一种粘附型水凝胶及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种粘附型水凝胶及其制备方法与应用，涉及生物材料技术领域。所述粘附型水凝胶包括采用氨基化透明质酸、光板机分子修饰的透明质酸和载药介孔有机硅纳米粒子交联形成，所述载药介孔有机硅纳米粒子包括介孔有机硅纳米粒子、以及负载于所述介孔有机硅纳米粒子上的小檗碱和/或柚皮苷。本发明的水凝胶具有一定的粘附性，且生物相容性好，可较好地粘附于口腔患处，并能实现局部缓慢释放药物，减少药物的失效，进而达到更好的药效；水凝胶体系负载的小檗碱和柚皮苷可以发挥良好的协同作用，同时实现抗菌、抗炎和促牙周骨组织修复性再生的效应。本发明不仅解决了传统材料不具有粘性的问题，还解决了小檗碱和柚皮苷的给药问题。

权利要求

1.一种用于制备牙周炎治疗产品的粘附型水凝胶，其特征在于其包括：采用氨基化透明质酸、光板机分子修饰的透明质酸和载药介孔有机硅纳米粒子交联形成；所述载药介孔有机硅纳米粒子包括介孔有机硅纳米粒子、以及负载于所述介孔有机硅纳米粒子上的小檗碱和柚皮苷；

按重量份数计，所述光板机分子修饰的透明质酸的重量份为1‑10份，氨基化透明质酸的重量份为0.5‑4份，介孔有机硅纳米粒子的重量份为0.01‑4份；

所述光板机分子修饰的透明质酸的制备方法包括如下步骤：

在室温下，将HA溶解在纯水中，加入EDC活化HAMA上的羧基，充分搅拌后，加入NHS，继续充分搅拌后，将4,4‑(4‑(羟甲基)‑2‑甲氧基‑5‑硝基苯氧基)丁酰乙二胺加入到上述溶液中，常温反应，反应后的溶液进行透析纯化处理，最后冻干，制得所述光板机分子修饰的透明质酸；

所述载药介孔有机硅纳米粒子的制备方法包括如下步骤：

将小檗碱和柚皮苷溶解或分散于水中，得到料液A；将介孔有机硅纳米粒子分散于水中，然后与料液A混合均匀，在室温下保持过夜，固液分离，洗涤固相产物，得到所述载药介孔有机硅纳米粒子。

2.根据权利要求1所述的用于制备牙周炎治疗产品的粘附型水凝胶，其特征在于：所述交联为光交联。

3.根据权利要求1所述的用于制备牙周炎治疗产品的粘附型水凝胶，其特征在于：按重量份数计，所述光板机分子修饰的透明质酸的重量份为4‑8份，氨基化透明质酸的重量份为

1.5‑2.5份，介孔有机硅纳米粒子的重量份为0.1‑0.5份。

4.根据权利要求1所述的用于制备牙周炎治疗产品的粘附型水凝胶，其特征在于，所述氨基化透明质酸的制备方法包括如下步骤：将透明质酸钠和乙二酸二酰肼溶于去离子水中，搅拌均匀，得到溶液C；

将1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸和1‑羟基苯并三唑水合物溶于二甲亚砜的水溶液中，得到溶液D；

将溶液D滴加至溶液C中，调节pH并反应，反应结束后加入盐，并用乙醇沉淀氨基化透明质酸，洗涤，透析，去除盐后，冻干，制得氨基化透明质酸。

5.权利要求1‑4中任一项所述的用于制备牙周炎治疗产品的粘附型水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将光板机分子修饰的透明质酸溶于含LAP的PBS中，得到溶液A；

(2)将氨基化透明质酸和载药介孔有机硅纳米粒子溶于PBS中，得到溶液B；

(3)将溶液A与溶液B混合，交联固化，得到所述粘附型水凝胶。

6.权利要求1‑4中任一项所述的用于制备牙周炎治疗产品的粘附型水凝胶在制备牙周炎治疗产品中的应用。

说明书

一种粘附型水凝胶及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种粘附型水凝胶及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 牙周疾病是一种普遍的慢性炎症，会影响牙齿周围的组织，包括牙龈，牙周膜和牙槽骨导致形成活动性，骨质流失，最终导致牙齿脱落。牙周疾病由宿主免疫系统和病原体之间复杂的相互作用引起，并影响整个牙周膜。

[0003] 为了抑制病情发展和保留牙槽骨结构，进行抗炎和成骨干预显得至关重要。

发明内容

[0004] 为克服现有的技术缺陷，本发明提供了一种粘附型水凝胶及其制备方法。所述粘附型水凝胶具有一定的粘附性，负载有小檗碱和/或柚皮苷，能发挥抗菌、抗炎和促牙周骨组织修复再生的作用。本发明还提供了所述粘附型水凝胶的应用，包括所述粘附型水凝胶在制备牙周炎治疗产品中的应用。

[0005] 为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：

[0006] 第一方面，本发明提供了一种粘附型水凝胶，其包括采用氨基化透明质酸、光板机分子修饰的透明质酸和载药介孔有机硅纳米粒子交联形成，所述载药介孔有机硅纳米粒子包括介孔有机硅纳米粒子、以及负载于所述介孔有机硅纳米粒子上的小檗碱和/或柚皮苷。

[0007] 优选地，所述交联为光交联，更优选为紫外光交联。

[0008] 小檗碱是从黄连中分离出来的一种具有多种药理作用的季铵盐生物碱，由于其广2+
谱抗菌和抗炎作用，通常用于胃肠道感染。此外，小檗碱通过调节细胞内Ca 水平、产生细胞因子和清除自由基来减少粘膜炎症。更重要的是，小檗碱作为一种天然抗菌剂，还可以抑制微生物粘附和生物膜生长，并且没有证据表明诱导细菌耐药性。

[0009] 柚皮苷，又称柚苷、柑橘甙等，是一种常见于柑橘类水果中的多甲氧基化类黄酮。柚皮苷可促进人牙周膜干细胞成骨分化。在小鼠心肌炎症模型中，柚皮苷可通过激活磷脂酰肌醇3‑激酶‑丝氨酸/苏氨酸激酶(phosphatidylinositol3‑kinase‑，PI3K‑Akt)信号通路，以抑制NF‑κB核转运，同时也可以显著下调IL‑6和TNF水平；并且它同时可以有效抑制口腔中致龋细菌的作用。

[0010] 为此，本发明选择小檗碱和/或柚皮苷作为活性成分，其中，小檗碱作为炎症调节剂，柚皮苷作为成骨剂，可有效治疗牙周炎。

[0011] 由于直接使用小檗碱和/或柚皮苷，存在给药方式困难的问题。为了克服这些局限性并方便牙科医生临床应用，本发明制备了具有强粘附能力的可注射光交联水凝胶并将其用于牙周炎局部给药。同时采用介孔有机硅纳米粒子(MONs)包封小檗碱和/或柚皮苷，实现了活性成分在组织局部缓慢释放的目的。

[0012] 透明质酸(HA)，俗称“玻尿酸”，是由D‑葡萄糖醛酸和N‑乙酰氨基葡萄糖以糖苷键交替连接而成的一种线性多聚糖。在口腔组织中，牙周软组织、牙龈和牙周韧带中的HA含量高于牙槽骨和牙骨质等硬组织；口腔黏膜的组织结构与皮肤相似，由上皮和固有层组成，HA主要存在于固有层。HA对牙周疾病、口腔黏膜病、牙体牙髓疾病的治疗具有良好的辅助作用，但HA用于口腔护理的研究鲜有报道。

[0013] 本发明以常规的HA为原料，对HA进行改性接枝4‑(4‑(羟甲基)‑2‑甲氧基‑5‑硝基苯氧基)丁酰乙二胺(NB)，NB化合物中的邻硝基羟甲基苯环结构在紫外光照射下可转变为邻亚硝基苯甲醛结构，该醛基可与氨基发生反应并形成亚胺(C＝N)。为充分利用NB的这一特性，再通过添加氨基化修饰的透明质酸(AHA)，使得HA‑NB中的NB结构与AHA上的氨基在紫外光照射下产生第二重交联，增强水凝胶的机械强度。

[0014] 优选地，所述粘附型水凝胶的制备方法包括如下步骤：

[0015] (1)将光板机分子修饰的透明质酸(HA‑NB)溶于含LAP的PBS中，得到溶液A；

[0016] (2)将氨基化透明质酸和载药介孔有机硅纳米粒子溶于PBS中，得到溶液B；

[0017] (3)将溶液A与溶液B混合，交联固化，得到所述粘附型水凝胶。

[0018] 优选地，按重量份数计，HA‑NB的重量份为1‑10份，AHA的重量份为0.5‑4份，介孔有机硅纳米粒子的重量份为0.01‑4份。

[0019] 更优选地，按重量份数计，HA‑NB的重量份为4‑8份，AHA的重量份为1.5‑2.5份，介孔有机硅纳米粒子的重量份为0.1‑0.5份。

[0020] 最优选地，按重量份数计，HA‑NB的重量份为6份，AHA的重量份为2份，介孔有机硅纳米粒子的重量份为0.2份。

[0021] 优选地，所述载药介孔有机硅纳米粒子负载的药物包括小檗碱和柚皮苷。水凝胶体系同时负载小檗碱和柚皮苷，可以发挥良好的协同作用，同时实现抗菌、抗炎和促牙周骨组织修复性再生的效果。

[0022] 优选地，所述载药介孔有机硅纳米粒子中，小檗碱的负载量为5％‑10％，柚皮苷的负载量为5％‑10％。

[0023] 更优选地，所述载药介孔有机硅纳米粒子中，小檗碱的负载量为8.26％，柚皮苷的负载量为7.20％。该负载量下，牙周炎的治疗更好，且成本更低。

[0024] 优选地，所述载药介孔有机硅纳米粒子的制备方法包括如下步骤：将小檗碱和/或柚皮苷溶解或分散于水中，得到料液A；将介孔有机硅纳米粒子分散于水中，然后与料液A混合均匀，在室温下保持搅拌状态过夜，固液分离，洗涤固相产物，得到所述载药介孔有机硅纳米粒子。

[0025] 优选地，所述介孔有机硅纳米粒子的制备方法包括如下步骤：将十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)和三乙胺(TEA)溶解在水中，充分搅拌，然后转移到油浴锅中；将正硅酸乙酯(TEOS)滴加到上述溶液中反应，然后加入二氧化硅前体混合物反应，反应完成后，离心，获得前驱体，乙醇洗涤；将所述前驱体分散于含NaCl的甲醇中，搅拌提取CTAC模板，提取过程至少重复3次以保证完全去除CTAC，然后分散在水中，然后转移到加热油基中，添加氨水，反应蚀刻掉内部MSN核心，离心水洗，得到所述介孔有机硅纳米粒子。

[0026] 优选地，所述二氧化硅前体混合物为(双‑[3‑(三乙氧基硅)丙基]‑二硫化物(BTES)和TEOS的混合物。

[0027] 优选地，所述氨基化透明质酸(AHA)的制备方法包括如下步骤：

[0028] 将透明质酸钠(HA)和乙二酸二酰肼(ADH)溶于去离子水中，搅拌均匀，得到溶液C；

[0029] 将1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸(EDC)和1‑羟基苯并三唑水合物(HOBt)溶于二甲亚砜的水溶液中，得到溶液D；

[0030] 将溶液D滴加至溶液C中，调节pH并反应，反应结束后加入盐，并用乙醇沉淀AHA，洗涤，透析，去除盐后，冻干，制得氨基化透明质酸。

[0031] 优选地，所述光板机分子修饰的透明质酸(HA‑NB)的制备方法包括如下步骤：在室温下，将HA溶解在纯水中，加入EDC活化HAMA上的羧基，充分搅拌后，加入NHS，继续充分搅拌后，将4,4‑(4‑(羟甲基)‑2‑甲氧基‑5‑硝基苯氧基)丁酰乙二胺(NB)加入到上述溶液中，常温反应，反应后的溶液进行透析纯化处理，最后冻干，制得HA‑NB。

[0032] 第二方面，本发明提供了所述粘附型水凝胶的应用，包括所述粘附型水凝胶在制备牙周炎治疗产品中的应用。

[0033] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0034] 本发明的水凝胶具有一定的粘附性，且生物相容性好，可较好地粘附于口腔患处，并能实现局部缓慢释放药物，减少药物的失效，进而达到更好的药效；水凝胶体系负载的小檗碱和柚皮苷可以发挥良好的协同作用，同时实现抗菌、抗炎和促牙周骨组织修复性再生的效应。本发明不仅解决了传统材料不具有粘性的问题，还解决了小檗碱和柚皮苷的给药问题。

附图说明

[0035] 图1为MONs纳米粒子的TEM图；

[0036] 图2为HA、AHA和HA‑NB的核磁氢谱图；

[0037] 图3为对比例1‑3的水凝胶的溶胀曲线图；

[0038] 图4为对比例1和实施例5的水凝胶的生物相容性测试结果图；

[0039] 图5为对比例1和实施例5的水凝胶的ALP活性检测结果图。

具体实施方式

[0040] 下面将结合本发明实施例，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，以下将描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0041] 实施例1

[0042] 氨基化透明质酸(AHA)的制备：称取透明质酸钠(HA)0.5g，乙二酸二酰肼(ADH)10g，将它们溶于100mL去离子水中，搅拌均匀，得到溶液C。称取1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸(EDC)0.8g，1‑羟基苯并三唑水合物(HOBt)0.7g，将它们溶于二甲亚砜/水(v/v＝1:1，各5mL)混合液中，得到溶液D。将溶液D滴加至溶液C中，用稀盐酸调节pH至5.0，室温反应1天。反应结束，称取5g NaCl加入到反应液中，用乙醇沉淀AHA，取沉淀并用水清洗三遍，然后透析三天以除去盐，冻干，得到AHA。

[0043] 实施例2

[0044] 光板机分子修饰的透明质酸(HA‑NB)的制备：在室温下，将0.5g HAMA溶解在50mL纯水中，加入0.25g EDC活化HAMA上的羧基，磁力搅拌30min后，加入0.5g NHS，继续搅拌30min，然后将0.2g 4,4‑(4‑(羟甲基)‑2‑甲氧基‑5‑硝基苯氧基)丁酰乙二胺(NB)加入到上述溶液中，常温反应8h后，反应后的溶液用3500Da透析膜进行透析纯化3天，经‑80℃冷冻，放于冻干机中冻干，得到HA‑NB。

[0045] 实施例3

[0046] 介孔有机硅纳米粒子(MONs)的制备：将2g十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)和0.1g三乙胺(TEA)溶解在20mL水中，在剧烈搅拌下保持0.5小时，然后转移到80℃油浴锅中。将1mL正硅酸乙酯(TEOS)滴加到上述系统中反应1h，然后加入二氧化硅前体混合物(双‑[3‑(三乙氧基硅)丙基]‑二硫化物(BTES)/TEOS＝1:1)再反应3h。之后，通过离心获得MSN@MON颗粒，并用乙醇洗涤3次。通过将MSN@MON分散在30mL的NaCl甲醇(1wt.％)中搅拌3h来提取CTAC模板。提取过程至少重复3次以保证完全去除CTAC。其次，MSN@MON被制成空心结构并通过特定的“氨辅助热水蚀刻”策略构建MONs，具体为：将MSN@MON分散在30mL水中，然后转移到95℃油基中。添加氨水后，上述体系反应3h以蚀刻掉内部的MSN核心，离心，水洗3次，得到MONs。

[0047] 实施例4

[0048] 载药介孔有机硅纳米粒子的制备：将0.5mL含小檗碱(Ber，0.5mg/mL)和柚皮苷(Nar，0.5mg/mL)的水溶液加入0.5mL实施例3制备的MONs的分散体(5mg/mL，分散溶剂为水)中，混合，得到混合物。将混合物的总体积调至1.0mL。涡旋30秒后，将混合物在室温下保持过夜，得到D@HMON，20000rpm离心20min，用纯水洗涤5次，所得固体产物即为载药MONs。收集上清液，紫外分光光度计上测量上清液中未负载的药物，并根据标准药物溶液构建的标准曲线计算。然后按公式计算MONs中的载药量和包封率：

[0049] 包封率(％)＝(载药时药物的投药量‑上清液中药物的含量)/载药时药物的投药量×100％

[0050] 载药量(％)＝载体中药物的质量/载体的总质量×100％

[0051] 经计算，本实施例所制备的载药介孔有机硅纳米粒子中，小檗碱的载药率和包封率分别为8.26％和90.09％，柚皮苷的载药率和包封率分别为7.20％和77.58％。

[0052] 实施例5

[0053] 粘附型水凝胶的制备：

[0054] 1、将0.01g LAP溶于10mL无菌PBS中，避光超声溶解，得到浓度为0.1％的LAP溶液；

[0055] 2、取5mL LAP溶液于50mL无菌离心管中，加入0.3g实施例2制备的HA‑NB，放入60℃烘箱中约4h，至HA‑NB完全溶解，得到溶液A；

[0056] 3、取5mL LAP溶液于50mL无菌离心管中，加入0.1g实施例1制备的AHA和15mg实施例4制备的载药MONs，放入60℃烘箱中约4h，至AHA和载药MONs完全溶解，得到溶液B；

[0057] 4、将溶液A和溶液B按体积比1:1混合，然后倒入48孔板中，用紫光灯照射1min，得到光固化的HA‑NB/AHA/MONs水凝胶，即为所述粘附型水凝胶。

[0058] 实施例6

[0059] 粘附型水凝胶的制备：其与实施例5的区别仅在于使用的载药介孔有机硅纳米粒子不同，实施例6的载药介孔有机硅纳米粒子中只负载有小檗碱，其它相同。

[0060] 只负载小檗碱的载药介孔有机硅纳米粒子的制备：将0.5mL含小檗碱(Ber，1mg/mL)的水溶液加入0.5mL实施例3制备的MONs的分散体(5mg/mL)中，混合，得到混合物。将混合物的总体积调至1.0mL。涡旋30秒后，将混合物在室温下保持过夜，得到D@HMON，20000rpm离心20min，用纯水洗涤5次，所得固体产物即为目标产物。

[0061] 实施例7

[0062] 粘附型水凝胶的制备：其与实施例5的区别仅在于使用的载药介孔有机硅纳米粒子不同，实施例7的载药介孔有机硅纳米粒子中只负载有柚皮苷，其它相同。

[0063] 只负载柚皮苷的载药介孔有机硅纳米粒子的制备：将0.5mL含柚皮苷(Nar，1mg/mL)的水溶液加入0.5mL实施例3制备的MONs的分散体(5mg/mL)中，混合，得到混合物。将混合物的总体积调至1.0mL。涡旋30秒后，将混合物在室温下保持过夜，得到D@HMON，20000rpm离心20min，用纯水洗涤5次，所得固体产物即为目标产物。

[0064] 对比例1

[0065] 水凝胶的制备：

[0066] 1、将0.01g LAP溶于10mL无菌PBS中，避光超声溶解，得到浓度为0.1％的LAP溶液；

[0067] 2、取5mL LAP溶液于50mL无菌离心管中，加入0.3g实施例2制备的HA‑NB，放入60℃烘箱中约4h，至HA‑NB完全溶解，得到溶液A；

[0068] 3、取5mL LAP溶液于50mL无菌离心管中，加入0.1g实施例1制备的AHA，放入60℃烘箱中约4h，至AHA完全溶解，得到溶液B；

[0069] 4、将溶液A和溶液B按体积比1:1混合，然后倒入48孔板中，用紫光灯照射1min，得到光固化的HA‑NB/AHA水凝胶。

[0070] 对比例2

[0071] 水凝胶的制备：

[0072] 1、将0.01g LAP溶于10mL无菌PBS中，避光超声溶解，得到浓度为0.1％的LAP溶液；

[0073] 2、取5mL LAP溶液于50mL无菌离心管中，加入0.3g实施例2制备的HA‑NB，放入60℃烘箱中约4h，至HA‑NB完全溶解，得到溶液A；

[0074] 3、取5mL LAP溶液于50mL无菌离心管中，加入0.075g实施例1制备的AHA，放入60℃烘箱中至AHA完全溶解，得到溶液B；

[0075] 4、将溶液A和溶液B按体积比1:1混合，然后倒入48孔板中，用紫光灯照射1min，得到光固化的HA‑NB/AHA水凝胶。

[0076] 对比例3

[0077] 水凝胶的制备：

[0078] 1、将0.01g LAP溶于10mL无菌PBS中，避光超声溶解，得到浓度为0.1％的LAP溶液；

[0079] 2、取5mL LAP溶液于50mL无菌离心管中，加入0.3g实施例2制备的HA‑NB，放入60℃烘箱中约4h，至HA‑NB完全溶解，得到溶液A；

[0080] 3、取5mL LAP溶液于50mL无菌离心管中，加入0.125g实施例1制备的AHA，放入60℃烘箱中至AHA完全溶解，得到溶液B；

[0081] 4、将溶液A和溶液B按体积比1:1混合，然后倒入48孔板中，用紫光灯照射1min，得到光固化的HA‑NB/AHA水凝胶。

[0082] 试验例

[0083] 一、透射电子电镜(TEM)检测。

[0084] 用透射电子显微镜对样品的微观形貌进行表征。将实施例3制备的MONs纳米粒子分散于水中，得到1mg/mL的MONs纳米粒子溶液。将10μL MONs纳米粒子溶液置于铜网上。铜网风干后，样品即可测试。

[0085] 测试结果如图1所示。从图1可看出，介孔有机硅纳米粒子(MONs)呈球形，粒径大约50nm左右。介孔有机硅纳米粒子(MONs)采用特定的“氨辅助热水蚀刻”策略来蚀刻MSN@MON的内部MSN核心以产生MONs。由于MON壳内的Si‑C键的键能高于MSN核内的Si‑O键，氨可以优先蚀刻掉MSN内核，留下带有空腔的外MON壳(即MONs)。这种带有内腔的空心结构为药物包封提供了更大的空间，是一种有良好前景的药物载体。

[0086] 二、核磁测试

[0087] 以氘代重水为溶剂，利用质子核磁共振在25℃下记录HA、实施例1制备的AHA和实1
施例2制备的HA‑NB的 H NMR，采用MestReNova软件进行图谱分析。

[0088] 结果如图2所示。根据图2显示的1H NMR光谱，AHA显示出对应于ADH质子的新峰(1.5ppm和2.1pm)，表明成功合成了AHA。光响应NB通过酰胺键与HA主链相连，形成光生醛组分HA‑NB。从图可以看出HA‑NB显示出对应NB苯环上的氢的新峰(7.2ppm和7.7ppm)，表明成功合成了HA‑NB。

[0089] 三、溶胀性能测试

[0090] 取400μL水凝胶，称取初始重量设置为W0，然后加入PBS，浸泡在PBS溶液中。在指定的时间点，取出水凝胶进行称重命名为Wt，直到水凝胶达到溶胀平衡。采用下列公式计算水凝胶的溶胀率：

[0091] 溶胀率(％)＝(Wt‑W0)/W0×100

[0092] 结果如图3所示。从图3可看出，24h后对比例2、对比例1和对比例3制备的水凝胶溶胀率分别为99.81±6.31％、64.26±4.72％和10.84±42.41％。可以看出随着AHA浓度的增加，溶胀率呈现下降趋势。这是因为HA‑NB在紫外光照射后NB结构产生了醛基，醛基与AHA上的氨基通过耦合产生二次联，使得水凝胶网络交联度增加，导致水凝胶溶胀度降低。

[0093] 四、生物相容性

[0094] 使用3T3进行CCK‑8实验。检测24h不同组水凝胶浸提液对BMSCs细胞存活和增殖的影响，将不同浓度的水凝胶浸泡在DMEM完全培养基中制备水凝胶浸提液。将3T3接种到96孔板中，密度为每子3000个细胞，培养24h后将培养基更换为水凝胶浸提液，对照组替换为新鲜的DMEM完全培养基继续培养。将BMSCs用不同的水凝胶浸提液处理24h后，避光条件下配制CCK‑8工作液，弃去原有培养液，每孔加入配制好的CCK‑8工作液110uL，空白组只加CCK‑8工作液，在5％的CO2、37℃细胞培养箱中孵育2h，使用酶标仪检测450nm处的吸光值，计算细胞存活率并绘图。根据公式：

[0095]

[0096] 其中，ODcontorll表示空白组中细胞培养液吸光度，ODTreated表示实验组中细胞培养液的吸光度。

[0097] 采用CCK‑8实验以研究水凝胶的细胞相容性，并使用未经处理的BMSCs细胞作为对照组。CCK‑8结果如图4所示，结果表明，对比例1和实施例5的水凝胶组的存活率均高于95％，证实了水凝胶的生物安全性。

[0098] 五、抗菌评价

[0099] 用革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(S.aureus)和革兰氏阴性大肠杆菌(E.coli)评价6
水凝胶材料的抗菌性。400μL的水凝胶材料与1mL的细菌悬浮液(1×10CFU/mL)共同培养，在37℃下培养4h。将稀释后的菌悬液(100μL)接种到LB琼脂平板上，在37℃下培养24h，计算菌落数，并按公式计算细菌存活率。

[0100] 细菌存活率(％)＝Nsample/Ncontrol×100

[0101] 其中Ncontrol是对照样品中的平均菌落数，Nsample是水凝胶材料处理样品中的平均细菌菌落。

[0102] 表1细菌存活率

[0103]

[0104] 作为局部缓释给药系统的一项重要特性，该水凝胶的体外抗菌活性首先针对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)、大肠杆菌(革兰氏阴性菌)进行了检测。如表1所示，由于小檗碱和柚皮苷的抗菌作用，实施例5制备的水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有优异的杀菌性能。比较实施例5‑7还可看出，同时负载小檗碱和柚皮苷的实施例5具有明显更优异的杀菌性能，说明小檗碱和柚皮苷在杀菌方面具有协同增效作用。

[0105] 六、ALP活性评价

[0106] 将BMSCs与水凝胶浸提液共同培养在6孔板中。每孔5×104个细胞。在第3、5、7天，ALP活性检测来研究ALP的表达。6孔板中的细胞在4℃下用1mL 0.5％Triton X‑100裂解20min。4℃，用1mL 0.5％Triton X‑100裂解，并转移到1.5mL EP管。使用ALP检测试剂盒来分析ALP活性。

[0107] 结果如图碱性磷酸酶(ALP)是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。通过ALP活性表达评价水凝胶浸提液培养的BMSCs的成骨分化。如图5所示，孵育7天后，实施例5培养基组表现出最高的ALP活性。证明实施例5制备的水凝胶具有成骨分化潜能。

[0108] 以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。