鼻制剂的试验小鼠为例。上述两种试验小鼠旷场试验的结果如图6、图7、图8所示。

[0191] 图6为本申请实施例3提供的外泌体滴鼻制剂的部分试验小鼠、对照组3使用PBS制剂的部分试验小鼠、对照组5使用不加稳定剂的滴鼻制剂的部分试验小鼠的旷场试验运动路径图。

[0192] 图7为本申请实施例3提供的外泌体滴鼻制剂的部分试验小鼠（外泌体滴鼻剂）、对照组3使用PBS制剂的部分试验小鼠（PBS滴鼻剂）、对照组5使用不加稳定剂的滴鼻制剂的部分试验小鼠（外泌体滴鼻剂‑无稳定剂）的旷场试验数据统计结果一。

[0193] 图8为本申请实施例3提供的外泌体滴鼻制剂的部分试验小鼠（外泌体滴鼻剂）、对照组3使用PBS制剂的部分试验小鼠（PBS滴鼻剂）、对照组5使用不加稳定剂的滴鼻制剂的部分试验小鼠（外泌体滴鼻剂‑无稳定剂）的旷场试验数据统计结果二。

[0194] 通过对比图6、图7和图8的试验结果可知，经过本申请提供的外泌体滴鼻制剂处理后，试验小鼠在平均速度、总距离、外围距离以及中心区域时间（中心时间）上均高于对照组3和对照组5的试验小鼠，且进入中心区域的次数（进入次数）和距离（中心距离）也显著高于对照组3和对照组5的试验小鼠。因此，表明本申请提供的外泌体滴鼻制剂对APP/PS1双转基因小鼠自发性探索运动活性和焦虑行为有明显的改善效果。

[0195] 本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。