肿瘤标记物及其在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用

摘要

本发明公开了肿瘤标记物及其在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用，属于表观遗传及肿瘤学领域。在本发明中，我们研究了CRC患者肿瘤黏膜和邻近正常黏膜中的3个不同基因IGFBP7、BLCAP和PPIA的6个RNA编辑位点IGFBP7:chr4:57110068、IGFBP7:chr4:57110120、BLCAP:chr20:37519170、BLCAP:chr20:37519161、BLCAP:chr20:37519131和PPIA:chr7:44802500的编辑水平存在明显差异，此3种不同基因与癌症的发生发展存在关联，并且其RNA编辑的组合用于诊断CRC的发生具有很高的准确率。

权利要求

1.一种检测结直肠癌分子标志物RNA编辑水平的试剂在制备诊断结直肠癌和/或预测、评估或鉴定结直肠癌患者风险等级的产品中的应用，其特征在于，所述分子标志物以人类参考基因组hg38为基准，包括以下腺苷‑肌苷（A‑I）RNA编辑位点IGFBP7:chr4:57110068、IGFBP7:chr4:57110120、BLCAP:chr20:37519170、BLCAP:chr20:37519161、BLCAP:chr20:

37519131和PPIA:chr7:44802500；所述产品通过检测结直肠癌分子标志物的RNA编辑水平来诊断结直肠癌和/或预测、评估或鉴定结直肠癌患者风险等级。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括预测结直肠癌患者风险等级的生物芯片、检测结直肠癌的试剂盒、诊断结直肠癌和/或预测结直肠癌患者风险等级的装置。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述生物芯片包括固相载体以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性地对应于结直肠癌分子标志物。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述装置中，包含特异性检测所述RNA编辑位点：IGFBP7:chr4:57110068、IGFBP7:chr4:57110120、BLCAP:chr20:37519170、BLCAP:chr20:37519161、BLCAP:chr20:37519131和PPIA:chr7:44802500的RNA编辑水平的一个或更多个装置。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中含有检测所述结直肠癌分子标志物表达量的试剂。

说明书

肿瘤标记物及其在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及肿瘤标记物及其在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用，属于表观遗传及肿瘤学领域。

背景技术

[0002] 结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是全球第三大最常见的癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因。及时的诊断是CRC的治疗及预后的关键。

[0003] RNA编辑属于表观遗传学的一种。表观遗传指的是基因核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达的可遗传改变，其主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA、RNA编辑和基因组印记等。RNA编辑是改变RNA序列的重要转录后表观遗传调控。最常见的RNA编辑类型是腺苷脱氨酶ADAR家族介导的腺苷‑肌苷(A‑I)转换。RNA编辑可以增加转录组或蛋白质组的多样性，并且可能改变编码的蛋白质序列或RNA的稳定性和转运。研究表明，RNA编辑在肿瘤或免疫等过程中起重要的调控作用。在CRC中，RNA编辑被报道并证明与CRC的发展相关。A‑I编辑水平与CRC患者的生存率呈显著负相关，表明RNA编辑对癌症治疗具有重要意义。在CRC中，也有研究报道了部分肿瘤组织和正常组织的差异RNA编辑基因及位点。

发明内容

[0004] 发明人在研究中发现，CRC患者肿瘤黏膜和邻近正常黏膜中有3个不同基因的6个编辑位点的RNA编辑存在显著差异，此3种不同基因与癌症的发生发展存在关联。

[0005] 在本发明中，我们研究了CRC患者肿瘤黏膜和邻近正常黏膜中的3个不同基因——胰岛素样生长因子结合蛋白7(insulin like growth factor binding protein 7，IGFBP7)、膀胱癌相关蛋白基因(BLCAP apoptosis inducing factor,BLCAP)和肽酰脯氨酰异构酶A(peptidylprolyl isomerase A，PPIA)的6个RNA编辑位点IGFBP7:chr4:57110068、IGFBP7:chr4:57110120、BLCAP:chr20:37519170、BLCAP:chr20:37519161、BLCAP:chr20:37519131和PPIA:chr7:44802500的编辑水平存在明显差异，此3种不同基因与CRC的发生发展存在关联，并且上述6个差异RNA编辑位点的组合用于诊断CRC的发生具有很高的准确率。

[0006] 本发明提供了一种基于RNA编辑水平的CRC分子标志物，以人类参考基因组hg38为基准，所述分子标志物包括以下RNA编辑位点：IGFBP7:chr4:57110068、IGFBP7:chr4:57110120、BLCAP:chr20:37519170、BLCAP:chr20:37519161、BLCAP:chr20:37519131和PPIA:chr7:44802500。

[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述RNA编辑位点：IGFBP7:chr4:57110068为，NCBI编号为NC_000004.12的染色体上的第57110068位。

[0008] 所述RNA编辑位点：IGFBP7:chr4:57110120为，NCBI编号为NC_000004.12的染色体上的第57110120位。

[0009] 所述RNA编辑位点：BLCAP:chr20:37519170为，NCBI编号为NC_000020.11的染色体上的第37519170位。

[0010] 所述RNA编辑位点：BLCAP:chr20:37519161为，NCBI编号为NC_000020.11的染色体上的第37519161位。

[0011] 所述RNA编辑位点：BLCAP:chr20:37519131为，NCBI编号为NC_000020.11的染色体上的第37519131位。

[0012] 所述RNA编辑位点：PPIA:chr7:44802500为，NCBI编号为NC_000007.14的染色体上的第44802500位。

[0013] 本发明还提供了上述CRC分子标志物在制备检测CRC的产品中的应用。

[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述产品包括但不限于，预测CRC患者风险等级的生物芯片、检测CRC的试剂盒。

[0015] 本发明还提供了一种预测CRC患者风险等级的生物芯片，所述生物芯片包括固相载体以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性地对应于上述CRC分子标志物。

[0016] 本发明还提供了一种用于检测或诊断CRC的装置，所述装置中，包含特异性检测上述RNA编辑位点：IGFBP7:chr4:57110068、IGFBP7:chr4:57110120、BLCAP:chr20:37519170、BLCAP:chr20:37519161、BLCAP:chr20:37519131和PPIA:chr7:44802500RNA编辑水平的一个或更多个装置。

[0017] 本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒中含有上述CRC分子标志物或含有上述装置，或含有上述生物芯片。

[0018] 在本发明的一种实施方式中，所述的诊断试剂盒所使用的检测方法为转录组测序，发明人发现，将转录组测序结果中PPIA、IGFBP7和BCLAP基因共6个差异编辑位点的RNA编辑差异水平组合起来作为诊断CRC有良好的灵敏度和特异性,用于诊断CRC具有很高的准确率。

[0019] 在本发明的一种实施方式中，为了验证本发明的诊断有效性，发明人通过以下方法进行验证：

[0020] (1)收集病人肿瘤组织及癌旁对照组织样本和临床资料。

[0021] (2)肿瘤组织中RNA编辑差异的验证:通过公开数据分析和转录组测序后数据分析，获得组织RNA编辑的数据，验证RNA编辑在CRC及癌旁正常组织中的差异。

[0022] 在本发明的一种实施方式中，本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的组织样本,系统收集完整的临床资料等，采用高通量测序方法验证。具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

[0023] 1、研究样本的选择：

[0024] (1)经病理学明确诊断的CRC病例；

[0025] (2)患者CRC组织样本收集；

[0026] (3)癌旁正常对照组织样本收集。

[0027] 2、数据库数据分析

[0028] (1)CRC转录组测序数据；

[0029] (2)RNA编辑分析；

[0030] (3)筛选CRC组织与癌旁正常组织对照样本中的差异RNA编辑基因及位点；

[0031] 3、转录组测序

[0032] (1)肿瘤及正常组织样本RNA；

[0033] (2)RNA编辑分析；

[0034] (3)比较CRC组织与癌旁正常组织对照样本中,IGFBP7、BLCAP和PPIA中RNA编辑的差异。

[0035] 本发明还提供了一种CRC分子标志物在制备预测、评估或鉴定CRC患者风险等级、指导用药选择或疗法选择的产品中的用途，以人类参考基因组hg38为基准，所述分子标志物包括以下RNA编辑位点：IGFBP7:chr4:57110068、IGFBP7:chr4:57110120、BLCAP:chr20:37519170、BLCAP:chr20:37519161、BLCAP:chr20:37519131和PPIA:chr7:44802500。

[0036] 本发明还提供了一种检测CRC分子标志物存在或水平的试剂在制备预测、评估或鉴定CRC患者风险等级、指导用药选择或疗法选择的产品中的用途，以人类参考基因组hg38为基准，所述分子标志物包括以下RNA编辑位点：IGFBP7:chr4:57110068、IGFBP7:chr4:57110120、BLCAP:chr20:37519170、BLCAP:chr20:37519161、BLCAP:chr20:37519131和PPIA:chr7:44802500。

[0037] 本发明还提供了一种检测CRC的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒中含有能够检测上述分子标志物表达量的试剂。

[0038] 本发明还提供了一种判断CRC风险等级的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒中含有能够检测上述分子标志物表达量的试剂。

[0039] 在本发明的一种实施方式中，通过对6个RNA编辑位点的水平差异分别在肿瘤及非肿瘤，高低分期中进行logistics回归分析，得到公式：

[0040] (1)肿瘤和非肿瘤诊断：

[0041] n＝26.812‑0.358x1‑0.095x2‑0.607x3+0.952x4+0.106x5+0.061x6[0042] 截断值：P1＝0.666，大于该值诊断为肿瘤；

[0043] x1～x6分别为IGFBP7:chr4:57110068、IGFBP7:chr4:57110120、BLCAP:chr20:37519170、BLCAP:chr20:37519161、BLCAP:chr20:37519131和PPIA:chr7:44802500的RNA编辑水平。

[0044] 在本发明的一种实施方式中，分期判断：

[0045] m＝‑2.474+0.070x1‑0.452x2+0.071x3‑0.102x4+0.375x5+0.029x6；

[0046] 截断值：P2＝0.194，大于该值诊断为高分期。

[0047] x1～x6分别为IGFBP7:chr4:57110068、IGFBP7:chr4:57110120、BLCAP:chr20:37519170、BLCAP:chr20:37519161、BLCAP:chr20:37519131和PPIA:chr7:44802500的RNA编辑水平。

[0048] 有益效果

[0049] (1)本发明通过结合六个RNA编辑位点的编辑水平差异，以高于90％的真实性判断CRC的发生，此效果在人群1和人群2中得到验证；

[0050] (2)本发明通过结合六个RNA编辑位点的编辑水平差异，以高于70％的真实性判断CRC的高低分期，此效果在人群1和人群2中得到验证；

[0051] (3)本发明通过结合六个RNA编辑位点的编辑水平差异生成的分类器，较于结合该六个位点的3个基因表达水平差异生成的分类器判断CRC的发生效果更佳；

附图说明

[0052] 图1：6个RNA编辑位点在病人的CRC组织和正常组织中存在显著差异(p<0.05)。

[0053] 图2：ROC曲线分析显示在人群1中6个RNA编辑位点的组合在CRC组织和癌旁正常组织中诊断的表现。

[0054] 图3：ROC曲线分析显示在人群1中6个RNA编辑位点的组合在CRC组织高分期和低分期中诊断的表现。

[0055] 图4：ROC曲线分析显示在人群2中6个RNA编辑位点的组合在CRC组织和癌旁正常组织中诊断的表现。

[0056] 图5：ROC曲线分析显示在人群2中6个RNA编辑位点的组合在CRC组织高分期和低分期中诊断的表现。

具体实施方式

[0057] 实施例1：样本收集及处理

[0058] 临床收集CRC患者分别取肿瘤组织及癌旁正常组织(新鲜肿瘤组织和手术区域内距离肿瘤最远位置(大于5cm)的癌旁正常组织)，取得活检组织后立即将一部分组织进行RNA提取，另一部分组织装入冷冻管中置于液氮进行冻存，液氮中冻存的组织转移至‑80℃冰箱进行长期保存，系统收集病人临床资料，CRC患者情况统计如表1和表2所示。

[0059] 表1：人群1CRC患者情况统计表

[0060]

[0061] 表2：人群2CRC患者情况统计表

[0062]

[0063] 实施例2：RNA提取转录组测序

[0064] 1、取肿瘤组织和癌旁正常部位组织，通过RNA提取获得转录组待测序样本，通过转录组测序分析得到每个样本的RNA编辑水平，具体步骤如下：

[0065] 肠黏膜组织RNA提取：

[0066] 将冻存于‑80℃冰箱的CRC患者的肿瘤组织和癌旁正常组织活检组织取出，放置在生物安全柜中，置于冰上融解，待组织溶解后使用经DEPC水浸泡后高压灭菌的镊子和剪刀剪取部分组织置于无RNA酶的EP管中。在EP管中将组织剪碎，加入200ul Trizol，并置于冰上保存。进行下一个样品剪取前，将镊子和剪刀置于75％乙醇中浸泡，后在酒精灯上烧灼，待镊子和剪刀冷却后再剪取下一个活检组织。

[0067] (1)使用组织研磨器对浸泡在Trizol中的组织进行研磨，直至组织与Trizol充分融合，再在EP管中加入800ul Trizol进行混匀，待组织进一步溶解于Trizol后，进行RNA提取；

[0068] (2)按照20％的体积在溶有组织的Trizol中加入核酸提取液，盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色，室温静置5分钟；

[0069] (3)按照12000g 4℃条件离心15分钟，从离心机中取出EP管；

[0070] (4)接着吸取上清液，并将其转移到新的EP管中(千万不要吸出白色中间层)，在吸取出来的上清里加入Trizol体积一半的异丙醇，把EP管进行上下颠倒充分混匀后，在室温下静置10min，12000g 4℃离心10分钟；

[0071] (5)丢弃上清液后，加入与Trizol同样体积的75％乙醇，上下颠倒洗涤离心管管壁，7500g 4℃离心5min后小心弃去上清；

[0072] (6)在超净工作台中把EP管盖打开，在室温下进行干燥，待酒精完全挥发后加入适量的DEPC水溶解RNA沉淀物，获得CRC组织和癌旁正常组织样本RNA。

[0073] 2、转录组测序

[0074] (1)RNA测序数据的获取：

[0075] 人群1共采集72对原发肿瘤组织及癌旁正常组织。有完整分期数据的患者为38人，其中低分期22人，高分期16人。人群2共采集35个患者的肿瘤组织26例及癌旁正常组织16例，其中低分期20例，高分期15例，以上组织样本均获得转录组测序数据；

[0076] (2)RNA测序数据的比对：

[0077] 以上获得的转录组原始测序数据，利用FASTQC软件进行质量控制分析.质控合格的测序读段(reads)，利用RNA STAR(2.7.0e版本)软件与人的hg38的基因组序列进行比对，分析其RNA剪接接头，将其定位(map)到基因组上，并生成BAM格式的比对结果文件.利用samtools(1.9版本)软件将BAM文件中的读段去重复(deduplication)，只保留有单一定位的读段，并使用GATK(4.1.3版本)软件对BAM文件进行碱基质量评分重校准；

[0078] (3)RNA编辑位点的鉴定及注释：

[0079] 利用VarScan(2.4版本)软件对校准处理后的BAM文件进行RNA单核苷酸变异(single nucleotide variant，SNV)识别识别标准设为碱基质量≥25，测序深度≥10，U碱基(RNA测序中被转换为T碱基)深度≥2且编辑频率≥1％，并用VarScan的fpfilter命令和默认参数过滤假阳性变。SNV的注释使用Ensembl Variant Effect Predictor(VEP，https://www.ensembl.org/vep)进行；

[0080] (4)统计学分析：

[0081] 样本间的组间RNA编辑水平或基因表达水平的比较使用配对或配对Kruskal‑Wallis(KW)非参数检验进行。以P<0.05作为显著差异筛选标准。

[0082] 结果显示：IGFBP7:chr4:57110068、IGFBP7:chr4:57110120、BLCAP:chr20:37519170、BLCAP:chr20:37519161、BLCAP:chr20:37519131和PPIA:chr7:44802500位点的RNA编辑水平在肿瘤组和对照组具有显著差异(图1)，其中IGFBP7:chr4:57110068和IGFBP7:chr4:57110120RNA编辑水平在肿瘤组显著下降，BLCAP:chr20:37519170、BLCAP:
chr20:37519161、BLCAP:chr20:37519131和PPIA:chr7:44802500RNA编辑水平在肿瘤组显著上升。

[0083] 实施例3：生成RNA差异编辑位点组合物对肿瘤因子诊断的分类器

[0084] 选取实施例1收集的26个CRC患者肿瘤组织及16个癌旁组织，取得活检组织后立即将一部分装入冷冻管中置于液氮进行冻存，液氮中冻存的组织转移至‑80℃冰箱进行长期保存直至刮取肠黏膜，提取黏膜组织RNA，用于转录组测序。测序结果中的RNA编辑水平用于ROC曲线的建立，首先使用SPSS软件对6个不同RNA编辑位点(RNA编辑位点：IGFBP7:chr4:57110068、IGFBP7:chr4:57110120、BLCAP:chr20:37519170、BLCAP:chr20:37519161、BLCAP:chr20:37519131和PPIA:chr7:44802500)的编辑水平进行logistics回归求得预测值，将预测值设置为检验变量，状态变量设置为0和1，在肿瘤和非肿瘤组织分析中将肿瘤组织组设置为1，在分期分析中将高分期组设置为1，使用SPSS软件制作得出ROC曲线，得到图
2、图3、图4和图5，如图所示，ROC曲线下面积AUC分别为0.902，0.730，0.990和0.771。选择最接近左上角一点即约登指数最大值作为截断值。截断值(cut off value)即判断标准，是判定试验阳性与阴性的界值。在图4中截断值处灵敏度为96.2％，特异度为100％，在图5中截断值处灵敏度为100％，特异度为42.9％。

[0085] 此外，如表3和表4所示，我们利用该6个位点的3个基因mRNA表达水平生成分类器。在我们的数据和公开数据中，IGFBP7和BLCAP的RNA编辑水平差异用于对CRC的发生的判断效果均优于mRNA表达水平差异。结合6个位点的RNA编辑水平或3个基因的mRNA表达水平生成的分类器，在我们的数据中RNA编辑水平差异生成的分类器真实性高于mRNA表达水平差异生成的分类器，在公开数据中两者真实性相当。

[0086] 表3：人群1中6个RNA编辑位点作为独立指标及3个基因表达水平独立和组合在CRC组织和癌旁正常组织中诊断的表现(AUC：ROC曲线下面积)

[0087]

[0088] 表4：人群2中6个RNA编辑位点作为独立指标及3个基因表达水平独立和组合在CRC组织和癌旁正常组织中诊断的表现(AUC：ROC曲线下面积)

[0089]

[0090] 结果显示：在人群1和人群2中，用六个位点组合的RNA编辑水平差异生成的分类器，判断CRC发生的真实性分别为90.2％和99.0％，判断CRC高低分期的真实性分别为73.0％和77.1％。此外，与mRNA表达水平差异生成的分类器相比，RNA编辑水平生成的分类器真实性更高。

[0091] 实施例4：RNA差异编辑位点组合物对肿瘤因子的诊断

[0092] 1、通过对6个RNA编辑位点的水平差异分别在肿瘤及非肿瘤，高低分期中进行logistic回归分析，得到公式：

[0093] (1)肿瘤和非肿瘤诊断：

[0094] n＝26.812‑0.358x1‑0.095x2‑0.607x3+0.952x4+0.106x5+0.061x6；

[0095] 截断值：P1＝0.666，大于该值诊断为肿瘤；

[0096] x1～x6分别为IGFBP7:chr4:57110068，IGFBP7:chr4:57110120，BLCAP:chr20:37519170，BLCAP:chr20:37519161，BLCAP:chr20:37519131，PPIA:chr7:44802500的RNA编辑水平。

[0097] (2)分期判断：

[0098] m＝‑2.474+0.070x1‑0.452x2+0.071x3‑0.102x4+0.375x5+0.029x6；

[0099] 截断值：P2＝0.194，大于该值诊断为高分期。

[0100] x1～x6分别为IGFBP7:chr4:57110068，IGFBP7:chr4:57110120，BLCAP:chr20:37519170，BLCAP:chr20:37519161，BLCAP:chr20:37519131，PPIA:chr7:44802500的RNA编辑水平。

[0101] 2、利用上述得到的公式，判断组织中是否含有肿瘤因子，或判断组织是否为肿瘤组织或是否为高分期

[0102] 按照上述方法，分别对多名受试者进行检测，将各RNA编辑水平代入上面的公式中，对其进行肿瘤及分期的诊断。结果显示，采用本申请的方法进行检测获得的结果与病理学诊断结果一致。

[0103] 例1：选取病人1的组织样本，提取肿瘤肠黏膜组织RNA，检测RNA编辑水平，并带入公式，求得P1＝0.999，大于截断值0.666，判断为肿瘤，与实际情况相符，P2＝0.959，大于截断值0.194，诊断为高分期，与实际情况相符。

[0104] 例2：选取病人2的组织样本，提取肿瘤肠黏膜组织RNA，检测RNA编辑水平，并带入公式，求得P1＝0.967，大于截断值0.666，判断为肿瘤，与实际情况相符，P2＝0.102，小于截断值0.194，诊断为低分期，与实际情况相符。

[0105] 例3：选取病人3的组织样本，提取肿瘤肠黏膜组织RNA，检测RNA编辑水平，并带入公式，求得P1＝1.000，大于截断值0.666，判断为肿瘤，与实际情况相符，P2＝0.518，大于截断值0.194，诊断为高分期，与实际情况相符。

[0106] 例4：选取病人4的组织样本，提取正常对照肠黏膜组织RNA，检测RNA编辑水平，并带入公式，求得P1＝0.243，小于截断值0.666，判断为正常，与实际情况相符。

[0107] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。