太空育种米根霉及其在制备麸曲及酿酒中的应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及太空育种米根霉及其在制备麸曲及酿酒中的应用。该米根霉的保藏编号为CGMCC No.40234。利用本发明的菌株制作的麸曲糖化力高，利用该麸曲酿造的白酒，乙酸异戊酯含量显著提高，具有愉悦的果香，酒体的滋气味、风味及质感优良，可提升白酒的出酒率和优品率，对提高白酒企业经济效益具有重要的意义，该菌株具有良好的应用前景。

权利要求

1.一株米根霉Rhizopusoryzae，其特征在于，该米根霉的保藏编号为CGMCC No.40234。

2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包含权利要求1所述的米根霉。

3.一种麸曲的制备方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1所述的米根霉接种到麸曲培养基中进行培养；

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其中，所述米根霉以孢子悬浮液的形式进行接种，接种量为10 ‑10 个孢子/g麸曲培养基；

其中，所述麸曲培养基包含麸皮和水，所述麸曲培养基中，麸皮的含量为50‑70重量%；

其中，所述培养的条件包括：温度为28‑30℃，时间为40‑90 h。

4.根据权利要求3所述的方法制得的麸曲。

5.权利要求1所述的米根霉、权利要求2所述的菌剂或者权利要求4所述的麸曲在生产发酵食品中的应用。

6.一种酿酒的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求4所述的麸曲接种到酿酒熟料中进行酿酒；

其中，以酿酒熟料的重量为基准，所述麸曲的接种量为3‑6重量‰。

说明书

太空育种米根霉及其在制备麸曲及酿酒中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物领域，具体涉及一株米根霉、一种菌剂、一种麸曲及其制备方法，米根霉、菌剂和麸曲在生产发酵食品中的应用，一种酒及其制备方法。

背景技术

[0002] 米根霉是白酒酿造过程中的重要菌种，具有产脂肪酶、淀粉酶、糖化酶和果胶酶等的特性，许多酒曲都有发现米根霉。米根霉具有较强的淀粉酶产生能力，广泛用于制曲、酿酒生产中。在酒曲的发酵过程中，米根霉可以产生乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸异戊酯、丙醇、异戊醇、乙醛等芳香性风味物质。米根霉细胞中还含有少量产生乳酸等有机酸的酶系，从而可使米根霉发酵出的酒具有独特风味。米根霉可以用来制作纯种根霉曲，纯种根霉曲具有糖化力高，制作周期短，生产成本低等优势，现已有部分使用小曲的酒厂在使用纯种根霉曲进行白酒的生产。

[0003] 太空环境中的微重力效应、极端温差、高真空、高能粒子辐射和弱磁场等可以对空间微生物产生诱变作用，显著提高基因突变频率，从而改变微生物的生物学性状（包括菌落特征、生理生化特性、个体形态等）和发酵生产性能（包括酶活力、产香能力等）。目前国内外对空间育种微生物的研究集中在空间病原菌、微生物制药等方面，而国内尚未有对空间育种米根霉制作麸曲、酿造白酒方面的相关报道。利用空间育种筛选获得糖化力高、产香性能优良的米根霉，对于提升白酒的出酒率和优品率、提高白酒企业经济效益具有重要的意义。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一株糖化力高、产香性能优良的米根霉，利用该米根霉制备的麸曲用于白酒酿造时具有糖化力高、乙酸异戊酯含量高，且白酒风味和质感优良的优点，可提升白酒的出酒率和优品率。

[0005] 为了实现上述目的，本发明第一方面提供一株米根霉Rhizopus oryzae，该米根霉的保藏编号为CGMCC No.40234。

[0006] 本发明第二方面提供一种菌剂，所述菌剂包含如上所述的米根霉。

[0007] 本发明第三方面提供一种麸曲的制备方法，该方法包括：将如上所述的米根霉接种到麸曲培养基中进行培养。

[0008] 本发明第四方面提供如上所述的方法制得的麸曲。

[0009] 本发明第五方面提供如上所述的米根霉、菌剂或麸曲在生产发酵食品中的应用。

[0010] 本发明第六方面提供一种酿酒的方法，该方法包括：将如上所述的麸曲接种到酿酒熟料中进行酿酒。

[0011] 本发明第七方面提供如上所述的酿酒的方法酿制的酒。

[0012] 本发明中通过太空诱变获得一株糖化力高、高产果香的米根霉HTJG5‑5，编号为BC70162。利用本发明的HTJG5‑5菌株制作的麸曲糖化力高，利用该麸曲酿造的白酒，乙酸异戊酯含量显著提高，具有愉悦的果香，酒体的滋气味、风味及质感优良，可提升白酒的出酒率和优品率，对提高白酒企业经济效益具有重要的意义，该菌株具有良好的应用前景。

[0013] 生物保藏

[0014] 本发明提供的米根霉的分类命名为米根霉Rhizopus oryzae，于2022年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（缩写为CGMCC），其保藏编号为CGMCC No. 40234，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

[0015] 图1是本发明所述的米根霉的外观形态图；

[0016] 图2是本发明所述的米根霉的显微镜图；

[0017] 图3是不同米根霉麸曲酿酒发酵实验感官评价的雷达图。

具体实施方式

[0018] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

[0019] 本发明第一方面提供一株米根霉Rhizopus oryzae，该米根霉的保藏编号为CGMCC No.40234。

[0020] 根据本发明，对初始菌株米根霉JG5进行太空诱变菌种，然后诱变后经分离纯化和筛选获得了本发明的米根霉。诱变后的菌株按照本领域常规的方式进行。

[0021] 根据本发明的优选实施方式，为了确保分离纯化效果，纯化培养可以根据实际情况进行多次重复。

[0022] 其中，所述分离和纯化可以在本领域常规使用的固体培养基中进行，优选地，所述固体培养基为PDA固体培养基。在所述分离和纯化过程中，挑选具有典型霉菌菌落特征的单菌落。

[0023] 在本发明中，筛选也可以分为多轮筛选，比如可以通过初筛筛选出糖化性能优良菌株，然后进行糖化力复筛。

[0024] 初筛的方式可以是本领域常规的方式，优选地，将分离获得的霉菌菌株采用点种法接种于糖化酶活筛选培养基平板上，用透明圈法进行高产糖化酶活性霉菌的初筛。其中，通过比较透明圈的大小来进行初筛，透明圈大的菌株为糖化酶活性高的菌株。

[0025] 在本发明的一种优选的实施方式中，采用点接法，用无菌接种针将霉菌菌株依次点接于糖化酶活筛选培养基上，在25‑35℃下正置培养48‑84h，然后向培养皿中加入碘液，2‑8min后，测量透明圈直径，透明圈大的菌株为糖化酶活性高的菌株。

[0026] 其中，糖化酶活筛选培养基可以为PDA培养基。

[0027] 复筛的方式可以是本领域常规的方式，比如可以包括麸曲的制备和糖化力测定以及可选的感官测定。

[0028] 其中，所述麸曲的制备方法优选包括将米根霉接种到麸曲培养基中进行培养。

[0029] 所述麸曲培养基可以为本领域常规的麸曲培养基，优选地，所述麸曲培养基包含麸皮和水。

[0030] 优选地，所述麸曲培养基中，麸皮的含量为50‑70重量%。

[0031] 所述麸曲培养基的制备方法可以为本领域常规的方法，比如，所述麸曲培养基的制备包括：称取30‑50g麸皮，装入500 mL三角瓶中，厚度约为2‑4 cm，加水使得麸曲培养基中麸皮的含量为50‑70重量%（优选为55‑65重量%）。高温高压灭菌处理。灭菌完成后，趁热轻轻摇动，打散结块，瓶壁冷凝水及麸皮均落入培养基内，待冷却至30‑35℃后备用。

[0032] 所述米根霉的接种方式可以为本领域常规的接种方式，比如可以以孢子悬浮液的形式接种，或者从米根霉斜面上挑取一环菌种进行接种。

[0033] 优选地，所述米根霉以孢子悬浮液的形式进行接种，接种量为106‑108个孢子/g麸曲培养基。

[0034] 根据本发明的优选实施方式，所述培养的条件包括：温度范围为25‑35℃，时间为40‑90 h。更优选地，所述培养的条件包括：温度为28‑32℃，时间为48‑72 h。

[0035] 培养结束后，可以将产物在干燥箱中35‑45℃条件下烘干，控制麸曲中的水分含量为8‑12重量%。

[0036] 本发明所述的米根霉HTJG5‑5制备得到的麸曲感官评价结果包括：麸曲结块紧实富有弹性，无烧心和干皮，没有黑色孢子，无异杂味。

[0037] 根据检测结果，选取得到糖化酶活力高的米根霉菌株。

[0038] 根据本发明，糖化力是指对麸曲进行糖化力评价，参考QB/T4257‑2011；糖化能力是检测菌株对淀粉质原料的糖化能力，通过还原糖含量的大小进行表征。

[0039] 其中，PDA培养基可以通过商购获得，本领域技术人员可以按照本领域常规的制备方法制备固体培养基。

[0040] 本发明第二方面提供一种菌剂，所述菌剂包含如上所述的米根霉。

[0041] 所述菌剂的形态可以为本领域常见的菌剂形态，比如固体或液体菌剂。优选地，所述菌剂以小曲、麸曲、麦曲、菌丝体和孢子悬液中的至少一种的形式存在。

[0042] 小曲、麸曲和麦曲的制备方法可以参见本领域常规的制备方法进行制备，在此不再赘述。其中，麦曲包括生麦曲和熟麦曲。

[0043] 所述菌丝体和孢子悬液的制备方法可以为本领域常规的制备方法，在此不再赘述。

[0044] 本发明第三方面提供一种麸曲的制备方法，该方法包括：将如上所述的米根霉接种到麸曲培养基中进行培养。

[0045] 其中，所述麸曲的制备方法可以参见第一方面所述的内容，在此不再赘述。

[0046] 本发明第四方面提供如上所述的方法制得的麸曲。

[0047] 本发明第五方面提供如上所述的米根霉、菌剂或麸曲在生产发酵食品中的应用。

[0048] 所述发酵食品可以是任意能够用米根霉发酵制得的发酵食品，所述发酵食品包括但不限于酒（包括白酒、黄酒、米酒等）、醋、酱油、腐乳、醪糟、豆豉等发酵食品。

[0049] 本领域技术人员可以根据本领域常规的方法生产发酵食品，在此不再赘述。

[0050] 本发明第六方面提供一种酿酒的方法，该方法包括：将如上所述的麸曲接种到酿酒熟料中进行酿酒。

[0051] 其中，麸曲的制备方法可以参见如上所述的内容，在此不再赘述。

[0052] 根据本发明，所述酿酒熟料的制备方法优选包括：将淀粉质原料浸泡后蒸煮，得到酿酒熟料。

[0053] 所述淀粉质原料可以为本领域常用的淀粉质原料，包括但不限于高粱、大米、糯米、玉米、小麦等，优选地，所述淀粉质原料选自高粱、大米、糯米、玉米和小麦中的至少一种。

[0054] 所述淀粉质原料中各组分的含量可以在较宽的范围内选择。

[0055] 根据本发明的优选实施方式，所述淀粉质原料包含高粱、大米、糯米和玉米，其中，所述淀粉质原料中，高粱的含量为60‑80重量%，大米的含量为5‑20重量%，糯米的含量为10‑20重量%，玉米的含量为1‑10重量%。

[0056] 可以选择上述淀粉质原料的一种或多种制备酿酒熟料，当选择多种淀粉质原料时，可以根据种类的差别对淀粉质原料进行浸泡和蒸煮，然后将蒸煮好的淀粉质原料混合均匀后，即得到酿酒熟料。

[0057] 其中，浸泡的时间可以在较宽的范围内选择，不同的淀粉质原料其浸泡时间不同，比如，高粱浸泡的时间为12‑36h，糯米、大米、玉米等浸泡的时间为0.2‑3 h。

[0058] 其中，根据淀粉质原料的种类不同，蒸煮的时间不同。比如，高粱蒸煮的时间为4‑5 h，糯米、大米、玉米等蒸煮的时间为1‑2 h。

[0059] 优选地，以酿酒熟料的重量为基准，所述麸曲的接种量为3‑6重量‰。

[0060] 所述酿酒的温度可以根据酒的种类不同而有所差别，比如，当酿制的酒为白酒时，所述酿酒的温度可以为25‑35℃。

[0061] 所述酿酒的时间可以在较宽的范围内选择，本领域技术人员可以根据需要选择合适的酿酒时间，比如，当酿制的酒为白酒时，所述酿酒时间优选为24‑72h。

[0062] 本发明第七方面提供如上所述的酿酒的方法酿制的酒。

[0063] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

[0064] 以下实施例中，若无特别说明，使用的原料和试剂均通过商购获得。

[0065] 下述实施例中马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）如下：

[0066] 马铃薯浸出粉12.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，琼脂14.0 g/L，pH值5.6±0.2（25℃）；115℃高压灭菌15 min。

[0067] 按照QB/T4257‑2011标准进行感官评价和糖化力测定。

[0068] 参照GB 12313‑1990标准进行酿酒感官评价。

[0069] 实施例1

[0070] 本实施例用于说明太空诱变米根霉中糖化性能优良菌株的筛选。

[0071] （1）菌株诱变和分离纯化

[0072] 将由出发菌株米根霉JG5经长征五号B运载火箭首飞发射新一代载人飞船试验船搭载返回的太空诱变菌种标记为太空诱变米根霉HTJG5。

[0073] 将冻存于‑80℃的太空诱变米根霉HTJG5甘油保菌管置于4℃缓冻，于无菌工作台内以体积百分比2.0％接种量接种到PDA培养基中，28℃培养48 h，随机选取具有典型霉菌菌落特征的单菌落，划线分离纯化3次，获得单个纯种菌落，并在光学显微镜观察分离纯化的菌株的菌丝、气生菌丝和孢子丝的形态，PDA保存备用。

[0074] 如图1所示，于PDA培养基上28℃培养长出的太空诱变米根霉HTJG5，菌落为绒毛状、最初呈白色，后变为灰褐色，干燥，大而疏松，不透明，菌丝相互缠绕，易挑起，铺满整个平板。如图2所示，米根霉HTJG5的形态在显微镜（400倍）下呈现匍匐爬行，假根发达，分枝呈现根状，呈褐色。孢囊梗直立或稍有弯曲，孢囊孢子成椭圆形或球状，大小不一致。

[0075] （2）糖化性能优良菌株的初步筛选

[0076] 采用点接法，用无菌接种针将霉菌菌株依次点接于PDA培养基上（三个平行），在28℃下正置培养72小时，然后向培养皿中加入4mL稀碘液，5min后，测量透明圈直径，透明圈大的菌株为糖化酶活性高的菌株，从中筛选出10株糖化性能优良的太空诱变米根霉HTJG5菌株，标记为HTJG5‑1至HTJG5‑10（表1），斜面保存备用。

[0077] 表1

[0078]

[0079] （3）糖化力复筛

[0080] 配制麸皮培养基：称取45g麸皮，装入500mL三角瓶中，加入蒸馏水30g，121℃高压灭菌30 min，待冷却至30±2℃后，打散备用。使用接种环分别从10株备选菌株斜面挑取一环，接种于麸皮培养基，混匀。30℃条件下培养3天，无菌条件下装入无菌牛皮纸袋中，于干燥箱内40℃烘干24 h，水分含量控制在10%左右。对得到的麸曲进行感官评价，并根据以下标准进行筛选：麸曲结块紧实富有弹性，无烧心和干皮，没有黑色孢子，无异杂味。对得到麸曲进行糖化力测定，并根据结果选取得到糖化酶活力高的太空诱变米根霉菌株HTJG5‑5（表2）。

[0081] 表2

[0082]

[0083] 实施例2

[0084] 本实施例用于说明太空诱变米根霉HTJG5‑5发酵能力评价。

[0085] 称取适量糯米，淘洗两次后用漏盆将水滤干。在无菌铝盒中加入淘洗好的生米和蒸馏水，生米与蒸馏水重量比为1:1.5，确保米要分摊均匀，蒸煮60 min。蒸煮后损失的重量使用冷开水补足。称取蒸好的米饭40g置于无菌铝盒中。待米饭温度下降到30‑35℃时，将步骤（2）中制得的不同培养时间的麸曲分别均匀撒在米饭上并拌匀，麸曲的添加量为米饭的0.5重量%。将米饭拨至饭盒的一边，均匀压成斜面，盖上盖子后放入30℃恒温培养箱，培养
24 h后取出。

[0086] 观察发酵产物的外观，并对发酵产物的混合物（发酵后的糯米和汁液的混合物）进行糖分检测和感官评价，结果见表3。

[0087] 表3

[0088]

[0089] 实施例3

[0090] 本实施例用于说明太空诱变米根霉HTJG5‑5制备麸曲进行白酒酿造的方法。

[0091] （1）淀粉质原料选择：所述淀粉质原料中含有70%重量的高粱、10重量%的大米、15重量%的糯米和5重量%的玉米。

[0092] （2）原料预处理：将高粱浸泡24h后，蒸煮5h；将糯米、大米、玉米混合浸泡后2h蒸煮2 h；将蒸煮完毕的各物料混合均匀即为酿酒熟料。

[0093] （3）接种麸曲和酿酒：将酿酒熟料平均分成4份，分别接种由实施例2中得到培养3天的太空诱变米根霉HTJG5‑5麸曲、JG5麸曲和商业麸曲（购自贵州立高轻工科技发展有限公司的笑仙甜酒曲），接种量为酿酒熟料的5重量‰。

[0094] 在温度为30℃的条件下发酵，时间为48 h。

[0095] 对麸曲的糖化力进行测定，结果见表4。

[0096] 表4

[0097]

[0098] （4）风味物质检测分析：对发酵结束后的酿酒料进行风味物质检测分析，结果见表5。通过比较可以看出，太空诱变米根霉HTJG5‑5的乙酸异戊酯产量较高。

[0099] 表5

[0100]

[0101] （5）感官评价：对发酵过程和发酵结束后的酿酒料，进行感官评价，结果见表6。

[0102] 表6

[0103]

[0104] 并具体针对果香、青香、花香等风味维度，根据强度大小进行感官评价（参见GB/T 12313‑1990），结果见图3，从图3可以看出，与出发菌株和商业米根霉相比，本发明所述的太空诱变米根霉HTJG5‑5果香突出，将其编号为BC70162菌株，并于2022年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（缩写为CGMCC），其保藏编号为CGMCC No. 
40234，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

[0105] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。