牙髓干细胞小细胞外囊泡在制备用于治疗炎性骨吸收药物中的应用转让专利
申请号 : CN202211242011.1
文献号 : CN115501252B
文献日 : 2023-07-11
发明人 : 龚启梅 , 田俊 , 韦曦
申请人 : 中山大学附属口腔医院
摘要 :
本发明公开了牙髓干细胞小细胞外囊泡在制备用于治疗炎性骨吸收药物中的应用，涉及生物医药技术领域。本申请发明人研究发现，DPSC‑sEV对巨噬细胞炎症反应以及破骨细胞生成具有调控作用，能够促进炎性骨吸收修复再生。不仅为制备治疗炎性骨吸收的药物提供了一种新来源，同时也发掘出了牙髓干细胞小细胞外囊泡新的药用价值。
权利要求 :
1. 牙髓干细胞小细胞外囊泡在制备用于治疗炎性骨吸收药物中的应用；所述牙髓干细胞小细胞外囊泡采用低氧处理；所述药物中牙髓干细胞小细胞外囊泡的浓度为30 μg/mL。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述低氧为氧气浓度为1%。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述牙髓干细胞小细胞外囊泡的制备方法包括以下步骤：（1）从离体牙齿中获取牙髓组织；
（2）将牙髓组织进行培养，获得牙髓干细胞；
（3）将生长至密度为80‑90%的牙髓干细胞于无血清培养基、低氧条件下培养，收集培养液；
（4）对步骤（3）的培养液进行离心得牙髓干细胞小细胞外囊泡。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物诱导M1巨噬细胞向M2巨噬细胞转换。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物抑制巨噬细胞促炎细胞因子的表达，并促进抗炎细胞因子的表达。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物抑制破骨细胞的形成。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述炎性骨吸收包括骨髓炎、牙周炎、种植体周围炎、类风湿性关节炎或化脓性关节炎引起的骨吸收。
说明书 :
牙髓干细胞小细胞外囊泡在制备用于治疗炎性骨吸收药物中
的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物药物技术领域，具体涉及牙髓干细胞小细胞外囊泡在制备用于治疗炎性骨吸收药物中的应用。
背景技术
[0002] 在炎性骨吸收疾病中，如骨髓炎、牙周炎、种植体周围炎、类风湿性关节炎(RA)和化脓性关节炎等，单个核/巨噬细胞被募集并向促炎的M1型极化。持续激活的M1巨噬细胞产生大量促炎细胞因子，如IL‑1β、IL‑6和TNF‑α等，诱发炎症级联反应以及破骨细胞过度形成和活化。鉴于促炎M1巨噬细胞和过度破骨细胞生成在骨破坏中的关键作用，诱导M1巨噬细胞向抗炎的M2型转换、抑制破骨细胞形成，已被认为是治疗炎性骨吸收的有效策略。目前常用的抗骨吸收药物，包括双膦酸盐、组织蛋白酶K抑制剂和RANKL抑制剂(如地诺单抗)，可有效抑制骨吸收，但这些药物有诸多副作用，包括具有肾毒性、诱发过敏反应和颌骨坏死等。此外，这些药物无法诱导M2巨噬细胞形成以改善炎症微环境。因此，亟待研究新的治疗方案来治疗和预防炎症性骨吸收。
[0003] 间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)来源小细胞外囊泡(MSC‑sEV)已被证实具有显著的免疫调节功能，可有效诱导巨噬细胞M2形成，并促进缺损骨组织修复再生，有望成为炎性骨吸收疾病治疗的新方案。牙髓干细胞(DPSCs)是从成人牙髓中分离出来的间充质干细胞，其来源广泛，可从拔出的牙齿中获取，不会引起伦理问题。与经典的骨髓间充质干细胞(BMSCs)相比，DPSCs具有出更高的增殖率。此外，据报道，DPSC‑sEV显示出比BMSC‑sEV更强的免疫调节功能。DPSC‑sEV也被证实对皮肤伤口、脊髓损伤以及下颌骨和颅骨缺损具有治疗作用。然而，目前尚不清楚DPSC‑sEV是否可通过同时直接抑制巨噬细胞炎症反应和破骨细胞生成以促进炎性骨吸收修复再生。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供牙髓干细胞小细胞外囊泡在制备用于治疗炎性骨吸收药物中的应用。
[0005] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：牙髓干细胞小细胞外囊泡在制备用于治疗炎性骨吸收药物中的应用。
[0006] 牙髓干细胞(DPSCs)是从成人牙髓中分离出来的间充质干细胞，与经典的骨髓间充质干细胞(BMSCs)相比，DPSCs具有出更高的增殖率。研究表明，DPSCs小细胞外囊泡(sEV)比BMSC‑sEV具有更强的免疫调节作用，并对皮肤伤口、脊髓损伤以及下颌骨和颅骨缺损具有治疗作用。但目前并未有DPSC‑sEV治疗炎性骨吸收的相关报道。本申请发明人研究发现，DPSC‑sEV对巨噬细胞炎症反应以及破骨细胞生成具有调控作用，能够促进炎性骨吸收修复再生。
[0007] 作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述牙髓干细胞小细胞外囊泡采用低氧处理。体外培养或扩增的MSCs通常暴露于常氧(21％O2)，这与自然生理条件下体内的氧浓度不同。本申请发明人研究发现低氧(1％O2)预处理可促进DPSC‑sEV的释放。此外，与常氧(21％O2)条件下获取的DPSC‑sEV相比，低氧预处理的DPSC‑sEV能增强诱导巨噬细胞M2向极化以及抑制破骨细胞形成，减轻脂多糖(LPS)诱导的炎性骨吸收。
[0008] 作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述低氧为氧气浓度为1％。
[0009] 作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述牙髓干细胞小细胞外囊泡的制备方法包括以下步骤：
[0010] (1)从离体牙齿中获取牙髓组织；
[0011] (2)将牙髓组织进行培养，获得牙髓干细胞；
[0012] (3)将生长至密度为80‑90％的牙髓干细胞于无血清培养基、低氧条件下培养，收集培养液；
[0013] (4)对步骤(3)的培养液进行离心得牙髓干细胞小细胞外囊泡。
[0014] 作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述药物诱导M1巨噬细胞向M2巨噬细胞转换。本申请发明人研究发现，DPSC‑sEV能够可减少炎性骨组织M1巨噬细胞的数量，并增加M2巨噬细胞的数量，且低氧处理的DPSC‑sEV诱导M1巨噬细胞向M2巨噬细胞转换的作用更强。
[0015] 作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述药物抑制巨噬细胞促炎细胞因子的表达，并促进抗炎细胞因子的表达。本申请发明人研究发现，DPSC‑sEV能够抑制促炎细胞因子IL‑6和TNF‑α的表达，而低氧处理的DPSC‑sEV不仅能够抑制促炎细胞因子IL‑1β、IL‑6和TNF‑α的表达，而且能够高效地诱导Arg1、CD163和CD206的表达。
[0016] 作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述药物抑制破骨细胞的形成。
[0017] 作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述炎性骨吸收包括骨髓炎、牙周炎、种植体周围炎、类风湿性关节炎或化脓性关节炎。
[0018] 作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述药物中牙髓干细胞小细胞外囊泡的浓度为30μg/mL。
[0019] 本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包括低氧处理的牙髓干细胞小细胞外囊泡和药学上可接受的载体。
[0020] 本发明的有益效果：本发明提供牙髓干细胞小细胞外囊泡在制备用于治疗炎性骨吸收药物中的应用。本发明首次揭示了低氧处理可通过同时增强DPSC‑sEV对巨噬细胞炎症反应以及破骨细胞生成的调控作用，进而促进炎性骨吸收修复再生的作用机制。将低氧处理的牙髓干细胞小细胞外囊泡应用于治疗炎性骨吸收，不仅为制备治疗炎性骨吸收的药物提供了一种新来源，同时也发掘出了牙髓干细胞小细胞外囊泡新的药用价值。
附图说明
[0021] 图1为大鼠DPSCs的表型鉴定结果图；其中A为DPSCs表面标记物流式细胞术分析图；B为波形蛋白和细胞角蛋白的免疫荧光染色图；C为DPSCs的茜素红染色和油红O染色图。
[0022] 图2：A为DPSC‑sEV的透射电镜图；B为DPSC‑sEV的NTA粒径分析对比图；C为DPSC‑sEV的颗粒数对比图；D为DPSC‑sEV的蛋白质浓度对比图；E为DPSC‑sEV的囊泡相关标记物蛋白质印迹图。
[0023] 图3：A为实施例2实验流程图；B为Micro‑CT扫描和颅骨3D重建图；C为骨体积/组织体积对比图；D为颅骨HE染色图；E为颅骨侵蚀面积对比图。
[0024] 图4：A为激光扫描共聚焦显微镜观察LPS、LPS+Nor‑sEV、LPS+Hypo‑sEV组的CD68++ + +iNOS巨噬细胞(M1)分布图；B为LPS、LPS+Nor‑sEV、LPS+Hypo‑sEV组的CD68iNOS巨噬细胞+
(M1)数目图；C为激光扫描共聚焦显微镜观察LPS、LPS+Nor‑sEV、LPS+Hypo‑sEV组的CD68+ + +
Arg1巨噬细胞(M2)分布图；D为LPS、LPS+Nor‑sEV、LPS+Hypo‑sEV组的CD68 Arg1巨噬细胞(M2)数目图；E为LPS、LPS+Nor‑sEV、LPS+Hypo‑sEV组IL‑1β、IL‑6、TNF‑α、IL‑10和Arg1的mRNA表达对比图；F为LPS、LPS+Nor‑sEV、LPS+Hypo‑sEV组巨噬细胞相关标记物蛋白质印迹图；G为LPS、LPS+Nor‑sEV、LPS+Hypo‑sEV组CD86流式细胞术分析图；H为LPS、LPS+Nor‑sEV、LPS+Hypo‑sEV组CD163流式细胞术分析图；I为LPS、LPS+Nor‑sEV、LPS+Hypo‑sEV组CD206流式细胞术分析图。
(M1)数目图；C为激光扫描共聚焦显微镜观察LPS、LPS+Nor‑sEV、LPS+Hypo‑sEV组的CD68+ + +
Arg1巨噬细胞(M2)分布图；D为LPS、LPS+Nor‑sEV、LPS+Hypo‑sEV组的CD68 Arg1巨噬细胞(M2)数目图；E为LPS、LPS+Nor‑sEV、LPS+Hypo‑sEV组IL‑1β、IL‑6、TNF‑α、IL‑10和Arg1的mRNA表达对比图；F为LPS、LPS+Nor‑sEV、LPS+Hypo‑sEV组巨噬细胞相关标记物蛋白质印迹图；G为LPS、LPS+Nor‑sEV、LPS+Hypo‑sEV组CD86流式细胞术分析图；H为LPS、LPS+Nor‑sEV、LPS+Hypo‑sEV组CD163流式细胞术分析图；I为LPS、LPS+Nor‑sEV、LPS+Hypo‑sEV组CD206流式细胞术分析图。
[0025] 图5：A和B为LPS、LPS+Nor‑sEV、LPS+Hypo‑sEV组TRAP+破骨细胞数量对比图；C和D+为RANKL、RANKL+Nor‑sEV、RANKL+Hypo‑sEV组TRAP多核破骨细胞数量对比图；E为RANKL、RANKL+Nor‑sEV、RANKL+Hypo‑sEV组Acp5、CTSK、c‑FOS、DC‑STAMP和Atp6v0d2的表达水平图。
具体实施方式
[0026] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0027] 实施例1大鼠DPSCs的分离培养
[0028] 局麻下拔除5周龄SD大鼠的上颌中切牙并用镊子去除部分牙釉质和牙本质，分离牙髓组织并在α‑MEM中用眼科剪剪碎，切碎的牙髓组织培养于含DPSCs培养液的10cm直径培养皿中，每三天更换一次培养基，于37℃、5％CO2培养7‑10天后，将贴壁克隆样生长的DPSCs传代，取第3‑5代DPSCs用于后续的实验。
[0029] 实施例2大鼠DPSCs的表型鉴定
[0030] 本实施例对实施例1制备得到的DPSCs的表型进行鉴定，具体如下：
[0031] 2.1流式细胞术分析表面标记物
[0032] 将生长状态良好的第3代DPSCs胰蛋白酶消化，500×g离心5分钟后，用含3％胎牛血清PBS的FACS液洗2次；分别加入FITC‑抗大鼠CD34、PE‑抗大鼠CD45、CD44、CD90、APC‑抗鼠CD29抗体，同时设立同型对照以及不加抗体的空白对照，于4℃下避光孵育30分钟，FACS液洗涤细胞2次后上流式细胞仪分析。
[0033] 2.2波形蛋白和细胞角蛋白的免疫荧光染色
[0034] DPSCs以5×104/mL密度接种于放置了细胞爬片的24孔板中，每孔1mL，培养24小时后；4％PFA固定细胞15min,利用含0.1％Triton X‑100以及5％BSA的PBS透膜及封闭；于4℃添加一抗(vimentin或cytokeratin‑14抗体)孵育过夜，然后常温下Alexa Fluor 488/568二抗孵育1h，DAPI染核后封片。
[0035] 2.3 DPSCs的成骨及成脂向分化潜能
[0036] 将3×105个DPSCs/孔接种在6孔板中。为了诱导DPSCs的成骨或成脂分化，将培养液更换为成骨或成脂诱导液，每隔3天换液，诱导14天后，用PBS洗涤细胞，4％PFA于室温固定细胞30分钟，随后进行茜素红染色或油红O染色，显微镜下观察矿化结节和脂滴形成情况。
[0037] 实验结果如图1所示，由图1的流式细胞图可知，DPSCs中MSCs标记物CD29、CD44和CD90的阳性表达率超过96％，造血干细胞表面标记物CD34以及白细胞表面标记物CD45的表达率仅低于3.2％。免疫荧光分析显示DPSCs阳性表达MSC标志物波形蛋白，不表达上皮标志物细胞角蛋白。此外，茜素红染色结果显示DPSCs可形成矿化基质，油红O染色显示的脂滴形可形成于DPSCs中。
[0038] 实施例3DPSCs的成骨及成脂向分化潜能
[0039] DPSCs生长至约80‑90％密度后，培养液更换为无血清培养基，将其培养于21％O2(常氧)或1％O2(低氧)48小时。收集条件培养基并依次以800×g离心10分钟、3000×g离心10分钟，去除细胞碎片和大囊泡，然后于4℃下以100,000×g超速离心60分钟，弃去上清液后，将在常氧(Nor‑sEV)或低氧(Hypo‑sEV)条件下获取的DPSC‑sEV重悬浮于无菌PBS中并储存在‑80℃。按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明检测sEV总蛋白浓度；利用透射电镜(transmission electron microscopy，TEM)以及Nanosight检测sEV的形态以及大小分布；
利用Westernblot检测提取到的sEV是否表达特异性标志物TSG101、CD63以及CD9。
利用Westernblot检测提取到的sEV是否表达特异性标志物TSG101、CD63以及CD9。
[0040] 结果如图2所示，透射电镜显示Nor‑sEV和Hypo‑sEV均为“杯盘状”结构。NTA显示Nor‑sEV和Hypo‑sEV的峰直径分别为133nm和124nm；此外，与Nor‑sEV相比，Hypo‑sEV浓度或颗粒数更高；Hypo‑sEV的蛋白质浓度也显着高于Nor‑sEV；蛋白质印迹结果显示Nor‑sEV和Hypo‑sEV均表达sEV相关蛋白标记CD63、TSG101和CD9；Hypo‑sEV中TSG101和CD9的表达水平高于Nor‑sEV。然而，低氧显着降低了DPSCs中CD63和CD9的表达，表明低氧诱导sEV从DPSCs中释放，而并非影响DPSCs中sEV的生成。
[0041] 实施例4LPS诱导的颅骨炎性骨吸收模型的建立
[0042] 具体实验方法：麻醉C57BL6小鼠后，于颅骨的矢状中线缝合处接受25mg/kg LPS(Escherichia coli O111:B4)的皮下注射。为评估Nor‑sEV和Hypo‑sEV对LPS诱导的颅骨炎性骨吸收的治疗效果，每只小鼠在注射LPS时同时注射100μg Nor‑sEV或Hypo‑sEV。7天后，处死所有小鼠，收集颅骨并于4％PFA中固定24小时，用于进一步的显微CT和组织学分析。
[0043] 显微CT分析方法：使用高分辨率微型CT(μCT‑50,SCANCO Medical AG)扫描颅盖骨，扫描参数如下：70kV、114μA和7μm。采用μCT Evaluation Program V6.6软件进行三维(3D)图像重建并分析骨体积/组织体积(BV/TV)。
[0044] 颅骨组织病理及免疫荧光染色：颅骨于10％EDTA(pH＝7.4)中脱钙2周，常规脱水，石蜡包埋及切片后进行常规HE染色。光学显微镜下观察并分析炎症细胞浸润和骨吸收情况。
[0045] 实验结果如图3所示，Micro‑CT扫描和颅骨3D重建显示，与对照组相比，LPS组的小鼠骨吸收显著增加，BV/TV降低。HE染色分析表明，LPS注射后炎症细胞浸润以及骨吸收面积明显增加。Nor‑sEV未能显著减轻LPS诱导的炎性骨吸收。而Hypo‑sEV显著减少炎症细胞浸润，增加BV/TV，减少骨侵蚀面积，有效抑制LPS诱导的颅骨炎性骨吸收
[0046] 实施例5
[0047] 本实施例探究低氧处理DPSC‑sEV在体内外巨噬细胞M2向极化诱导作用，具体实验方法如下：
[0048] 免疫荧光染色观察颅骨中巨噬细胞极化情况：采用OCT包埋将颅骨，冰冻切片后，利用含0.1％Triton X‑100以及5％血清的封闭缓冲液封闭60分钟后，4℃下一抗(CD68、iNOS、Arg‑1抗体)孵育过夜，然后常温下Alexa Fluor488/568二抗孵育1h，DAPI染核后封+ + + +片。使用激光扫描共聚焦显微镜观察CD68iNOS巨噬细胞(M1)和CD68Arg1巨噬细胞(M2)分布和比例。
[0049] 实时荧光定量PCR(RT‑PCR)：利用RNA‑Quick Purification Kit(ESscience，北京，中国)从LPS或RANKL刺激后的RAW264.7细胞中提取RNA；然后利用PrimeScriptTM RT试剂盒(TaKaRa Co.，Kyoto，Japan)将RNA逆转录为cDNA；最后使用Fast SYBR Green Master Mix(Thermo Fisher，Waltham，MA，USA)实施RT‑PCR，以β‑actin作为内参；所检测的mRNA的引物序列表1所示。
[0050] 流式细胞术分析巨噬细胞表面标志物：用500ng/mL LPS和30μg/mL Nor‑sEV或Hypo‑sEV刺激RAW264.7巨噬细胞12小时。然后TrypLE(Gibco,USA)消化，500×g离心5分钟后，用含3％胎牛血清PBS的FACS液洗2次；在样品用CD86‑PerCP、CD163‑APC和CD206‑FITC单克隆抗体(eBioscience，San Diego，CA，4℃下避光孵育30分钟；FACS液洗涤细胞2次后上流式细胞仪分析。
[0051] 表1
[0052]
[0053]
[0054] 实验结果如图4所示，免疫荧光结果显示，LPS增加了骨组织中CD68+iNOS+巨噬细胞+ +(M1巨噬细胞)的数量；而Nor‑sEV和Hypo‑sEV均可减少炎性骨组织中CD68iNOS巨噬细胞数+ + +
量，并增加CD68Arg1巨噬细胞(M2巨噬细胞)数量。此外，与LPSNor‑sEV组相比，LPS+Hypo‑+ + + +
sEV组中具有更少的CD68iNOS巨噬细胞和更多的CD68Arg1巨噬细胞。
量，并增加CD68Arg1巨噬细胞(M2巨噬细胞)数量。此外，与LPSNor‑sEV组相比，LPS+Hypo‑+ + + +
sEV组中具有更少的CD68iNOS巨噬细胞和更多的CD68Arg1巨噬细胞。
[0055] 体外PCR结果显示，LPS刺激显著诱导RAW264.7细胞中促炎细胞因子IL‑1β、IL‑6和TNF‑α的mRNA表达，而抑制抗炎细胞因子IL‑10的mRNA表达。Nor‑sEV抑制IL‑6和TNF‑α的表达，对IL‑1β或IL‑10的表达没有显著影响。Hypo‑sEV不仅抑制了IL‑1β、IL‑6和TNF‑α的表达，而且上调了IL‑10以及M2巨噬细胞的关键效应物和标志物Arg1的表达。此外，与Nor‑sEV相比，Hypo‑sEV显著降低IL‑1β和TNF‑α的表达，并促进了IL‑10和Arg1的表达。蛋白质印迹和流式细胞术分析结果显示，Nor‑sEV上调了LPS刺激后的RAW264.7细胞中M2巨噬细胞标志物Arg1、CD163和CD206的表达。然而，其对M1巨噬细胞标志物iNOS和CD86的表达无显著影响。与Nor‑sEV相比，Hypo‑sEV可更高效地诱导Arg1、CD163和CD206的表达。此外，Hypo‑sEV显著抑制iNOS和CD86的表达。这些结果表明Hypo‑sEV可抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应并诱导巨噬细胞M2向极化。
[0056] 实施例6
[0057] 本实施例探究低氧处理DPSC‑sEV在体内外对破骨细胞形成的影响，具体实验方法如下：
[0058] 体内破骨细胞形成：颅骨常规石蜡包埋及切片后进行TRAP染色，光学显微镜下观察TRAP阳性破骨细胞形成情况并统计其数量。
[0059] 体外破骨细胞形成：将RAW264.7细胞以2.5×104/mL密度接种于六孔板，每孔2mL，24小时后换为含50ng/mL sRANKL(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)与30μg/mL Nor‑sEV或Hypo‑sEV的培养基连续培养4天，隔日换液。4天后PBS漂洗两次，利用TRAP染色试剂盒+
(387‑A)进行染色，DAPI染核后双蒸水清洗3遍，倒置显微镜下观察TRAP染色情况。TRAP 且细胞核数≥3的细胞计做破骨细胞。
(387‑A)进行染色，DAPI染核后双蒸水清洗3遍，倒置显微镜下观察TRAP染色情况。TRAP 且细胞核数≥3的细胞计做破骨细胞。
[0060] 实验结果如图5所示，TRAP染色表明，注射LPS导致颅骨中TRAP+破骨细胞数量显著+增加，这与增强的骨吸收相一致。Nor‑sEV和Hypo‑sEV均减少了LPS诱导的TRAP破骨细胞数+
量。此外，LPS+Hypo‑sEV组中TRAP 破骨细胞数量的数量低于LPS+Nor‑sEV组。体外结果发+
现，RANKL可诱导RAW264.7细胞形成大量TRAP多核破骨细胞。而Nor‑sEV和Hypo‑sEV抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化，显著减少破骨细胞数量。此外，Hypo‑sEV对破骨细胞生成的抑制作用强于Nor‑sEV。PCR结果显示，RANKL显著诱导RAW264.7细胞中抗酒石酸酸性磷酸酶5+
(Acp5)、组织蛋白酶K(CTSK)、c‑FOS、树突状细胞特异性跨膜蛋白(DC‑STAMP)和ATPaseH 运输V0亚基D2(Atp6v0d2)的mRNA表达。Nor‑sEV仅显着抑制Acp5的表达，尽管CTSK、c‑FOS和DC‑STAMP的表达在Nor‑sEV处理后呈下降趋势。值得注意的是，Hypo‑sEV显着抑制RANKL诱导的Acp5、CTSK、c‑FOS、DC‑STAMP和Atp6v0d2的表达水平。与RANKL+Nor‑sEV组相比，RANKL+Nor‑sEV组Acp5、CTSK、DC‑STAMP和Atp6v0d2表达水平更低。上述结果表明Hypo‑sEV于体内外直接抑制破骨细胞形成。
量。此外，LPS+Hypo‑sEV组中TRAP 破骨细胞数量的数量低于LPS+Nor‑sEV组。体外结果发+
现，RANKL可诱导RAW264.7细胞形成大量TRAP多核破骨细胞。而Nor‑sEV和Hypo‑sEV抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化，显著减少破骨细胞数量。此外，Hypo‑sEV对破骨细胞生成的抑制作用强于Nor‑sEV。PCR结果显示，RANKL显著诱导RAW264.7细胞中抗酒石酸酸性磷酸酶5+
(Acp5)、组织蛋白酶K(CTSK)、c‑FOS、树突状细胞特异性跨膜蛋白(DC‑STAMP)和ATPaseH 运输V0亚基D2(Atp6v0d2)的mRNA表达。Nor‑sEV仅显着抑制Acp5的表达，尽管CTSK、c‑FOS和DC‑STAMP的表达在Nor‑sEV处理后呈下降趋势。值得注意的是，Hypo‑sEV显着抑制RANKL诱导的Acp5、CTSK、c‑FOS、DC‑STAMP和Atp6v0d2的表达水平。与RANKL+Nor‑sEV组相比，RANKL+Nor‑sEV组Acp5、CTSK、DC‑STAMP和Atp6v0d2表达水平更低。上述结果表明Hypo‑sEV于体内外直接抑制破骨细胞形成。
[0061] 本发明实施例的实验数据采用均数±标准差 表示，所有实验重复3‑4次，采用SPSS17.0软件分析。多组间比较采用单因素方差分析(one‑way ANOVA)，若有显着性差异，多个实验组与一个对照组比较采用Dunnett t检验(Dunnett t test)，组间两两比较采用Bonferronit检验(Bonferronit test)，以P<0.05为有显着性差异。
[0062] 最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。