一种垂花百合鳞片快速诱导以及试管小鳞茎膨大的方法

摘要

本发明公开了一种垂花百合鳞片快速诱导以及试管小鳞茎膨大的方法，采用两步法进行，具体包括如下步骤：(1)取垂花百合的鳞片作为外植体，消毒灭菌后接种到不定芽诱导培养基上培养，诱导获得小鳞茎；(2)将所述小鳞茎接种到鳞茎膨大培养基中培养，获得膨大鳞茎组培苗。所述不定芽诱导培养基为MS基本培养基+NAA 0.2mg/L+TDZ 0.5mg/L+BR 0.05mg/L+结冷胶4g/L+蔗糖30g/L。所述鳞茎膨大培养基为：MS基本培养基+结冷胶4g/L+蔗糖30g/L。本发明方法能够有效提高垂花百合试管苗增大倍数、为垂花百合资源保护、快速繁殖及利用奠定基础。

权利要求

1.一种垂花百合鳞片快速诱导以及试管小鳞茎膨大的方法，其特征在于：采用两步法进行，具体包括如下步骤：(1)取垂花百合的鳞片作为外植体，消毒灭菌后接种到不定芽诱导培养基上培养，诱导获得小鳞茎；所述不定芽诱导培养基为MS基本培养基+NAA0.2mg/L+TDZ 0.5mg/L+BR 

0.05mg/L+结冷胶4g/L+蔗糖30g/L；

(2)将所述小鳞茎接种到鳞茎膨大培养基中培养，获得膨大鳞茎组培苗；所述鳞茎膨大培养基为：MS基本培养基+结冷胶4g/L+蔗糖30g/L。

2.根据权利要求1所述的垂花百合鳞片快速诱导以及试管小鳞茎膨大的方法，其特征在于：培养条件为：培养基pH值5.8～6.0，培养温度25±2℃，每日光照16h以上，光照强度

2000‑3000Lx。

3.根据权利要求1所述的垂花百合鳞片快速诱导以及试管小鳞茎膨大的方法，其特征在于：所述外植体消毒灭菌步骤具体包括如下步骤：选取垂花百合的鳞片为外植体，用含少量洗洁精的自来水浸泡10min，之后用自来水冲洗20min，转至超净工作台进行灭菌处理，具体灭菌处理方法为：先用酒精消毒60s，再用

20％二氯异氰尿酸钠处理40min，最后用无菌水冲洗4～6次，接种时，将消毒后的鳞片置于无菌培养皿中，用镊子将鳞片切成1cm*1cm大小，逐个接入固体MS培养基中，每瓶接种2‑3个鳞片，进行不定芽的诱导培养。

说明书

一种垂花百合鳞片快速诱导以及试管小鳞茎膨大的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及垂花百合快速诱导小鳞茎以及小鳞茎迅速膨大的方法。

背景技术

[0002] 垂花百合(Lilium cernuum)，是百合科百合属植物。鳞茎矩圆形或卵圆形，高4厘米，直径约4厘米；鳞片披针形或卵形，白色。茎高约65厘米，无毛。叶细条形。总状花序有花1‑6 朵；苞片叶状，条形，长约2厘米，顶端不加厚；子房圆柱形，长8‑10毫米，宽2毫米；花柱长1.5‑1.7厘米。花期7月。生长于草丛或灌木林中。喜较高地势，生长于有斜坡的疏松肥沃、排水良好的森林腐殖土壤，喜空气湿润。垂花百合是多年生球根花卉，植株低矮，是百合属中少有的淡紫红色，并且伴有香味，是一种珍贵的野生百合资源，具有良好的观赏价值和较强抗性，是育种的重要种质资源。因此，有必要应用离体培养技术对其扩繁，以利垂花百合资源的保存、研究和利用。植物组织培养是将植物体的一部分接种在培养基上，使其按预定目标发育成新植株，并且扩繁出更多的植株。植物组织培养由于周期短，增殖率高且能全年生产等优点，越来越多的应用于种苗生产。

[0003] 垂花百合自然分布数量稀少，而且鳞茎相对较小，扦插繁殖效率很低，利用组织培养方法不仅能保持原种的优良特性，而且繁殖系数高。但百合试管苗在出瓶移栽过程中存活率低，容易重新感染病毒。采用试管内形成鳞茎的组培方法可提高成活率、降低污染和感染病毒的机率，有利于种质保存。目前，国内外对垂花百合组织的报道不多，且诱导效率和小鳞茎质量都不是很理想，其作用以及结果还不明确。

发明内容

[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种‘垂花百合’鳞片快速诱导小鳞茎以及试管鳞茎膨大的最优方法，希望能够较好地提高诱导率以及降低成本保存种质资源，以期解决试管苗移栽成活率低的问题，达到百合组织培养实用化的目的。

[0005] 本发明垂花百合鳞片快速诱导以及试管小鳞茎膨大的方法，采用两步法进行，具体包括如下步骤：

[0006] (1)取垂花百合的鳞片作为外植体，消毒灭菌后接种到不定芽诱导培养基上培养，诱导获得小鳞茎；

[0007] (2)将所述小鳞茎接种到鳞茎膨大培养基中培养，获得膨大鳞茎组培苗。

[0008] 本发明所述的垂花百合鳞片快速诱导以及试管小鳞茎膨大的方法，其中，所述不定芽诱导培养基为MS基本培养基+NAA0.2mg/L+TDZ 0.5mg/L+BR 0.05mg/L+结冷胶4g/L+蔗糖 30g/L。

[0009] 本发明所述的垂花百合鳞片快速诱导以及试管小鳞茎膨大的方法，其中，所述鳞茎膨大培养基为：MS基本培养基+结冷胶4g/L+蔗糖30g/L。

[0010] 本发明所述的垂花百合鳞片快速诱导以及试管小鳞茎膨大的方法，其中，培养条件为：培养基pH值5.8～6.0，培养温度25±2℃，每日光照16h以上，光照强度2000‑3000Lx。

[0011] 本发明所述的垂花百合鳞片快速诱导以及试管小鳞茎膨大的方法，其中，所述外植体消毒灭菌步骤具体包括如下步骤：

[0012] 选取垂花百合的鳞片为外植体，用含少量洗洁精的自来水浸泡10min，之后用自来水冲洗 20min，转至超净工作台进行灭菌处理，具体灭菌处理方法为：先用酒精消毒60s，再用20％二氯异氰尿酸钠处理40min，最后用无菌水冲洗4～6次，接种时，将消毒后的鳞片置于无菌培养皿中，用镊子将鳞片切成1cm*1cm大小，逐个接入固体MS培养基中，每瓶接种2‑3个鳞片，进行不定芽的诱导培养。

[0013] 本发明垂花百合鳞片快速诱导以及试管小鳞茎膨大的方法与现有技术不同之处在于：本发明对垂花百合诱导小鳞茎以及小鳞茎膨大的方法探索，能够有效提高垂花百合诱导时间和诱导率，做到高效低成本保存种质资源，以期解决试管苗移栽成活率低的问题，达到百合组织培养实用化的目的。

[0014] 下面结合附图对本发明的垂花百合鳞片快速诱导以及试管小鳞茎膨大的方法作进一步说明。

附图说明

[0015] 图1为本发明的垂花百合种球；

[0016] 图2为本发明方法中的垂花百合培养过程示意图；其中：‘垂花百合’鳞片诱导小鳞茎(A)；转接到MS培养基，培养10d后，小鳞茎为(B)；20d后，小鳞茎膨大(C)，25d后，小鳞茎膨大(D)。

具体实施方式

[0017] 9到10月选取生长健壮的垂花百合的种球(图1)，剥取中外层健康鳞片，用含少量洗洁 精的自来水浸泡10min，之后用自来水冲洗20min，转至超净工作台进行灭菌处理，具体灭菌 处理方法为：先用酒精消毒60s，再用20％二氯异氰尿酸钠处理40min，最后用无菌水冲洗4‑6 次，接种时，将消毒后的鳞片置于无菌培养皿中，用镊子将鳞片切成1cm*1cm大小，逐个接 入固体MS培养基中，每瓶接种2‑3个鳞片，进行不定芽的诱导培养。

[0018] 用到的诱导培养基为：MS基本培养基+NAA0.2mg/L+TDZ 0.5mg/L+BR0.05mg/L+结冷胶4.0g/L+蔗糖30g/L，培养温度(25±2)℃，每日光照16h以上，光照强度2000‑3000Lx。接种时，将消毒后的鳞片置于无菌培养抿，用消毒后晾干后的镊子，逐个接入诱导培养基中，每瓶接种2‑3个鳞片，进行不定芽的诱导。培养温度25±2℃，外植体接种后进行光培养，16h 以上，光照强度为2000‑3000lx。30d后统计诱导率。

[0019] 诱导率％＝不定芽诱导数/未污染接种总数×100％

[0020] 结果：用20％二氯异氰尿酸钠浸泡40min效果最好，污染率低为20％，且成活率高达93。 33％。

[0021] 如图2所示，‘垂花百合’鳞片诱导小鳞茎，17d后鳞片处开始有变化，23d后慢慢长成小鳞茎状；相比较添加NAA和6‑BA或者BA组合的培养基中，在含有TDZ、BR的培养基中，诱导时间较快，达到了快速诱导小鳞茎的效果，为接下来进行下一步实验节省一定的时间，并且诱导率高达96％。

[0022] 将诱导出的小鳞茎接种到不添加任何激素的培养基后，培养10d后，小鳞茎开始变大，如图2中的B，再继续培养10d后，小鳞茎膨大至C。

[0023] 消毒时间处理相比于其他处理的对比试验如下：

[0024]

[0025]

[0026] 除表格中列举的区别外，其他试验条件均相同。

[0027] 从不同消毒组合处理所得出：在对比例1中，将消毒剂时间延长至50min，污染率偏高，可知消毒时间不宜过长；将浓度设置成3％的二氯异氰尿酸钠，成活率偏低，所以也不适合，对比之下，时间为40min左右是最适合垂花百合的消毒处理。

[0028] 消毒方法的优势在于，从传统的性能上来说，二氯异氰尿酸钠比次氯酸钠好些，因为二氯异氰尿酸钠能够稳定地水解成次氯酸，就像缓解制剂一样。价格上来说，次氯酸钠更贵一点；相比传统的处理方法，用于环境杀菌消毒的次氯酸钠溶液须稀释并及时使用，若在空气中暴露时间过长且见光，将会导致消毒作用减弱。我们通常所看到的对百合鳞片消毒大部分使用次氯酸钠，污染率根据时间的长短来决定，并且成活率也伴随消毒时间长短而下降；而二氯异氰尿酸钠具有很强的氧化性，对各种致病性微生物如病毒、细菌芽孢、真菌等有很强的杀生作用，是一种适用范围广，高效的杀菌剂。

[0029] 诱导培养基相比于其他传统配方的对比试验如下：

[0030]

[0031]

[0032] 除表格中列举的区别外，其他试验条件均相同。

[0033] 从上表可知，本发明与对比例1，对比例2，对比例3都呈显著性差异，并且在本发明配方中诱导率明显高于对比2和3；对比例4～6中，将不同浓度的TDZ和NAA组合，并且运用光暗交替培养与光培养来进行不同处理，试验得出的结果可知，光培养下的诱导率要高于光暗交替培养，且在NAA浓度1.0mg/L时，诱导率很低，说明NAA浓度不宜过高，会影响垂花百合的诱导率。本发明配方中，在添加TDZ、NAA和BR的培养基中，诱导率高达83.33％，更利于对垂花百合鳞片的诱导，TDZ本身就可促进芽的再生和繁殖，促进愈伤组织生长以及延缓植物衰老，不仅如此，本项发明培养基中新添加了一种新兴的植物生长调节剂‑芸苔素内酯BR，它是一种高效植物激素，在很低浓度下，即能显著地增加植物的营养体生长和促进受精作用。除此之外，培养条件也是组培过程中的一个重要因素，对于垂花百合来说，光培养要比光暗交替效果要好。

[0034] 本发明所属膨大培养基的有益效果如下，相比常用的其他培养基配方，对不同蔗糖含量对百合鳞茎膨大做出的研究表明：含糖量高的比标准含糖量效果并无明显差异，因此，本发明采用标准含糖量也可使鳞茎膨大试验成功，还节省试验材料，可降低成本；国内外有不少学者对在培养基添加不同激素的植物生长调节剂对百合试管鳞茎做了初步研究，但在百合试管鳞茎膨大过程中，各种物质的调控作用还并没有十分明确。

[0035] 膨大培养基相比于其他配方优势在于：

[0036]

[0037]

[0038] 注：鳞茎直径、高度用经过高压灭菌锅的游标卡尺测定试管鳞茎的直径、高度；

[0039] 鳞茎指数＝鳞茎高度/鳞茎直径；

[0040] 增大倍数＝鳞茎直径/接种直径(0.3cm)；

[0041] 除表格中列举的区别外，其他试验条件均相同。

[0042] 从表中可知，对比例1和本发明的效果是最好的，因对比例1中添加活性炭，虽然活性炭能够促进小鳞茎膨大，对小鳞茎的生长起到一定的积极作用，但是在本发明中，不添加任何激素中，也能够较好地促使小鳞茎膨大，相比而言，本发明来说，更简单便捷，高效快速使鳞茎膨大。

[0043] 本发明为两步法，不需要传统的增殖过程，高效省时，节约成本。目前相对于其他野生百合而言，因为百合种球本身就带菌，所以污染率相较而言会更高，并且诱导率也很低，在不断的探索中发现，垂花百合的污染率控制比较好，并且诱导率也很高，再添有不同生长素以及细胞分裂素后，诱导时间也更快更早，才发明出现在这样高效快捷的两步法。

[0044] 以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。