一种“南林895杨”外源基因高效瞬时转化体系的建立方法

摘要

本发明公开了一种“南林895杨”外源基因高效瞬时转化体系的建立方法，属于生物技术领域。本发明针对“南林895”组培苗叶片特性建立了最适配比的酶解溶液和最佳酶解时间，以及通过对叶片进行暗培养、调整孵化温度时间、转化温度、转化使用的混匀仪器等条件，获得了大量原生质体和提高了转化效率，大大缩短了工作时间，并且重复性极好。本发明提供的“南林895”外源基因瞬时转化体系的建立方法，为原生质体瞬时转化及基因表达特性的研究提供了一种有效途径，为研究亚细胞定位、蛋白质‑蛋白质相互作用、染色质免疫沉淀、蛋白质印迹、单细胞测序和基因组编辑等领域技术提供前提，也为其它非模式植物外源基因瞬时转化体系的建立提供参考。

权利要求

1.一种“南林895杨”外源基因高效瞬时转化体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)原生质体制备：将“南林895杨”组培苗叶片切丝后置入酶解液中进行酶解，获得酶解混合液；所得酶解混合液进行过滤和纯化，使用缓冲液重悬获得原生质体悬液；

所述的原生质体制备具体步骤包括：

1)取生长2个月健康幼嫩的“南林895杨”组培苗从上往下数第3‑4片叶，尽量选择平展叶片，在无菌超净台中切掉叶边缘，平铺在叶分化培养基暗培养2d；

2)将叶片放置在水平载玻片上，吸干叶片表面水分，另一个载玻片压平卷缩叶片，接着倾斜45°压在叶片上，去除主脉，使用无菌且锋利的手术刀沿着倾斜的载玻片将叶片切成

0.2mm细丝；

3)迅速将切好的叶片浸泡在酶解液中，锡箔纸包好放置于50rpm/min摇床上，室温酶解

6h，加入10mL溶液B，轻柔混匀；

4)用70μm细胞筛网过滤上述溶液于50mL EP管中，轻放离心机中，500rpm转速离心

2min，使用特殊枪头缓慢吸去上清；

5)轻缓加4mL溶液B重悬原生质体，冰浴静置30min，使用特殊枪头缓慢吸去上清；

6)1mL溶液C再次重悬原生质体，得到原生质体悬液；

7)将获得的原生质体悬液吸取10μL于血球计数板上，加入等体积台盼蓝染色2min后，通过光学显微镜下统计细胞数量和活性，检验原生质体的质量；

(2)原生质体转化：将“南林895杨”原生质体悬液与质粒液混匀后孵育，孵育结束后进行暗培养，获得转化后的“南林895杨”原生质体；

所述的原生质体转化具体步骤包括：

1)取10μL质粒于2mLEP管中，加100μL原生质体，手动旋转EP管混匀；

2)加入等体积110μL溶液D，于血液混合器上旋转混匀，42℃孵育15min；

3)加入440μL溶液B，于血液混合器上旋转混匀，轻放离心机中，500rpm转速离心2min，吸去上清；

4)加入500μL溶液B重悬原生质体，500rpm转速离心1min，再次吸去上清；

5)1mL溶液E重悬沉淀，于血液混合器上旋转混匀，得到转化液，将转化液置于30℃水浴锅暗培养3‑22h，500rpm转速离心2min，吸去上清；

6)吸取10μL转化液于载玻片上，通过激光共聚焦显微镜下观察转染情况；

所述酶解液的配制方法为：依次加入5mL溶液A，80mg离析酶R‑10，300mg纤维素酶R‑10于10mL的EP管中，在55℃水浴锅中加热10min，中间颠倒混匀4‑5次，待冷却了后，再依次加入5μL β‑巯基乙醇和200μL 50mg/mL BSA溶液，定容到10mL混匀得到酶解液；

所述溶液A的配制方法为：246mg/L MgSO4·7H2O、0.16mg/L KI、0.025mg/L CuSO4·

5H2O、27.2mg/LKH2PO4、101mg/L KNO3、1480mg/L CaCl2·2H2O，高温灭菌，‑20℃保存；

所述溶液B由9g/L NaCl、18.4g/L CaCl2、0.9g/L C6H12O6、0.37g/L KCl和0.3g/L MES组成；

所述溶液C由0.71g/L MgCl2、0.5g/L MES和36.5g/L C6H14O6组成；

所述特殊枪头包括将普通8mm蓝枪头尖头剪掉4mm的宽口大枪头和宽口大枪头套黄枪头；

所述溶液D由40% PEG4000、36.4344g/L C6H14O6和11.1g/L CaCl2组成；

所述溶液E由0.78096g/L MES、72.8688g/L C6H14O6和1.481g/L KCl组成。

2.根据权利要求1所述的“南林895杨”外源基因高效瞬时转化体系的建立方法，其特征在于，叶分化培养基为MS+30g/L蔗糖+0.5mg/L6‑BA+0.002mg/LTDZ。

3.根据权利要求1所述的“南林895杨”外源基因高效瞬时转化体系的建立方法，其特征6

在于，所述原生质体悬液的原生质体密度为8‑10×10个/g/FW，质粒浓度为2000‑3000ng/μL。

4.根据权利要求1所述的“南林895杨”外源基因高效瞬时转化体系的建立方法，其特征在于，所述质粒具体为pK7FWG‑RR‑GFP。

说明书

一种“南林895杨”外源基因高效瞬时转化体系的建立方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，更具体地说，涉及一种“南林895杨”外源基因高效瞬时转化体系的建立方法。

背景技术

[0002] 世界上人工栽培的杨属品种有90％以上都源于黑杨派，有着重要的经济地位，遗传价值极高。特别是经过美洲黑杨(Populus deltoides)与欧美杨(P.euramericana)杂交，从子代群体中选育出来的“南林895杨”(P.deltoides×P.euramericana cv.′NL895′)，被收入国家林业局首批林木良种名录，适于在黄淮、江淮及长江中下游平原地区推广种植，并广泛应用于速生丰产用材林建设，单板用材造林、纤维板用材及纸浆用材造林等。

[0003] 杨树基因组杂合度高，不同杨树品种的全基因组测序相继完成，分子生物学、遗传学、基因组学、细胞学等领域技术也已广泛应用于杨树中，到目前为止，在杨树基因组中已经鉴定并克隆出多个基因，涉及到木材形成、性别决定、叶片衰老等。农杆菌介导转化杨树，虽然一定程度上促进了杨树遗传转化和基因功能研究的发展，但是仍存在操作复杂、转化效率低、获得转基因苗周期长，多为嵌合体等问题，当前多通过原生质体的方式瞬时转化来实现杨树功能特征的探究，但该技术尚不稳定，对于初学者来说难度很大，不易完成，因此亟需建立一个简单快速高效的方式解决杨树原生质体瞬时转化的瓶颈。

[0004] 植物原生质体是一种不含细胞壁的细胞，虽然在草本植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中提取和转化叶肉原生质体瞬时表达技术已经非常成熟完善并被广泛应用，但在不同杨树品种中瞬时转化体系不完善，也不稳定，仍面临众多挑战，一方面在于草本与木本植物细胞壁成分不同，木本植物细胞壁含有较多的果胶，更难于提取，拟南芥瞬时转化体系并不能适用于杨树；另一方面在于杨树分为五种不同特殊派系，每种派系之间叶片成分含量有差异，叶片厚度也不尽相同，尚未有广泛适用方法；此外，酶解时间、原生质体活力与密度，质粒浓度与纯度、PEG分子量、浓度、处理时间及温度等均会影响转化效率。清杨派毛果杨(P.trichocarpa)、白杨派毛白杨(P.tomentosa)、黑杨派“南林895杨”(P.deltoides×P.euramericana)的叶肉原生质体制备和转染已被报道，这打破了杨树原生质体难以提取的瓶颈，但由于原生质体没有细胞壁不易保存，当前技术的转染过程需要过夜24h甚至48h以上，而原生质体放置时间越长可能致使其破损风险越大；并且在25℃室温转染“南林895杨”原生质体，难获得绿色GFP荧光显示；所用配比试剂较多，成本高、操作繁琐，实验周期相比于拟南芥瞬时转化时间要长很多。

发明内容

[0005] 针对现有技术存在的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题在于提供一种“南林895杨”外源基因高效瞬时转化体系的建立方法，具有操作简单便捷，高效快速，原生质体活力强，对原生质体损伤小，转染效率高，重复性好等优势。

[0006] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

[0007] 一种“南林895杨”外源基因高效瞬时转化体系的建立方法，包括以下步骤：

[0008] (1)原生质体制备：将“南林895杨”组培苗叶片切丝后置入酶解液中进行酶解，获得酶解混合液；所得酶解混合液进行过滤和纯化，使用缓冲液重悬获得原生质体悬液；

[0009] (2)原生质体转化：将所述的“南林895杨”原生质体悬液与质粒混匀后孵育，孵育结束后进行暗培养，获得转化后的“南林895杨”原生质体。

[0010] 进一步地，所述的“南林895杨”外源基因高效瞬时转化体系的建立方法中，“南林895杨”的原生质体制备方法具体包括以下步骤：

[0011] 1)取生长2个月健康幼嫩的“南林895杨”组培苗叶片，尽量选择平展叶片，在无菌超净台中切掉叶边缘，平铺在叶分化培养基(MS+30g/L蔗糖+0.5mg/L 6‑BA+0.002mg/L TDZ)暗培养2d；

[0012] 2)将叶片放置在水平载玻片上，吸干叶片表面水分，另一个载玻片压平卷缩叶片，接着倾斜45°压在叶片上，去除主脉，使用无菌且锋利的手术刀沿着倾斜的载玻片将叶片切成0.2mm细丝；

[0013] 3)迅速将切好的叶片浸泡在酶解液中，锡箔纸包好放置于50rpm/min摇床上，室温酶解6h，加入10mL溶液B，轻柔混匀；

[0014] 4)用70μm细胞筛网过滤上述溶液于50mL EP管中，轻放离心机中，500rpm转速离心2min，使用特殊枪头缓慢吸去上清；

[0015] 5)轻缓加4mL溶液B重悬原生质体，冰浴静置30min，使用特殊枪头缓慢吸去上清；

[0016] 6)1mL溶液C再次重悬原生质体；

[0017] 7)将获得原生质体吸取10μL于血球计数板上，加入等体积台盼蓝染色2min后，通过光学显微镜下统计细胞数量和活性，检验原生质体的质量。

[0018] 步骤1)中，取组培苗从上往下数第3‑4片叶，是提取高质量原生质体的最佳部位。

[0019] 步骤2)中，酶解液的配制方法为：依次加入5mL溶液A，80mg离析酶R‑10，300mg纤维素酶R‑10于10mL的EP管中，在55℃水浴锅中加热10min，中间颠倒混匀4‑5次，待冷却了后，再依次加入5μLβ‑巯基乙醇和200μL 50mg/mL BSA溶液，定容到10mL混匀上述酶解溶液。

[0020] 溶液A的配制方法为：246mg/L MgSO4·7H2O、0.16mg/L KI、0.025mg/L CuSO4·5H2O、27.2mg/L KH2PO4、101mg/L KNO3、1480mg/L CaCl2·2H2O，高温灭菌，‑20℃保存。

[0021] 步骤3)中，室温酶解观察是否叶片褪去绿色，若溶液呈浓绿色，表明原生质体已经分离。

[0022] 步骤3)中，溶液B由9g/L NaCl、18.4g/L CaCl2、0.9g/L C6H12O6、0.37g/L KCl和0.3g/L MES组成。

[0023] 步骤4)中，500rpm转速离心，需要降低离心机的升速和降速，升速过快，可能导致原生质体离到管壁上，降速过快，可能导致管底原生质体悬起。

[0024] 步骤4)中，所述70μm细胞筛网从浸泡在75％酒精中取出，用无菌水冲洗3‑5次，再用溶液B润洗1次，放置于50mL离心管中。

[0025] 步骤4)或5)中，特殊枪头包括宽口大枪头(最大限度体积量400μL)和大枪头套小枪头(最大限度体积量1000μL)，宽口大枪头将普通8mm蓝枪头尖头剪掉4mm，大量吸掉上层的悬浮液，不会因为冲力和压强造成原生质体破碎，将靠近原生质体沉淀处时使用移液枪安上蓝枪头后套黄枪头，达到完全吸尽上清液的目的，保证了原生质体的质量。

[0026] 步骤6)中，溶液C由0.71g/L MgCl2、0.5g/L MES和36.5g/L C6H14O6组成。

[0027] 所述的“南林895杨”外源基因高效瞬时转化体系的建立方法中，所述“南林895杨”原生质体的转化方法具体包括如下步骤：

[0028] 1)取10μL质粒于2mL EP管中，加100μL原生质体，手动旋转EP管混匀；

[0029] 2)加入等体积110μL溶液D，于血液混合器上旋转混匀，42℃孵育15min；

[0030] 3)加入440μL溶液B，于血液混合器上旋转混匀，轻放离心机中，500rpm转速离心2min，吸去上清；

[0031] 4)加入500μL溶液B重悬原生质体，500rpm转速离心1min，再次吸去上清；

[0032] 5)1mL溶液E重悬沉淀，于血液混合器上旋转混匀，将上述转化液置于30℃水浴锅暗培养3h，500rpm转速离心2min，吸去上清；

[0033] 6)吸取10μL转化液于载玻片上，通过激光共聚焦显微镜下观察转染情况。

[0034] 其中，步骤1)中，2mL EP管相比于1.5mL EP垂直于水浴锅中而言，原生质体和质粒接触面积更大，给转化效率带来一定推动作用。

[0035] 步骤2)中，溶液D由40％PEG4000、36.4344g/L C6H14O6和11.1g/L CaCl2组成。

[0036] 步骤2)中，42℃孵育15min是提高转化效率最佳温度和孵育时间。

[0037] 步骤3)中，血液混合器上旋转混匀力度温和、混匀充分，混合后溶液不再有颜色分层现象，并且不会导致原生质体破裂等损伤的产生，能很好地提高转化效率。

[0038] 步骤3)或步骤4)中，溶液B由9g/L NaCl、18.4g/L CaCl2、0.9g/L C6H12O6、0.37g/L KCl和0.3g/L MES组成。

[0039] 步骤5)中，溶液E由0.78096g/L MES、72.8688g/L C6H14O6和1.481g/L KCl组成。

[0040] 步骤5)中，30℃水浴锅暗培养3h已经可以完全看到大量转染原生质体。

[0041] 步骤1)中，所述质粒的构建和抽提方法具体为：通过PCR克隆RR基因，基于Gateway技术，将RR构建至含有绿色荧光蛋白(GFP)的pK7FWG2.0空载体上，获得RR‑GFP表达载体，构建完成的质粒转化至大肠杆菌中，涂于LB平板后获得单克隆菌落，并对单克隆菌落进行测序，测序正确的菌落接种至100mL LB培养基中，过夜培养后抽提质粒。

[0042] 所述Gateway技术是通过两轮反应，即BP反应和LR反应，将“南林895”RR基因先后TM融合到pDONR 221和pK7FWG2，0载体中。

[0043] 所述RR‑GFP表达载体大小为4565bp，小于10kb，目的基因RR的C端含有绿色荧光报告基因GFP，N端由CaMV 35S启动。

[0044] 所述pK7FWG2，0空载体和RR‑GFP表达载体(pK7FWG‑RR‑GFP)为壮观霉素抗性。

[0045] 所述大肠杆菌菌株是DH5α。

[0046] 所述液体LB为由10g/L胰蛋白胨(Tryptone)、5g/L酵母提取物(Yeast extract)和10g/L氯化钠(NaCl)组成，固体LB是在液体LB基础上，加入15g/L的琼脂粉。

[0047] 所述质粒浓度达到1500‑2500ng/μL之间为最佳浓度。

[0048] 相比于现有技术，本发明的有益效果为：

[0049] 1)本发明针对“南林895”组培苗叶片特性建立了最适配比的酶解溶液和最佳酶解时间，通过对叶片进行暗培养、调整孵化温度等条件，获得了大量原生质体和提高了转化效6 6
率，得到的原生质体平均密度为8×10个/mL，平均产量为10×10个/g/FW，活力高达100％，瞬时转化效率高达90％以上；

[0050] 2)本发明通过选取最佳来源和生长部位的“南林895杨”组培苗叶片以及通过暗培养，有效保证了原生质体的提取质量和提高了转化效率；本发明在原生质体提取过程中采用剪掉4mm的大枪头以及大枪头套小枪头缓慢吸去上清，能有效保持活力原生质体损耗、降低原生质体破裂和流失的损耗；本发明在原生质体转化过程中，使用血液混合器混匀原生质体悬液与质粒液，力度温和混合均匀，避免了手动混匀导致原生质体受伤和难以混匀的问题，从而有效提高了转化效率；

[0051] 3)本发明优选的实验方案提高了“南林895”原生质体的提取及转染效率，大大缩短了工作时间，降低了工作强度，并且稳定性极高；

[0052] 4)本发明提供的“南林895”外源基因瞬时转化体系的建立方法，为原生质体瞬时转化及基因表达特性的研究提供了一种有效途径，为研究亚细胞定位、蛋白质‑蛋白质相互作用、染色质免疫沉淀、蛋白质印迹、单细胞测序和基因组编辑等领域技术提供前提，也为其它非模式植物外源基因瞬时转化体系的建立提供参考。

附图说明

[0053] 图1为所构建的pK7FWG‑RR‑GFP图谱；

[0054] 图2为本发明叶片切丝方法展示图；

[0055] 图3为不同生长环境实验材料原生质体酶解效果比较图，注：图A、B、C、D为2个月大的“南林895杨”实生苗生长状态及原生质体酶解情况；图E、F、G为2个月大的“南林895杨”组培苗生长状态及原生质体酶解情况，从原生质体颜色判断，组培苗优于实生苗作为原生质体提取的受体材料；

[0056] 图4为使用大枪头套小枪头以及剪掉4mm的大枪头交替使用的示意图；

[0057] 图5为采用特殊枪头和未采用特殊枪头获得的原生质体质量比较图；

[0058] 图6为采用普通枪头和采用特殊枪头获得的原生质体进行台盼蓝染色后在光学显微镜观察比较图(CK是普通枪头)；

[0059] 图7本发明使用的血液混合器图；

[0060] 图8为不同孵化温度与质粒浓度转染对转化效率影响图；

[0061] 图9为未处理和处理后的受体材料瞬时转化效率比较图；

[0062] 图10采用常规方法获得的原生质体(A)和本实验改进方法(B)获得原生质体分别与2000ng/μL质粒浓度转染随着时间变化所获的转化效率比对图；

[0063] 图11为针头注射南林895杨叶片GFP蛋白亚细胞定位和原生质体瞬时转化对比图。从图中可以看本实验使用原生质体转染效果要比农杆菌注射效果更好，更易于后续蛋白功能研究分析。

具体实施方式

[0064] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中如无特殊说明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。以下实施例均在弱光环境中进行，所用的水均为灭过菌的 所有耐高温溶液和器材均经过高温灭菌。

[0065] 本方明中所用到的溶液及配制方法：

[0066] 2.46g/L MgSO4·7H2O：称取246mg的MgSO4·7H2O，溶于水中，定容至100mL，4℃保存。

[0067] 1.6mg/L KI：称取0.16mg的KI，溶于水中，定容至100mL，4℃贮于棕色瓶内保存。

[0068] 0.25mg/L CuSO4·5H2O：称取0.025mg的CuSO4·5H2O，溶于水中，定容至100mL，4℃保存。

[0069] 0.272g/L KH2PO4：称取27.2mg的KH2PO4，溶于水中，定容至100mL，4℃保存。

[0070] 1.010g/L KNO3：称取101mg的KNO3，溶于水中，定容至100mL，4℃保存。

[0071] 14.80g/L CaCl2·2H2O：称取1480mg的CaCl2·2H2O，溶于水中，定容至100mL，4℃保存。

[0072] 90g/L NaCl：称取18g的NaCl，溶于水中，定容至200mL，常温保存。

[0073] 184g/L CaCl2：称取36.8g的CaCl2，溶于水中，定容至200mL，‑20℃保存。

[0074] 9g/L C6H12O6：称取1.8g的C6H12O6，溶于水中，定容至200mL，4℃保存。

[0075] 4g/L KCl：称取0.8g的KCl，溶于水中，定容至200mL，4℃保存。

[0076] 10g/L MES：称取20g的MES，溶于水中，定容至200mL，4℃保存。

[0077] 7.1g/L MgCl2：称取0.1775g的MgCl2，溶于水中，定容至25mL，4℃保存。

[0078] 36.5g/L C6H14O6：称取0.9125g的C6H14O6，溶于水中，定容至25mL，4℃保存。

[0079] 200g/L C6H14O6：称取20g的C6H14O6，溶于水中，定容至100mL，4℃保存。

[0080] 111g/L CaCl2：称取1.11g的CaCl2，溶于水中，定容至10mL，‑20℃保存。

[0081] 溶液A：20mL MgSO4·7H2O溶液、20mLKI溶液、20mL CuSO4·5H2O溶液、20mL KH2PO4溶液、20mL KNO3溶液和20mL CaCl2·2H2O溶液，补水定容到200mL高温灭菌，‑20℃保存。

[0082] 溶液B：40mL NaCl溶液、40mL CaCl2溶液、40mL C6H12O6溶液、37mL KCl溶液和12mL MES溶液，补水定容到400mL，高温灭菌，‑20℃保存。

[0083] 溶液C：5mL MgCl2溶液、2.5mL MES溶液和9.125mL C6H14O6溶液，补水定容至50mL。

[0084] 溶液D：2g PEG4000粉末、0.9109mL C6H14O6溶液和0.5mL CaCl2溶液，补水定容至5mL。

[0085] 溶液E：3.9048mL MES、18.2172mL C6H14O6和18.5125mL KCl，补水定容至50mL。

[0086] 液体LB：10g/L胰蛋白胨(Tryptone)、5g/L酵母提取物(Yeast extract)、10g/L氯化钠(NaCl)，固体LB是在液体LB基础上，加入15g/L的琼脂粉。

[0087] 原生质体产量测定方法：10μL原生质体滴于血球计数板计数室内，每个方格3
0.1mm ，即为0.1μL，划分为9个大方格，每个大方格又分为16个中方格，每个中方格包含25个小方格。计数区的深度为0.02mm，计算4个角上的中方格中的原生质体总数，根据公式计算：

[0088] 原生质体产量＝4个中方格原生质体总数平均数×16×104稀释倍数/样品鲜重(个/g/FW)，

[0089] 原生质体密度＝(4个中方格内原生质体细胞总数/4)×16×104。

[0090] 台盼蓝可以将死细胞染成蓝色，正常活细胞不被染成蓝色，可以检验获得原生质体的活力，根据公式计算：

[0091] 原生质体活力＝(发蓝色荧光的原生质体数量/原生质体总数量)×100％。

[0092] 实施例1：质粒构建及提取

[0093] 采用常规PCR克隆RR基因序列，利用同源重组和Gateway技术通过BP和LR两轮反TM应，先后融合到pDONR 221和pK7FWG2，0载体中，构建含有荧光融合蛋白的RR‑GFP表达载体(pK7FWG‑RR‑GFP)，大小为4565bp。该载体特征如图1所示：目的基因RR的C端含有绿色荧光报告基因GFP，N端由CaMV 35S启动。

[0094] 测序筛选正确载体以及空载体pK7FWG2，0，转化大肠杆菌DH5α，吸取2μL在含有卡那霉素固体LB划板挑单克隆，接于100mL液体LB中，过夜培养，按照商业质粒小提试剂盒以及无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒浓度平均都在700‑800ng/μL，难以达到转染原生质体的要求，在现有试剂盒的基础上，最后一步溶液过滤在滤膜上时，将提取的100mL的菌液汇集一起，一起过滤在滤膜上，实验结果得到的质粒平均浓度能达到1200‑1400ng/μL，再通过真空浓缩离心机，抽提10min，提取质粒浓度达到1500‑3000ng/μL。

[0095] 实施例2：不同来源“南林895”叶片提取原生质体

[0096] 具体步骤如下：

[0097] 1)制备酶解液：将5mL溶液A，80mg离析酶R‑10，300mg纤维素酶R‑10依次加入10mL的EP管中，然后在55℃水浴锅中加热10min，中间颠倒混匀4‑5次，待冷却了后，再依次加入5μLβ‑巯基乙醇和200μL50mg/mL BSA溶液，定容到10mL混匀；

[0098] 2)分别取生长2个月健康幼嫩的“南林895杨”组培苗和实生苗的不同部位的叶片，尽量选择平展叶片，在无菌超净台中切掉叶边缘，平铺在叶分化培养基(MS+30g/L蔗糖+0.5mg/L6‑BA+0.002mg/L TDZ)，暗培养2d；

[0099] 3)将叶片放置在水平载玻片上，另一个载玻片压平卷缩叶片，接着倾斜45°压在叶片上，去除主脉，使用无菌且锋利的手术刀沿着倾斜的载玻片将叶片切成0.2mm细丝(图2)；

[0100] 4)迅速将切好的叶片细丝分别浸泡在5cm直径圆形塑料皿酶解液中(2‑3片嫩叶的量)，锡箔纸包好放置于50rpm/min摇床上，分别在室温下酶解6h后，再加入10mL溶液B，轻柔混匀，得酶解混合液；

[0101] 5)将酶解混合液用70μm细胞筛网过滤后放入EP管，观察并比较不同来源叶片的酶解处理效果，记录在表1中(70μm细胞筛网使用前浸泡在75％酒精中，取出后用无菌水冲洗3‑5次，再用溶液B润洗1次后用于过滤)；

[0102] 6)继续将EP管轻放离心机中，500rpm转速离心2min，使用移液枪缓慢吸去上清；

[0103] 7)轻缓加4mL溶液B重悬原生质体，冰浴静置30min，使用移液枪缓慢吸去上清；

[0104] 8)使用1mL溶液C重悬原生质体；

[0105] 9)吸取10μL原生质体悬液于血球计数板上，加入等体积台盼蓝染色2min后，通过光学显微镜下统计细胞数量和活性，检验原生质体的质量。

[0106] 观察结果如表1和图3所示，不同来源叶片的酶解处理效果差异很大，“南林895”实生苗叶片比组培苗获得原生质体杂质更多，肉眼可见的浓绿偏黑纯度低，组培苗提取原生质体颜色浓绿通透，原生质体纯度更好。

[0107] 表1不同来源“南林895”叶片及取材部位对原生质体提取效果影响

[0108]

[0109] 实施例3：移液枪头及酶解时间对“南林895”原生质体提取的影响

[0110] 主要步骤同实施例2，不同在于：步骤2)改为采用“南林895”组培苗第3‑4片叶；步骤4)酶解时间改为2h、4h、6h、8h、12h共五个时间梯度；步骤5)和6)使用移液枪吸去上清改为：使用移液枪，交替采用剪掉4mm的大枪头(最大限度体积量400μL)以及大枪头套小枪头(最大限度体积量1000μL)，缓慢吸去上清(图4)；

[0111] 实验结果如图3所示，制备原生质体的最佳方案为：采用“南林895”组培苗第3‑4片叶进行暗培养2d，酶解时间6h，使用大枪头套小枪头以及剪掉4mm的大枪头交替使用吸取上6
清液，此时原生质体产量最高达到了10×10个/g/FW(图5)，通过台盼蓝染色可以看到此阶段的原生质体也是完全有活力，未见有染成蓝色的原生质体(图6A‑H)。可见，枪头的改进能将原生质体损耗降低，相反地，普通枪头容易导致原生质体破裂和流失，造成原生质体损耗大(图6CK)。

[0112] 实施例4：不同质粒浓度和孵育温度对“南林895”原生质体转化效果的影响[0113] 具体步骤如下：

[0114] 1)采用实施例3中最佳方案制备“南林895”原生质体(原生质体密度8‑10×106个/g/FW)；

[0115] 2)按照实施例1方法构建制备不同浓度的质粒；

[0116] 3)取10μL质粒于2mL EP管中，加100μL原生质体，手动旋转EP管混匀；

[0117] 4)加入等体积溶液D，于血液混合器(图7)上旋转混匀(混匀时间1min)；

[0118] 5)设置三种温度梯度，分别为25℃、35℃、42℃孵育15min；

[0119] 6)加入440μL溶液B，于血液混合器上旋转混匀；

[0120] 7)轻放离心机中，500rpm转速离心2min，吸去上清；

[0121] 8)加入500μL溶液B重悬原生质体，500rpm转速离心1min，再次吸去上清；

[0122] 9)1mL溶液E重悬沉淀，于血液混合器上旋转混匀；

[0123] 10)将上述转化液置于30℃水浴锅暗培养3h，500rpm转速离心2min，吸去上清；

[0124] 11)吸取10μL转化液于载玻片上，通过激光共聚焦显微镜下观察转染情况。

[0125] 实验结果显示(图8)最佳转染方案是质粒浓度为2000ng/μL，42℃孵育15min，暗培养3h即可以看到大量的转化成功的原生质体，最高转化率达到92％，且重复性良好。

[0126] 实施例5：考察暗培养对“南林895”原生质体转化效果的影响

[0127] 主要步骤同用实施例4，采用最佳方案制备和转化原生质体：暗培养2d和未暗培养的“南林895”组培苗的叶片分别在酶解液中酶解6h，使用特殊枪头吸去上清，完成分离和纯化的原生质体制备步骤，在1000‑3000ng/μL质粒下，42℃孵育15min，30℃暗培养3h下效果显著不同，均在2000ng/μL质粒表现出最佳的转化效率，而提前进行暗培养处理的叶片获得更高的转化效率(图9)。

[0128] 实施例6：现有技术和本实验最佳方法转化效率随时间变化的不同趋势

[0129] 根据现有技术(中国发明专利201110314837.X)调整了最优的转化方法：即在酶解溶液(5mL溶液A、40mg离析酶R‑10、150mg纤维素酶R‑10，无菌水定容至10mL)中酶解6h，质粒浓度在2000ng/μL，25℃孵育15min，从图8中可以看出暗培养16.5h呈现出不到10％的转化效率，本实验在酶解溶液(5mL溶液A、80mg离析酶R‑10、300mg纤维素酶R‑10，无菌水定容至10mL)酶解6h，质粒浓度在2000ng/μL，42℃孵育15min，从暗培养1.5h开始就可以获得40％以上的转化效率，暗培养3h转化效率即高达90％以上，转化速率更快，更高效(图10)。

[0130] 实施例7：不同瞬时转化方法应用于“南林895”亚细胞定位效果比较

[0131] 1)将空载体pK7FWG2，0和RR‑GFP表达载体分别转化大肠杆菌DH5α和农杆菌EHA105，RR‑GFP‑DH5α用于提质粒，浓度达到2000ng/μL，RR‑GFP‑EHA105用于配置重悬液，OD值在1‑1.5之间；

[0132] 2)将提好的质粒按照实施例3与实施例4转染原生质体；将摇好的农杆菌菌液5000rpm离心30min，倒掉上清液，加入等体积的1/2MS溶液+100mg/L的乙酰丁香酮，重悬菌块，用注射器注射在“南林895”叶片背面上，由于“南林895”叶片光滑，难于注射，完全浸透注射一次需要10min左右，一个叶片注射3次需要30min以上，暗培养3天；

[0133] 3)将上述方法获得的转化材料在激光共聚焦显微镜下观察。

[0134] 实验结果显示(图11)：即便是将“南林895”叶片表皮去掉，但是由于叶片独特的构造难于像烟草和洋葱的叶肉组织结构能在明场下清晰呈现出来，不可否认的是，即便是在“南林895”叶肉组织不能呈现的情况下，本实验也能看到绿色荧光，表明本实验操作可以为后续研究注射“南林895”叶片提供参考价值。本发明所采用“南林895”瞬时转化体系的建立方法高效，技术稳定可控。相较于叶片注射实验周期历时4天，本方法一天即可完成，高效快速。