一种活血消痛酊挥发性成分特征图谱的建立方法及其应用转让专利
申请号 : CN202211158404.4
文献号 : CN115508471B
文献日 : 2023-11-10
发明人 : 熊伟 , 李磊 , 卢玉斌 , 郭立 , 何梅 , 高琴 , 左杰 , 张春霞
申请人 : 河南羚锐制药股份有限公司
摘要 :
本发明涉及活血消痛酊挥发性成分特征图谱的建立方法及其应用，可全面地对活血消痛酊中挥发油的整体质量进行评价，并对活血消痛酊中各单味药材色谱峰进行了归属确证，保证活血消痛酊中有效成分的种类相对稳定，其解决的技术方案是，包括以下步骤：1）供试品溶液的制备；2）对照品溶液的制备；3）特征图谱建立与相似度计算；4）确定活血消痛酊挥发性成分与药材、原料的相关性；本发明经方法学验证其精密度、重复性及稳定性好，简便、可行，能快速测定不同指标成分，准确度高，能更好的评价活血消痛酊的质量，是活血消痛酊挥发性成分特征图谱建立方法上的创新。
权利要求 :
1.一种活血消痛酊挥发性成分特征图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：
取活血消痛酊样品，置烧瓶中，加入蒸馏水及沸石，利用水蒸气蒸馏法提取挥发油，挥发油测定器中加入提取溶剂，提取后冷却至室温，收集提取溶剂层，用无水硫酸钠脱水，并用提取溶剂清洗冷凝管、挥发油提取器，定容，摇匀，得活血消痛酊挥发性成分供试品溶液；
2)对照品溶液的制备：
取3‑蒈烯、桉油精、樟脑、反式石竹烯、薄荷脑、异龙脑、龙脑、丁香酚、对甲氧基肉桂酸乙酯对照品，用提取溶剂溶解并定容，配成一定浓度溶液，即得对照品溶液；
3)特征图谱建立与相似度计算：
分别吸取对照品溶液与活血消痛酊挥发性成分供试品溶液，注入气质色谱仪，以薄荷脑为特征图谱参照物，以薄荷脑色谱峰为参照物峰，测定多批活血消痛酊挥发性成分供试品溶液，生成活血消痛酊挥发性成分共有对照特征图谱，以图谱中均存在的色谱峰作为共有特征峰，确定共有特征峰的相对保留时间，得到由其共有特征峰构成的活血消痛酊挥发性成分的GC‑MS标准对照特征图谱；将共有对照特征图谱与构建的标准对照特征图谱，利用共有峰进行相似度计算；
4)确定活血消痛酊挥发性成分与药材、原料的相关性：
根据步骤1)活血消痛酊样品取样量，取与处方中等生药量的各单独药材和原料用量，并按照步骤1)方法制备当归、川芎、花椒、胡椒、丁香、肉桂、荜茇、干姜、山奈、红花、大黄11味单味药材和樟脑、冰片、薄荷脑原料的供试品溶液；分别吸取活血消痛酊挥发性成分供试品溶液、各单独药材和原料供试品溶液，采用步骤3)特征图谱建立方法，将活血消痛酊挥发性成分的特征图谱与当归、川芎、花椒、胡椒、丁香、肉桂、荜茇、干姜、山奈、红花、大黄11味单味药材和樟脑、冰片、薄荷脑原料的GC‑MS特征图谱进行比较，对比各色谱峰的相对保留时间，确定共有峰主要来源；
所述的步骤1)、步骤2)中，提取溶剂为石油醚、二甲苯、乙酸乙酯的一种；
所述的步骤3)中，气质色谱仪条件为：以高纯氦为载气，以PEG为固定相，色谱柱为：
Agilent PEG20M毛细管色谱柱30m×320μm，膜厚度0.25μm，气相条件为：进样口温度为220‑
240℃，柱流速为0.6‑1.2ml/min，分流比为2～10:1；质谱条件为：电子轰击离子源；电子能量70eV；离子源温度：230℃；接口温度：220‑250℃；四级杆温度150℃；质量扫描范围m/z30‑
600全扫描；溶质延迟4.6min；后运行在230℃保持10min；调谐文件为标准调谐；
色谱柱程序升温如下：
。
2.根据权利要求1所述的活血消痛酊挥发性成分特征图谱的建立方法，其特征在于，所述的活血消痛酊挥发性成分的GC‑MS标准对照特征图谱是由32个共有峰构成，以对照品对照，2号峰为3‑蒈烯，7号峰为桉油精，17号峰为樟脑，22号峰为反式石竹烯，24号峰为薄荷脑，25号峰为异龙脑，26号峰为龙脑，30号峰为丁香酚，32号峰为对甲氧基肉桂酸乙酯，以薄荷脑为参照物，24号峰为参照峰，该标准对照特征图谱具有32个共有特征峰，与参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±1％之内。
3.根据权利要求2所述的活血消痛酊挥发性成分特征图谱的建立方法，其特征在于，所述的标准对照特征图谱相对保留时间规定值为1号峰0.2710，2号峰0.3756，3号峰0.3820，4号峰0.3884，5号峰0.4001，6号峰0.4158，7号峰0.4244，8号峰0.4382，9号峰0.4525，10号峰
0.4733，11号峰0.4827，12号峰0.5912，13号峰0.6402，14号峰0.6477，15号峰0.6829，16号峰0.7235，17号峰0.7799，18号峰0.8206，19号峰0.8322，20号峰0.8595，21号峰0.8756，22号峰0.8968，23号峰0.9455，24号峰1.0000，25号峰1.0780，26号峰1.1726，27号峰1.1992，
28号峰1.2155，29号峰2.3570，30号峰2.4620，31号峰3.4971，32号峰3.5981。
4.根据权利要求1所述的活血消痛酊挥发性成分特征图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：
取1‑4mL活血消痛酊样品，加入50‑150mL蒸馏水，放入沸石5颗，利用水蒸气蒸馏法提取挥发油，挥发油测定器中加入1‑4mL提取溶剂，提取时间3‑5h，提取后冷却至室温，收集乙酸乙酯层，用无水硫酸钠脱水，并用乙酸乙酯清洗冷凝管、挥发油提取器，洗涤液与上述脱水乙酸乙酯液合并，加乙酸乙酯稀释定容至5‑20mL，摇匀，得活血消痛酊挥发性成分供试品溶液；
2)对照品溶液的制备：
取3‑蒈烯、桉油精、樟脑、反式石竹烯、薄荷脑、异龙脑、龙脑、丁香酚、对甲氧基肉桂酸乙酯对照品，加乙酸乙酯，分别配成浓度为5～10μg/ml、5～10μg/ml、30～50μg/ml、5～10μg/ml、10～30μg/ml、10～20μg/ml、10～20μg/ml、5～10μg/ml、5～10μg/ml的溶液，即得对照品溶液；
3)特征图谱建立与相似度计算：
分别吸取对照品溶液与活血消痛酊挥发性成分供试品溶液各1‑4ul，注入气质色谱仪，以薄荷脑为特征图谱参照物，以薄荷脑色谱峰为参照物峰，测定20批活血消痛酊挥发性成分供试品溶液，记录80分钟色谱图，生成活血消痛酊挥发性成分共有对照特征图谱，以图谱中均存在的色谱峰作为共有特征峰，确定共有特征峰的相对保留时间，得到由其共有特征峰构成的活血消痛酊挥发性成分的GC‑MS标准对照特征图谱；将共有对照特征图谱与构建的标准对照特征图谱，利用共有峰进行相似度计算；
4)确定活血消痛酊挥发性成分与药材、原料的相关性：
根据步骤1)活血消痛酊样品取样量，取与处方中等生药量的各单独药材和原料用量，并按照步骤1)方法制备当归、川芎、花椒、胡椒、丁香、肉桂、荜茇、干姜、山奈、红花、大黄11味单味药材和樟脑、冰片、薄荷脑原料的供试品溶液；分别吸取活血消痛酊挥发性成分供试品溶液、各单独药材和原料供试品溶液，采用步骤3)特征图谱建立方法，将活血消痛酊挥发性成分的特征图谱与当归、川芎、花椒、胡椒、丁香、肉桂、荜茇、干姜、山奈、红花、大黄11味单味药材和樟脑、冰片、薄荷脑原料的GC‑MS特征图谱进行比较，对比各色谱峰的相对保留时间，确定共有峰主要来源。
5.权利要求1‑4任一项所述的活血消痛酊挥发性成分特征图谱的建立方法在活血消痛酊药品质量标准与质量控制中的应用。
说明书 :
一种活血消痛酊挥发性成分特征图谱的建立方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及中成药质量检测技术领域，特别是一种活血消痛酊挥发性成分特征图谱的建立方法及其应用。
背景技术
[0002] 中药质量是保证中药临床应用安全、有效的前提，是发挥药效和治疗作用的关键，随着中药现代化的不断发展，中成药生产和质量水平不断获得进步，但作为基础源头的中药材，其质量深受种质资源、土壤、气候、栽培和加工技术等内外因素影响；另外，中成药的处方药味较多，成分复杂，生产过程中工艺条件或药材质量等因素的波动，会导致成品制剂的质量指标出现波动。
[0003] 中药质量标准化研究一直是实现中医药事业可持续发展的重要一环。目前，中药质量控制体系已经从单一化学评价向以临床疗效为导向的中药整体质量控制转变，但处方中药品标准仍存一定数量的中药饮片质量控制项缺乏或不完善等情况，使其在临床应用中的有效性与安全性难以保障。
[0004] 中药特征图谱是指中药材或中药制剂经适当处理后，采用光谱、波谱、色谱等现代分析技术，检测共有峰图谱，图谱中主要特征峰的相对保留时间或峰面积比值可全面反映所含成分的相对关系。另外，特征图谱具有独特的优势：①、通过特征图谱的特异性，能有效鉴别样品的真伪；②、通过特征图谱主要特征峰的含量或比例的制定，比较样品与标准指纹图谱的相似度，确保样品质量的相对稳定；③、通过对照特征图谱，可追踪工艺过程及最终产品的成分变化；④、检测原药材与最终产品质量的一致性，还可对比不同批次及不同厂家产品。总之，中药特征图谱能从整体方面对中药成分进行量化鉴定，可反映出中药化学成分的种类、数量、相对含量等信息，有助于评价中药材及制剂质量的真实性、稳定性、一致性，加强质量评价的整体效果。
[0005] 基于特征图谱的分析优势，同时结合中药及复方制剂具有“多成分、多靶点”，且化学成分复杂导致药效成分不明确等特点。目前，采用特征图谱对中药化学成分进行表征，可进一步体现中药质量属性。
[0006] 活血消痛酊是中成药酊剂，用于骨性关节炎引起的疼痛，沉困，活动不利等症的辅助治疗。国家药品标准编号为：WS‑5657(B‑0657)‑2014Z，处方包括中药材11种：当归、川芎、花椒、胡椒、丁香、肉桂、荜茇、干姜、山奈、红花、大黄，另外包括冰片、樟脑、薄荷脑三种挥发性添加物。
[0007] 活血消痛酊处方药材的特点是药味较多，处方复杂，挥发性成分含量较高，中药挥发油因其药效快、渗透强等特点，在抗菌、抗炎、抗癌、抗病毒、促进透皮吸收等方面发挥着重要的作用。但是，中药挥发油受药材的入药部位、产地、采收时期、提取工艺波动等多个因素的影响，会导致挥发油品质的不均一，进而影响临床应用效果和用药安全，为确保挥发油质量的稳定均一，必须从药材的入药部位、采收时期、炮制工艺、品种产地、提取技术等多方面因素综合筛选，规范各项操作，并建立起完善的中药挥发油质量标准。
[0008] 目前，GMP的实施可有效保证活血消痛酊药材来源、采收、提取工艺的相对稳定，而质量评价指标相对简单，目前主要包括当归、川芎、大黄、胡椒碱、丁香酚、桂皮醛、冰片、樟脑、薄荷脑薄层色谱鉴别，胡椒碱液相色谱法含量测定。尚有超过半数的中药材在成品中没有进行质量评价，且含量相对较高的药材挥发油类物质未进行统一的评价和表征，未系统解析产品的复杂成分，未体现中药整体性的质量观，现有方法难以从整体方面反映活血消痛酊中挥发油的质量属性，因此，发明一种活血消痛酊挥发性成分特征图谱的建立方法及其应用势在必行。
发明内容
[0009] 针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种活血消痛酊挥发性成分特征图谱的建立方法及其应用，可全面地对活血消痛酊中挥发油的整体质量进行评价，并对活血消痛酊中各单味药材色谱峰进行了归属确证，保证活血消痛酊中有效成分的种类相对稳定，进一步保证药品质量的均一性、稳定性及临床用药的有效性与安全性。
[0010] 本发明解决的技术方案是，该活血消痛酊挥发性成分特征图谱的建立方法，包括以下步骤：
[0011] 1)供试品溶液的制备：
[0012] 取活血消痛酊样品，置烧瓶中，加入蒸馏水及沸石，利用水蒸气蒸馏法提取挥发油，挥发油测定器中加入提取溶剂，提取后冷却至室温，收集提取溶剂层，用无水硫酸钠脱水，并用提取溶剂清洗冷凝管、挥发油提取器，定容，摇匀，得活血消痛酊挥发性成分供试品溶液；
[0013] 2)对照品溶液的制备：
[0014] 取3‑蒈烯、桉油精、樟脑、反式石竹烯、薄荷脑、异龙脑、龙脑、丁香酚、对甲氧基肉桂酸乙酯对照品，用提取溶剂溶解并定容，配成一定浓度溶液，即得对照品溶液；
[0015] 3)特征图谱建立与相似度计算：
[0016] 分别吸取对照品溶液与活血消痛酊挥发性成分供试品溶液，注入气质色谱仪，以薄荷脑为特征图谱参照物，以薄荷脑色谱峰为参照物峰，测定多批活血消痛酊挥发性成分供试品溶液，生成活血消痛酊挥发性成分共有对照特征图谱，以图谱中均存在的色谱峰作为共有特征峰，确定共有特征峰的相对保留时间，得到由其共有特征峰构成的活血消痛酊挥发性成分的GC‑MS标准对照特征图谱；将共有对照特征图谱与构建的标准对照特征图谱，利用共有峰进行相似度计算；
[0017] 4))确定活血消痛酊挥发性成分与药材、原料的相关性：
[0018] 根据步骤1)活血消痛酊样品取样量，取与处方中等生药量的各单独药材和原料用量，并按照步骤1)方法制备当归、川芎、花椒、胡椒、丁香、肉桂、荜茇、干姜、山奈、红花、大黄11味单味药材和樟脑、冰片、薄荷脑原料的供试品溶液；分别吸取活血消痛酊挥发性成分供试品溶液、各单独药材和原料供试品溶液，采用步骤3)特征图谱建立方法，将活血消痛酊挥发性成分的特征图谱与当归、川芎、花椒、胡椒、丁香、肉桂、荜茇、干姜、山奈、红花、大黄11味单味药材和樟脑、冰片、薄荷脑原料的GC‑MS特征图谱进行比较，对比各色谱峰的相对保留时间，确定共有峰主要来源。
[0019] 所述的步骤1)、步骤2)中，提取溶剂为石油醚、二甲苯、乙酸乙酯的一种。
[0020] 所述的步骤3)中，气质色谱仪条件为：以高纯氦为载气，以PEG为固定相，色谱柱为：Agilent PEG20M毛细管色谱柱30m×320μm，膜厚度0.25μm，气相条件为：进样口温度为220‑240℃，柱流速为0.6‑1.2ml/min，分流比为2～10:1；质谱条件为：电子轰击离子源；电子能量70eV；离子源温度：230℃；接口温度：220‑250℃；四级杆温度150℃；质量扫描范围m/z30‑600全扫描；溶质延迟4.6min；后运行在230℃保持10min；调谐文件为标准调谐。
[0021] 所述的活血消痛酊挥发性成分的GC‑MS标准对照特征图谱是由32个共有峰构成，以对照品对照，2号峰为3‑蒈烯，7号峰为桉油精，17号峰为樟脑，22号峰为反式石竹烯，24号峰为薄荷脑，25号峰为异龙脑，26号峰为龙脑，30号峰为丁香酚，32号峰为对甲氧基肉桂酸乙酯，以薄荷脑为参照物，24号峰为参照峰，该标准对照特征图谱具有32个共有特征峰，与参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±1％之内。
[0022] 所述的标准对照特征图谱相对保留时间均值为1号峰0.2710，2号峰0.3756，3号峰0.3820，4号峰0.3884，5号峰0.4001，6号峰0.4158，7号峰0.4244，8号峰0.4382，9号峰
0.4525，10号峰0.4733，11号峰0.4827，12号峰0.5912，13号峰0.6402，14号峰0.6477，15号峰0.6829，16号峰0.7235，17号峰0.7799，18号峰0.8206，19号峰0.8322，20号峰0.8595，21号峰0.8756，22号峰0.8968，23号峰0.9455，24号峰1.0000，25号峰1.0780，26号峰1.1726，
27号峰1.1992，28号峰1.2155，29号峰2.3570，30号峰2.4620，31号峰3.4971，32号峰
3.5981。
0.4525，10号峰0.4733，11号峰0.4827，12号峰0.5912，13号峰0.6402，14号峰0.6477，15号峰0.6829，16号峰0.7235，17号峰0.7799，18号峰0.8206，19号峰0.8322，20号峰0.8595，21号峰0.8756，22号峰0.8968，23号峰0.9455，24号峰1.0000，25号峰1.0780，26号峰1.1726，
27号峰1.1992，28号峰1.2155，29号峰2.3570，30号峰2.4620，31号峰3.4971，32号峰
3.5981。
[0023] 所述的活血消痛酊挥发性成分特征图谱的建立方法在活血消痛酊质量控制中的应用。
[0024] 本发明经方法学验证其精密度、重复性及稳定性好，简便、可行，能快速测定不同指标成分，准确度高，能更好的评价活血消痛酊的质量，是活血消痛酊挥发性成分特征图谱建立方法上的创新。
附图说明
[0025] 图1为本发明活血消痛酊挥发性成分的标准特征图谱。
[0026] 图2为本发明20批次活血消痛酊样品挥发性成分的GC‑MS特征图谱叠加图和对照特征图谱(R)。
[0027] 图3为本发明对照品图谱。
[0028] 图4为本发明对照药材与成品对比色谱图。
[0029] 图5为本发明特征图谱精密度实验图谱。
[0030] 图6为本发明特征图谱稳定性实验图谱。
[0031] 图7为本发明特征图谱重复性实验图谱。
具体实施方式
[0032] 以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
[0033] 实施例1
[0034] 1)供试品溶液的制备：
[0035] 取1‑4mL活血消痛酊样品，加入50‑150mL蒸馏水，放入沸石5颗，利用水蒸气蒸馏法提取挥发油，挥发油测定器中加入1‑4mL提取溶剂，提取时间3‑5h，提取后冷却至室温，收集乙酸乙酯层，用无水硫酸钠脱水，并用乙酸乙酯清洗冷凝管、挥发油提取器，洗涤液与上述脱水乙酸乙酯液合并，加乙酸乙酯稀释定容至5‑20mL，摇匀，得活血消痛酊挥发性成分供试品溶液；
[0036] 2)对照品溶液的制备：
[0037] 取3‑蒈烯、桉油精、樟脑、反式石竹烯、薄荷脑、异龙脑、龙脑、丁香酚、对甲氧基肉桂酸乙酯对照品，加乙酸乙酯，分别配成浓度为5～10μg/ml、5～10μg/ml、30～50μg/ml、5～10μg/ml、10～30μg/ml、10～20μg/ml、10～20μg/ml、5～10μg/ml、5～10μg/ml的溶液，即得对照品溶液；
[0038] 3)特征图谱建立与相似度计算：
[0039] 分别吸取对照品溶液与活血消痛酊挥发性成分供试品溶液各1‑4ul，注入气质色谱仪，以薄荷脑为特征图谱参照物，以薄荷脑色谱峰为参照物峰，测定20批活血消痛酊挥发性成分供试品溶液，记录80分钟色谱图，生成活血消痛酊挥发性成分共有对照特征图谱，以图谱中均存在的色谱峰作为共有特征峰，确定共有特征峰的相对保留时间，得到由其共有特征峰构成的活血消痛酊挥发性成分的GC‑MS标准对照特征图谱；将共有对照特征图谱与构建的标准对照特征图谱，利用共有峰进行相似度计算；
[0040] 4)确定活血消痛酊挥发性成分与药材、原料的相关性：
[0041] 根据步骤1)活血消痛酊样品取样量，取与处方中等生药量的各单独药材和原料用量，并按照步骤1)方法制备当归、川芎、花椒、胡椒、丁香、肉桂、荜茇、干姜、山奈、红花、大黄11味单味药材和樟脑、冰片、薄荷脑原料的供试品溶液；分别吸取活血消痛酊挥发性成分供试品溶液、各单独药材和原料供试品溶液，采用步骤3)特征图谱建立方法，将活血消痛酊挥发性成分的特征图谱与当归、川芎、花椒、胡椒、丁香、肉桂、荜茇、干姜、山奈、红花、大黄11味单味药材和樟脑、冰片、薄荷脑原料的GC‑MS特征图谱进行比较，对比各色谱峰的相对保留时间，确定共有峰主要来源。
[0042] 所述的步骤3)中，色谱柱的固定相以PEG为固定相，更优选的，所述色谱柱为：AgilentPEG20M毛细管色谱柱(30m×320μm，膜厚度0.25μm)。
[0043] 所述的步骤3)中，气相条件为：进样口温度为220‑240℃，柱流速为0.6‑1.2ml/min，分流比为2～10:1，色谱柱程序升温见表1：
[0044] 表1 程序升温顺序
[0045]
[0046] 更优选的，气相条件为：进样口温度为230℃，柱流速为0.8ml/min，分流比为5:1，色谱柱程序升温见表2：
[0047] 表2 程序升温顺序
[0048]
[0049] 所述的步骤3)中，质谱条件为：电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；离子源温度：230℃；接口温度：220‑250℃；四级杆温度150℃；质量扫描范围m/z(30‑600)全扫描；溶质延迟(4.6min)；后运行在230℃保持10min；调谐文件为标准调谐。
[0050] 更优选的质谱条件为：电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；离子源温度：230℃；接口温度：230℃；四级杆温度150℃；质量扫描范围m/z(30‑600)全扫描；溶质延迟(4.6min)；后运行在230℃保持10min；调谐文件为标准调谐。
[0051] 所述的步骤3)中，气相色谱理论板数按薄荷脑峰计算≥5000。
[0052] 取活血消痛酊样品20批次，按上述步骤1)制备供试品溶液，按照步骤3)色谱条件测定，得到20批次样品的色谱图，分别导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)》进行特征图谱分析，以任意样品的色谱图为参照图谱，采用中位数法，设置时间窗宽度为0.1min，进行多点校正和色谱峰匹配，经全峰匹配后得到活血消痛酊挥发性成分的叠加特征图谱和对照特征图谱(R)，结果显示，20批活血消痛酊挥发性成分均有32个共有峰，按出峰时间依次标记为1～32号峰。详见图2。将采用上述活血消痛酊特征图谱建立方法获得的活血消痛酊挥发性成分的特征图谱与构建的标准特征图谱，利用共有峰进行相似度计算，见表3：
[0053] 表3 20批活血消痛酊特征图谱相似度计算结果
[0054]
[0055] 结果表明，各批次活血消痛酊峰群的整体图貌基本一致，确定了32个共有峰，相似度均在0.9以上。
[0056] 优选地，步骤3)中，在活血消痛酊挥发性成分特征图谱中，以24号薄荷脑峰为参照峰S，计算32个共有色谱峰保留时间与同一图谱中S峰的保留时间比值，得到的相对保留时间比值见表4：
[0057] 表4 活血消痛酊特征图谱共有峰相对保留时间(n＝20)
[0058]
[0059]
[0060] 优选地，步骤3)中，本发明测得的活血消痛酊挥发性成分特征图谱与活血消痛酊挥发性成分标准特征图谱的相似度≥0.9。
[0061] 优选地，步骤3)中，将待测活血消痛酊挥发性成分的色谱图与建立的标准特征图谱比对，若待测活血消痛酊的色谱图中出现标准特征图谱中相同的32个特征峰，以参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，待测样品各特征峰的相对保留时间与标准特征图谱中各特征峰的相对保留时间的相对偏差在±1％以内，规定活血消痛酊的质量合格，反之则不合格。
[0062] 优选地，步骤3)中，所述的活血消痛酊挥发性成分标准特征图谱与对照品溶液的特征图谱进行比较，定位确定所述2号峰为3‑蒈烯，7号峰为桉油精，17号峰为樟脑，22号峰为反式石竹烯，24号峰为薄荷脑，25号峰为异龙脑，26号峰为龙脑，30号峰为丁香酚，32号峰为对甲氧基肉桂酸乙酯。对照品图谱见图3。
[0063] 优选地，步骤4)中，特征图谱共有峰与各单味药材的相关性见表5，图4。
[0064] 表5 制剂与药材、原料的相关性
[0065]
[0066] 实施例2
[0067] 本发明在具体实施时，包括以下步骤：
[0068] 1)供试品溶液的制备：精密量取活血消痛酊样品3ml，置250ml圆底烧瓶中，加入蒸馏水100ml，并放入沸石5颗，照挥发油测定法(中国药典2020年版四部通则2204)试验，自测定器上端加水使充满刻度部分，并溢流入烧瓶为止，再加乙酸乙酯2ml，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸4小时，放冷，分取乙酸乙酯液，通过铺有适量无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置10ml量瓶中，用乙酸乙酯适量依次洗涤冷凝管、挥发油测定器、漏斗，洗涤液与上述乙酸乙酯液合并，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，滤过，吸取续滤液1μl，得活血消痛酊挥发性成分供试品溶液，按处方用量，根据供试品取样量，计算处方中对应的各单独药材的用量，按照供试品溶液制备方法，制备各单独药材和原料挥发油供试品溶液。
[0069] 2)对照品溶液的制备：取3‑蒈烯、桉油精、樟脑、反式石竹烯、薄荷脑、异龙脑、龙脑、丁香酚、对甲氧基肉桂酸乙酯对照品适量，精密称定，加乙酸乙酯制成每1ml分别含3‑蒈烯、桉油精、樟脑、反式石竹烯、薄荷脑、异龙脑、龙脑、丁香酚、对甲氧基肉桂酸乙酯8.12、8.48、40.20、8.32、20.52、12.24、12.16、8.24、8.16μg/ml的溶液，即得对照品溶液；
[0070] 3)特征图谱建立与相似度计算：
[0071] 色谱条件与系统适用性试验：
[0072] 气相色谱条件：HP‑INNOWAX色谱柱(30m×0.25mm,0.25μm)；载气为高纯氦气(纯‑1度：99.999％)；柱温为程序升温：初始温度50℃，保持2min，以10℃/min 升至125℃,保持‑1 ‑1 ‑1
10min，以1℃/min 升至135℃,保持2min，以2℃/min 升至160℃,保持4min，以2℃/min 升至199℃,保持25min；进样口温度230℃；进样量1μL；柱流量0.8ml/min；分流比为5:1，理论塔板数按薄荷脑峰计不低于5000；
10min，以1℃/min 升至135℃,保持2min，以2℃/min 升至160℃,保持4min，以2℃/min 升至199℃,保持25min；进样口温度230℃；进样量1μL；柱流量0.8ml/min；分流比为5:1，理论塔板数按薄荷脑峰计不低于5000；
[0073] 质谱条件为：电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；离子源温度：230℃；接口温度：230℃；四级杆温度150℃；质量扫描范围m/z(30‑600)全扫描；溶质延迟(4.6min)；后运行在
230℃保持10min；调谐文件为标准调谐。
230℃保持10min；调谐文件为标准调谐。
[0074] 分别精密吸取对照品溶液与活血消痛酊挥发性成分供试品各1μl，注入气质色谱仪，测定，记录80分钟色谱图，测定20批活血消痛酊供试品的特征图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的活血消痛酊挥发性成分的GC‑MS标准对照特征图谱；该活血消痛酊的GC‑MS标准对照特征图谱是由32个共有峰构成，以对照品对照，2号峰为3‑蒈烯，7号峰为桉油精，17号峰为樟脑，22号峰为反式石竹烯，24号峰为薄荷脑，25号峰为异龙脑，26号峰为龙脑，30号峰为丁香酚，32号峰为对甲氧基肉桂酸乙酯。以薄荷脑为参照物，24号峰(S)为参照峰，该标准对照特征图谱具有32个共有特征峰，以参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±1％之内，规定值见表6：
[0075] 表6 活血消痛酊特征图谱相对保留时间规定值
[0076]
[0077] 4)确定活血消痛酊挥发性成分与药材、原料的相关性：
[0078] 分别取当归126mg、川芎63mg、山奈63mg、肉桂63mg、丁香9mg、花椒90mg、干姜63mg、胡椒63mg、毕拔63mg、大黄63mg、红花63mg、薄荷脑原料63mg、冰片原料39mg、樟脑原料150mg，按照步骤1)供试品溶液制备方法，制备各单独药材和原料的供试品溶液；分别吸取活血消痛酊挥发性成分供试品溶液、各单独药材和原料供试品溶液，采用步骤3)特征图谱建立方法，将活血消痛酊挥发性成分的特征图谱与当归、川芎、花椒、胡椒、丁香、肉桂、荜茇、干姜、山奈、红花、大黄11味单味药材和樟脑、冰片、薄荷脑原料的GC‑MS特征图谱进行比较，对比各色谱峰的相对保留时间，确定共有峰主要来源，结果与表5相同。
[0079] 精密度试验：取同一批活血消痛酊供试品溶液，按上述色谱质谱条件，连续进样6次，检测特征图谱，记录各共有峰保留时间及峰面积，以薄荷脑色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于3.0％，将6次进样图谱导入国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)软件进行处理，与对照图谱相似度均＞0.9，表明精密度良好。
[0080] 稳定性试验：取同一批活血消痛酊供试品溶液，按上述色谱质谱条件，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，检测特征图谱，记录各共有峰保留时间及峰面积，以薄荷脑色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于3.0％，将6次进样图谱导入国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)软件进行处理，与对照图谱相似度均＞0.9，表明供试品溶液在24小时内稳定；
[0081] 重复性试验：取同一批活血消痛酊，分别取6份，按供试品溶液的制备方法和上述色谱质谱条件，分别检测特征图谱，记录各共有峰保留时间及峰面积，以薄荷脑色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于3.0％，将6次进样图谱导入国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)软件进行处理，与对照图谱相似度均＞0.9，表明重复性良好。
[0082] 上述的活血消痛酊挥发性成分特征图谱的构建方法，构建得到的活血消痛酊挥发性成分GC‑MS标准对照特征图谱在活血消痛酊药品质量标准与质量控制中的应用；采用该构建得到的GC‑MS标准对照特征图谱对活血消痛酊进行检测，按照上述的活血消痛酊GC‑MS特征图谱的构建方法中所述的步骤和条件，分别精密吸取参照品溶液与供试品溶液各1μl，注入气质色谱，测定，记录80分钟色谱图，供试品特征图谱中应呈现32个特征峰，以参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在活血消痛酊的GC‑MS标准对照特征图谱规定值的±1％之内。
[0083] 本发明经方法学验证其精密度、重复性及稳定性好，简便、可行，能快速测定不同指标成分，准确度高，能更好的评价活血消痛酊的质量，具体试验资料如下：
[0084] 1、主要仪器
[0085] 7820A‑5977B气相色谱质谱联用仪(美国Agilent)，MassHunter工作站，NIST17.0标准质谱检索库；XPE105十万分之一电子天平(d＝0.01mg)(瑞士梅特勒‑托利多公司)；相对密度<1.0的挥发油测定器24/29标口塞(北京北玻博美玻璃有限公司，规格：5mL)；
[0086] 2、试药与试剂
[0087] 樟脑对照品(批号：110747‑201008，纯度：99.0％，中国食品药品检定研究院)；薄荷脑对照品(批号：110728‑200506，供含量测定用，中国食品药品检定研究院)；龙脑对照品(批号：110881‑201709，中国食品药品检定研究院，含量：99.6％)；异龙脑对照品(批号：110512‑201904，中国食品药品检定研究院，含量：98.4％)丁香酚(批号：110725‑201917，中国食品药品检定研究院，纯度：99.1％)、对甲氧基肉桂酸乙酯(批号：110835‑202005，中国食品药品检定研究院，纯度：99.4％)、反式石竹烯(批号：110835‑202005，中国食品药品检定研究院，纯度：99.4％)、3‑蒈烯(批号：110835‑202005，中国食品药品检定研究院，纯度：
99.4％)，桉油精(批号：110788‑202108，中国食品药品检定研究院，纯度：99.4％)纯化水(批号：202108056214HN，来源：杭州娃哈哈集团有限公司)，乙酸乙酯(批号：20220220，来源：天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯)萘(批号：111673‑201905，中国食品药品检定研究院，纯度：100％)。
99.4％)，桉油精(批号：110788‑202108，中国食品药品检定研究院，纯度：99.4％)纯化水(批号：202108056214HN，来源：杭州娃哈哈集团有限公司)，乙酸乙酯(批号：20220220，来源：天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯)萘(批号：111673‑201905，中国食品药品检定研究院，纯度：100％)。
[0088] 药品：活血消痛酊(河南羚锐制药股份有限公司，批号：190801、190802、190803、190804、190805；201102、201103、201105、201107、201108；210105、210106、210107、210108、
210109；220601、220602、220603、220604、220605；编号为S1～S20)；当归对照药材(批号：
120927‑202118)、川芎对照药材(批号：120927‑202118)、红花对照药材(批号：120907‑
201713)、山柰对照药材(批号：121504‑201203)、花椒对照药材(批号：121106‑201906)、胡椒对照药材(批号：121441‑201902)、
210109；220601、220602、220603、220604、220605；编号为S1～S20)；当归对照药材(批号：
120927‑202118)、川芎对照药材(批号：120927‑202118)、红花对照药材(批号：120907‑
201713)、山柰对照药材(批号：121504‑201203)、花椒对照药材(批号：121106‑201906)、胡椒对照药材(批号：121441‑201902)、
[0089] 荜茇对照药材(批号：121023‑201103)、干姜对照药材(批号：120942‑201911)、丁香对照药材(批号：121039‑201906)、肉桂对照药材(批号：121363‑202104)、大黄对照药材(批号：120984‑201202)均购自中国食品药品中国食品药品检定研究院；樟脑原料(批号：C01‑2021‑0724，江苏嘉福制药有限公司)、
[0090] 冰片原料(批号：BP2201006，梧州黄埔化工药业有限公司)、薄荷脑原料(批号：210909，安徽恒达药业有限公司。
[0091] 3、分析软件：中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版(国家药典委员会)。
[0092] 4、活血消痛酊特征图谱试验条件选择
[0093] 4.1、提取溶剂种类选择
[0094] 除提取溶剂种类条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。取批号为220601批的活血消痛酊，精密量取活血消痛酊样品3ml，置250ml圆底烧瓶中，加入蒸馏水
100ml，并放入沸石5颗，照挥发油测定法(中国药典2020年版四部通则2204)试验。自测定器上端加水使充满刻度部分，并溢流入烧瓶为止，分别考察加入石油醚(60‑90)、二甲苯、乙酸乙酯各2ml，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸4小时，放冷，分取提取液，通过铺有适量无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置10ml量瓶中，用各提取液适量依次洗涤冷凝管、挥发油测定器、漏斗，洗涤液与上述提取液液合并，加各提取液稀释至刻度，摇匀，滤过，吸取续滤液1μl，注入气相色谱仪，测定。以可识别色谱峰个数、色谱峰峰型、色谱峰分离情况、单位体积供试品色谱峰峰面积为评价指标进行分析，试验结果表明，石油醚(60‑90)，二甲苯提取的样品在樟脑、冰片、薄荷脑、丁香酚、对甲氧基肉桂酸乙酯的单位体积供试品色谱峰峰面积较乙酸乙酯提取的样品小，色谱峰识别个数以乙酸乙酯最多，因此，优选乙酸乙酯为提取溶剂。
100ml，并放入沸石5颗，照挥发油测定法(中国药典2020年版四部通则2204)试验。自测定器上端加水使充满刻度部分，并溢流入烧瓶为止，分别考察加入石油醚(60‑90)、二甲苯、乙酸乙酯各2ml，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸4小时，放冷，分取提取液，通过铺有适量无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置10ml量瓶中，用各提取液适量依次洗涤冷凝管、挥发油测定器、漏斗，洗涤液与上述提取液液合并，加各提取液稀释至刻度，摇匀，滤过，吸取续滤液1μl，注入气相色谱仪，测定。以可识别色谱峰个数、色谱峰峰型、色谱峰分离情况、单位体积供试品色谱峰峰面积为评价指标进行分析，试验结果表明，石油醚(60‑90)，二甲苯提取的样品在樟脑、冰片、薄荷脑、丁香酚、对甲氧基肉桂酸乙酯的单位体积供试品色谱峰峰面积较乙酸乙酯提取的样品小，色谱峰识别个数以乙酸乙酯最多，因此，优选乙酸乙酯为提取溶剂。
[0095] 4.2、提取溶剂用量的选择
[0096] 除提取溶剂用量条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。取批号为220601批的活血消痛酊，精密量取活血消痛酊样品3ml，置250ml圆底烧瓶中，加入蒸馏水
100ml，并放入沸石5颗，照挥发油测定法(中国药典2020年版四部通则2204)试验。自测定器上端加水使充满刻度部分，并溢流入烧瓶为止，再分别加入乙酸乙酯用量为1ml、2ml、3ml、
4ml，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸4小时，放冷，分取提取液，通过铺有适量无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置10ml量瓶中，用乙酸乙酯适量依次洗涤冷凝管、挥发油测定器、漏斗，洗涤液与上述提取液液合并，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，滤过，吸取续滤液1μl，注入气相色谱仪，测定。以可识别色谱峰个数、色谱峰峰型、色谱峰分离情况、单位体积供试品色谱峰峰面积为评价指标进行分析，试验结果表明，乙酸乙酯用量从1ml增加至2ml，可识别色谱峰个数、单位体积供试品色谱峰峰面积逐渐增加，乙酸乙酯用量增加至3ml、4ml，可识别色谱峰个数、单位体积供试品色谱峰峰面积无明显增加，因此，优选乙酸乙酯为提取溶剂用量为2ml。
100ml，并放入沸石5颗，照挥发油测定法(中国药典2020年版四部通则2204)试验。自测定器上端加水使充满刻度部分，并溢流入烧瓶为止，再分别加入乙酸乙酯用量为1ml、2ml、3ml、
4ml，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸4小时，放冷，分取提取液，通过铺有适量无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置10ml量瓶中，用乙酸乙酯适量依次洗涤冷凝管、挥发油测定器、漏斗，洗涤液与上述提取液液合并，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，滤过，吸取续滤液1μl，注入气相色谱仪，测定。以可识别色谱峰个数、色谱峰峰型、色谱峰分离情况、单位体积供试品色谱峰峰面积为评价指标进行分析，试验结果表明，乙酸乙酯用量从1ml增加至2ml，可识别色谱峰个数、单位体积供试品色谱峰峰面积逐渐增加，乙酸乙酯用量增加至3ml、4ml，可识别色谱峰个数、单位体积供试品色谱峰峰面积无明显增加，因此，优选乙酸乙酯为提取溶剂用量为2ml。
[0097] 4.3、提取物用量的考察
[0098] 除提取物用量条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。取批号为220601批的活血消痛酊，精密量取活血消痛酊样品1ml、3ml、5ml、7ml、9ml、11ml、13ml，置
250ml圆底烧瓶中，加入蒸馏水100ml，并放入沸石5颗，照挥发油测定法(中国药典2020年版四部通则2204)试验。自测定器上端加水使充满刻度部分，并溢流入烧瓶为止，再分别加入乙酸乙酯2ml，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸4小时，放冷，分取提取液，通过铺有适量无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置10ml量瓶中，用乙酸乙酯适量依次洗涤冷凝管、挥发油测定器、漏斗，洗涤液与上述提取液液合并，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，滤过，吸取续滤液1μl，注入气相色谱仪，测定。以可识别色谱峰个数、色谱峰峰型、色谱峰分离情况、单位体积供试品色谱峰峰面积为评价指标进行分析，试验结果表明，活血消痛酊样品用量1ml时，可识别色谱峰个数偏少，活血消痛酊样品用量3ml、5ml、7ml、9ml、11ml、13ml时，可识别色谱峰个数较多且无差别，但13ml时，15‑18分钟的色谱峰出现重叠现象，不能完全分离，因此，从节约样品和环保角度，优选活血消痛酊样品用量3ml即可。
250ml圆底烧瓶中，加入蒸馏水100ml，并放入沸石5颗，照挥发油测定法(中国药典2020年版四部通则2204)试验。自测定器上端加水使充满刻度部分，并溢流入烧瓶为止，再分别加入乙酸乙酯2ml，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸4小时，放冷，分取提取液，通过铺有适量无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置10ml量瓶中，用乙酸乙酯适量依次洗涤冷凝管、挥发油测定器、漏斗，洗涤液与上述提取液液合并，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，滤过，吸取续滤液1μl，注入气相色谱仪，测定。以可识别色谱峰个数、色谱峰峰型、色谱峰分离情况、单位体积供试品色谱峰峰面积为评价指标进行分析，试验结果表明，活血消痛酊样品用量1ml时，可识别色谱峰个数偏少，活血消痛酊样品用量3ml、5ml、7ml、9ml、11ml、13ml时，可识别色谱峰个数较多且无差别，但13ml时，15‑18分钟的色谱峰出现重叠现象，不能完全分离，因此，从节约样品和环保角度，优选活血消痛酊样品用量3ml即可。
[0099] 4.4、提取时间考察
[0100] 除提取时间条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同，取批号为220601批的活血消痛酊，精密量取活血消痛酊样品3ml，置250ml圆底烧瓶中，加入蒸馏水100ml，并放入沸石5颗，照挥发油测定法(中国药典2020年版四部通则2204)试验。自测定器上端加水使充满刻度部分，并溢流入烧瓶为止，再分别加入乙酸乙酯2ml，连接回流冷凝管，加热至沸腾，分别保持微沸2、4、6、8h，放冷，分取提取液，通过铺有适量无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置10ml量瓶中，用乙酸乙酯适量依次洗涤冷凝管、挥发油测定器、漏斗，洗涤液与上述提取液液合并，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，滤过，吸取续滤液1μl，注入气相色谱仪，测定。以可识别色谱峰个数、色谱峰峰型、色谱峰分离情况、单位体积供试品色谱峰峰面积为评价指标进行分析，试验结果表明，提取时间2h时，可识别色谱峰个数较少，单位体积供试品色谱峰峰面积较小，提取时间4、6、8h时，可识别色谱峰个数多且基本一致，单位体积供试品色谱峰峰面积较高且无明显差别，因此，优选提取时间为4h。
[0101] 4.5、程序升温的考察
[0102] 除程序升温条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。取批号为220601批的活血消痛酊，精密量取活血消痛酊样品3ml，置250ml圆底烧瓶中，加入蒸馏水100ml，并放入沸石5颗，照挥发油测定法(中国药典2020年版四部通则2204)试验。自测定器上端加水使充满刻度部分，并溢流入烧瓶为止，再分别加入乙酸乙酯2ml，连接回流冷凝管，加热至沸腾，保持微沸4h，放冷，分取提取液，通过铺有适量无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置10ml量瓶中，用乙酸乙酯适量依次洗涤冷凝管、挥发油测定器、漏斗，洗涤液与上述提取液液合并，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，滤过，吸取续滤液1μl，注入气质色谱仪，其中气相色谱条件：HP‑INNOWAX色谱柱(30m×0.25mm,0.25μm)；载气为高纯氦气；柱温为程序升温，方法如表7‑
9，进样量1μL；柱流量0.8ml/min；分流比为5:1，理论塔板数按薄荷脑峰计不低于5000；
9，进样量1μL；柱流量0.8ml/min；分流比为5:1，理论塔板数按薄荷脑峰计不低于5000；
[0103] 质谱条件为：电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；离子源温度：230℃；接口温度：230℃；四级杆温度150℃；质量扫描范围m/z(30‑600)全扫描；溶质延迟(4.6min)；后运行在
230℃保持10min；调谐文件为标准调谐。
230℃保持10min；调谐文件为标准调谐。
[0104] 表7 程序升温方法1
[0105]
[0106] 表8 程序升温方法2
[0107]
[0108] 表9 程序升温方法3
[0109]
[0110] 以可识别色谱峰个数、色谱峰峰型、色谱峰分离情况、单位体积供试品色谱峰峰面积为评价指标进行分析，试验结果表明，程序升温方法1中，前15分钟色谱峰分离效果不好，峰2与峰3有重叠，程序升温方法3中，13号色谱峰识别不准确。因此，优选程序升温方法2。
[0111] 4.6、参照物的选择
[0112] 在实验所建立的特征图谱中，薄荷脑的色谱峰分离良好，具有较大的峰面积、适中的保留时间且为所有样品共有，因此，选择薄荷脑为参照峰。
[0113] 5、活血消痛酊挥发性成分特征图谱的建立
[0114] 5.1、色谱条件与系统适用性试验：
[0115] 气相色谱条件：HP‑INNOWAX色谱柱(30m×0.25mm,0.25μm)；载气为高纯氦气；柱温‑1 ‑1为程序升温：初始温度50℃，保持2min，以10℃/min 升至125℃,保持10min，以1℃/min 升‑1 ‑1
至135℃,保持2min，以2℃/min 升至160℃,保持4min，以2℃/min 升至199℃,保持25min；
进样口温度230℃；柱流量0.8ml/min；分流比为5:1，理论塔板数按薄荷脑峰计不低于5000；
至135℃,保持2min，以2℃/min 升至160℃,保持4min，以2℃/min 升至199℃,保持25min；
进样口温度230℃；柱流量0.8ml/min；分流比为5:1，理论塔板数按薄荷脑峰计不低于5000；
[0116] 质谱条件为：电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；离子源温度：230℃；接口温度：230℃；四级杆温度150℃；质量扫描范围m/z(30‑600)全扫描；溶质延迟(4.6min)；后运行在
230℃保持10min；调谐文件为标准调谐。
230℃保持10min；调谐文件为标准调谐。
[0117] 5.2、对照品溶液的制备：取3‑蒈烯、桉油精、樟脑、反式石竹烯、薄荷脑、异龙脑、龙脑、丁香酚、对甲氧基肉桂酸乙酯对照品适量，精密称定，加乙酸乙酯制成每1ml分别含3‑蒈烯、桉油精、樟脑、反式石竹烯、薄荷脑、异龙脑、龙脑、丁香酚、对甲氧基肉桂酸乙酯的浓度分别为：8.12、8.48、40.20、8.32、20.52、12.24、12.16、8.24、8.16μg/ml。
[0118] 5.3、供试品溶液的制备：精密量取活血消痛酊样品3ml，置250ml圆底烧瓶中，加入蒸馏水100ml，并放入沸石5颗，照挥发油测定法(中国药典2020年版四部通则2204)试验。自测定器上端加水使充满刻度部分，并溢流入烧瓶为止，再加乙酸乙酯2ml，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸4小时，放冷，分取乙酸乙酯液，通过铺有适量无水硫酸钠的漏斗滤过，滤液置10ml量瓶中，用乙酸乙酯适量依次洗涤冷凝管、挥发油测定器、漏斗，洗涤液与上述乙酸乙酯液合并，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，滤过，吸取续滤液1μl，注入气相色谱仪，测定，即得。
[0119] 5.4、药材、原料溶液的制备:按处方用量，根据供试品取样量，计算处方中对应的各单独药材和原料的用量，分别取当归126mg，川芎63mg，山奈，肉桂63mg，丁香9mg，90mg，干姜63mg，胡椒63mg，毕拔63mg，大黄63mg，红花63mg，薄荷脑原料63mg，冰片原料39mg，樟脑原料150mg，按照供试品溶液制备方法，制备各单独药材和原料的挥发油提取溶液。
[0120] 5.5、测定法：分别精密吸取对照品溶液，药材、原料溶液，供试品溶液各1μl，注入气质色谱，测定，记录80分钟色谱图，即得。
[0121] 5.6、方法学考察
[0122] 5.6.1、精密度试验
[0123] 按“5.3”项下制备同一批活血消痛酊(批号220601)供试品溶液，按“5.1”项下色谱质谱条件，连续进样6次，检测特征图谱，如图5，记录各共有峰保留时间及峰面积，以薄荷脑色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于3％，用相似度评价软件计算各色谱峰特征图谱的相似度均大于0.99，仪器稳定，精密度良好，结果见表10、表11、表12。
[0124] 表10 活血消痛酊(220601)精密度试验结果(指标成分群相对保留时间)
[0125]
[0126]
[0127] 表11 活血消痛酊(220601)精密度试验结果(指标成分群相对峰面积)
[0128]
[0129] 表12 活血消痛酊(220601)精密度试验图谱相似度计算结果
[0130]
[0131] 5.6.2、稳定性试验
[0132] 按“5.3”项下制备同一批活血消痛酊(批号220601)供试品溶液，按“5.1”项下色谱质谱条件，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，检测特征图谱，如图6，记录各共有峰保留时间及峰面积，以薄荷脑色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于3.0％，用相似度评价软件计算各色谱峰特征图谱的相似度均大于0.99，供试品溶液在24小时内稳定。提示供试品稳定性良好，结果见表13、表14、表15。
[0133] 表13 活血消痛酊(220601)稳定性试验结果(指标成分群相对保留时间)
[0134]
[0135]
[0136] 表14 活血消痛酊(220601)稳定性试验结果(指标成分群相对峰面积)
[0137]
[0138]
[0139] 表15 活血消痛酊(220601)稳定性试验图谱相似度计算结果
[0140]
[0141] 5.6.3、重复性试验
[0142] 取活血消痛酊同一批样品(220601)，按“5.3”供试品溶液的制备项下方法分别制备6份，在“5.1”项下色谱质谱条件下依次进样，分别检测特征图谱，如图7，记录各共有峰保留时间及峰面积，以薄荷脑色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于3.0％，用相似度评价软件计算各色谱峰特征图谱的相似度均大于0.99，提示该实验方法重复性良好，结果见表16、表17、表18。
[0143] 表16 活血消痛酊(220601)重复性试验结果(指标成分群相对保留时间)
[0144]
[0145]
[0146] 表17 活血消痛酊(220601)重复性试验结果(指标成分群相对峰面积)
[0147]
[0148] 表18 活血消痛酊(220601)重复性试验图谱相似度计算结果
[0149]
[0150] 5.6.4、对照指纹图谱的建立
[0151] 建立活血消痛酊中挥发性成分的特征图谱：取20批活血消痛酊样品(批号：190801、190802、190803、190804、190805；201102、201103、201105、201107、201108；210105、
210106、210107、210108、210109；220601、220602、220603、220604、220605)，按“5.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取1uL，分别注入气质色谱仪，在“5.1”项下色谱质谱条件下进样分析，根据所得色谱图中各色谱峰的相对保留时间，确定共有峰，并选取其中32个共有峰作为特征峰建立对照特征图谱；其中以24号峰为参照峰S，计算各色谱峰保留时间与同一图谱中S峰的保留时间比值，得到的相对保留时间比值如表19：
210106、210107、210108、210109；220601、220602、220603、220604、220605)，按“5.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取1uL，分别注入气质色谱仪，在“5.1”项下色谱质谱条件下进样分析，根据所得色谱图中各色谱峰的相对保留时间，确定共有峰，并选取其中32个共有峰作为特征峰建立对照特征图谱；其中以24号峰为参照峰S，计算各色谱峰保留时间与同一图谱中S峰的保留时间比值，得到的相对保留时间比值如表19：
[0152] 表19 特征图谱相对保留时间
[0153]
[0154] 5.6.5、指纹图谱共有峰的指认
[0155] 使用GC‑MS技术，通过NIST17.0数据库进行检索，对活血消痛酊中挥发性成分的对照特征图谱共有峰进行指认，结合对照品比对，定位确定所述2号峰为3‑蒈烯，7号峰为桉油精，17号峰为樟脑，22号峰为反式石竹烯，24号峰为薄荷脑，25号峰为异龙脑，26号峰为龙脑，30号峰为丁香酚，32号峰为对甲氧基肉桂酸乙酯。
[0156] 5.6.6、确定制剂与药材、原料的相关性：
[0157] 分别吸取活血消痛酊供试品溶液及与制剂等生药量的各单味药材、原料药供试品溶液，采用上述活血消痛酊特征图谱检测方法，将活血消痛酊中挥发性成分的特征图谱(参见图1)与当归、川芎、花椒、胡椒、丁香、肉桂、荜茇、干姜、山奈、红花、大黄11味单味药材及樟脑、冰片、薄荷脑原料的GC‑MS特征图谱(参见图4)进行比较，对比各色谱峰的相对保留时间，确定共有峰主要来源。见表20。
[0158] 表20 制剂与药材、原料相关性
[0159]
[0160] 5.6.7、不同批号样品特征图谱比较
[0161] 取20个不同批号的活血消痛酊，分别按“5.3”供试品溶液的制备项下方法制备，进样，检测特征图谱，以薄荷脑色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，见表21。
[0162] 比较20批供试品色谱图，各批次活血消痛酊的32个共有指纹特征峰峰面积之和均占其总峰面积的95％以上，见表22。
[0163] 表21‑1 20批活血消痛酊样品共有峰相对保留时间
[0164]
[0165]
[0166] 表21‑2 20批活血消痛酊样品共有峰相对保留时间
[0167]
[0168] 表21‑3 20批活血消痛酊样品共有峰相对峰面积
[0169]
[0170]
[0171] 表21‑4 20批活血消痛酊样品共有峰相对峰面积
[0172]
[0173] 表22 20批活血消痛酊样品共有峰峰面积占比
[0174]
[0175]
[0176] 由上述结果显示，各批次样品特征峰的相对保留时间RSD小于0.20％，说明特征峰出峰时间相对稳定；而相对峰面积RSD结果显示，各批次特征峰的峰面积差异较大，反映了不同批次成品中同一成分的差异性，这些成分的源头是处方中的药材和原料药品，由药材传递至成品中的挥发性成分相对峰面积差异均较大，说明药材质量的均一稳定性有待进一步提高。
[0177] 提高中药制剂的均一稳定性，需要不断提高并稳定药材的质量，从源头提高并不断规范药材种植技术，才能最终获得中药制剂的稳定。
[0178] 5.6.8、相似度分析
[0179] 将在拟定色谱条件下记录的20批制剂色谱图转换成数值数据导出后，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件2012版(国家药典委员会)进行数据导入、匹配、校正(参见图2)，生成能够综合反映所有样品特征信息的对照特征图谱即活血消痛酊的GC‑MS标准对照特征图谱(如图1所示)。通过与对照特征图谱比较，计算各批次制剂相似度，见表27。
[0180] 表23 20批活血消痛酊特征图谱相似度计算结果
[0181]
[0182] 本实验对活血消痛酊进行了特征图谱研究，并采用相似度软件对色谱峰数据进行评价，建立了活血消痛酊的GC‑MS标准对照特征图谱，结果表明，各批次制剂峰群的整体图貌基本一致，确定了20个共有峰，相似度均在0.9以上。
[0183] 5.6.9、相对保留时间规定值
[0184] 取20批活血消痛酊特征图谱，以薄荷脑色谱峰的保留时间为参照，计算各共有峰相对保留时间及RSD，计算20批次各共有峰的相对保留时间的RSD在0.5％以内(参见表21)，[0185] 待测样品各特征峰的相对保留时间与标准特征图谱中各特征峰的相对保留时间(参见表24)的相对偏差范围见表25。
[0186] 根据表25，暂时规定活血消痛酊待测样品各特征峰的相对保留时间与标准特征图谱中各特征峰的相对保留时间的相对偏差在±1％以内，规定活血消痛酊的质量合格，反之则不合格。
[0187] 表24 活血消痛酊标准特征图谱相对保留时间
[0188]
[0189] 表25 20批次活血消痛酊共有峰与标准图谱对应峰相对保留时间偏差范围[0190]
[0191] 根据以上结果，暂定标准特征图谱相对保留时间规定值为：
[0192] 规定值为0.2710(峰1)，0.3756(峰2)，0.3820(峰3)，0.3884(峰S)，0.4001峰5)，0.4158(峰6)，0.4244(峰7)，0.4382(峰8)，0.4525(峰9)，0.4733(峰10)，0.4827(峰11)，
0.5912(峰12)，0.6402(峰13)，0.6477(峰14)，0.6829(峰15)，0.7235(峰16)，0.7799(峰
17)，0.8206(峰18)，0.8322(峰19)，0.8595(峰20)，0.8756(峰21)，0.8968(峰22)，0.9455(峰23)，1.0000(峰24)，1.0780(峰35)，1.1726(峰26)，1.1992(峰27)，1.2155(峰28)，
2.3570(峰29)，2.4620(峰30)，3.4971(峰31)，3.5981(峰32)。供试品特征图谱中应有32个特征峰，与参照物薄荷脑相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±1％之内。
0.5912(峰12)，0.6402(峰13)，0.6477(峰14)，0.6829(峰15)，0.7235(峰16)，0.7799(峰
17)，0.8206(峰18)，0.8322(峰19)，0.8595(峰20)，0.8756(峰21)，0.8968(峰22)，0.9455(峰23)，1.0000(峰24)，1.0780(峰35)，1.1726(峰26)，1.1992(峰27)，1.2155(峰28)，
2.3570(峰29)，2.4620(峰30)，3.4971(峰31)，3.5981(峰32)。供试品特征图谱中应有32个特征峰，与参照物薄荷脑相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±1％之内。
[0193] 3结论
[0194] 实验以薄荷脑峰为参照，通过方法学研究以及20批样品测定，建立活血消痛酊的特征图谱，即由32个共有峰构成的活血消痛酊的GC‑MS标准对照特征图谱，其中S峰为薄荷脑，2号峰为3‑蒈烯，7号峰为桉油精，17号峰为樟脑，22号峰为反式石竹烯，24号峰为薄荷脑，25号峰为异龙脑，26号峰为龙脑，30号峰为丁香酚，32号峰为对甲氧基肉桂酸乙酯，试验证明特征图谱特征性强，方法可行，可用于产品的质量控制，从而提升活血消痛酊的质量控制标准，为药品标准提升与规范化生产提供理论依据与技术保障。
[0195] 本发明提供的一种活血消痛酊中挥发性成分特征图谱，充分体现活血消痛酊中挥发性成分特征，将挥发性特征图谱作为一个整体看待，既避免了只测少量成分出现的产品整体质量判定的片面性，又减少人为干扰某一指标的可能性，有利于全面控制活血消痛酊的产品质量，同时节约了检测时间和检测成本。
[0196] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。