一种缩短红掌组织培养周期的方法

摘要

本发明公开了一种缩短红掌组织培养周期的方法，属于植物组织培养技术领域。培养方法为：步骤1，将初代培养后的红掌愈伤组织接种到增殖生根联合培养基，所述增殖生根联合培养基包括植物生长调节物质6‑BA、TDZ、NAA；步骤2，接种起至第3天或第4天，温度20±1℃，暗培养；接种第4天起或第5天起至第24天或第25天，温度为25±1℃，光照强度为2000LUX；第25天起或第26天起至第40天，温度为28±1℃，光照为5000～7000LUX，得到生根幼苗。本发明通过培养基中植物生长调节物质配比结合梯度式光照和温度培养，提升了幼苗质量和移栽成活率，切实缩短了红掌组织培养的周期。

权利要求

1.一种缩短红掌组织培养周期的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，将初代培养后的红掌愈伤组织接种到增殖生根联合培养基，所述增殖生根联合培养基以1/2MS培养基为基本培养基，添加：6‑苄氨基嘌呤：0.3mg/L、苯基噻二唑基脲：

0.2mg/L、萘乙酸：0.5 mg/L、琼脂粉：4.5g/L、蔗糖：20g/L；

步骤2，温度和光照培养：第一阶段，接种起至第3天或第4天，温度20±1℃，暗培养；第二阶段，接种第4天起或第5天起至第24天或第25天，温度为25±1℃，光照强度为2000LUX；

第三阶段，第25天起或第26天起至第40天，温度为28±1℃，光照为5000 7000LUX，得到生根~幼苗。

2.根据权利要求1所述的缩短红掌组织培养周期的方法，其特征在于，所述增殖生根联合培养基pH为5.8 6.0。

~

3.根据权利要求1所述的缩短红掌组织培养周期的方法，其特征在于，步骤1的初代培养的培养基以1/2MS培养基为基本培养基，添加：6‑苄氨基嘌呤：0.5mg/L、苯基噻二唑基脲：

1.0mg/L、琼脂粉：4.5g/L、蔗糖：30 g/L，椰子汁：5%，pH：5.8 6.0。

~

4.根据权利要求3所述的缩短红掌组织培养周期的方法，其特征在于，步骤1的初代培养的培养温度为25±1℃，光照强度为2000LUX，光照时间为12h/d，培养时间为25天。

5.根据权利要求1所述的缩短红掌组织培养周期的方法，其特征在于，步骤1中是将初代培养后的红掌愈伤组织切为1.0cm×1.0cm的小块，切面朝下，接种到增殖生根联合培养基上。

6.根据权利要求1所述的缩短红掌组织培养周期的方法，其特征在于，步骤2中第二阶段和第三阶段的光照时间为14h/d。

说明书

一种缩短红掌组织培养周期的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种缩短红掌组织培养周期的方法。

背景技术

[0002] 植物组织培养是指在无菌条件下利用人工培养基对植物组织或器官的培养，使其再生完整植株。用于组织培养的植物组织或者器官称为外植体。植物组织培养的理论依据是植物细胞全能性理论。完整的植物组织培养流程包括：初代培养，增殖培养和生根培养。根据植物品种的不同，每个培养阶段耗时约20‑40天。目前，培养周期长是红掌组织培养工厂化繁殖的瓶颈之一，缩短组培苗工厂化生产的周期是降低成本、提高经济效益的有效手段。

发明内容

[0003] 为解决上述现有技术中红掌组织培养周期长的技术问题，本发明提供一种缩短红掌组织培养周期的方法。

[0004] 为达到上述目的，本发明的技术方案提供一种缩短红掌组织培养周期的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，将初代培养后的红掌愈伤组织接种到增殖生根联合培养基，所述增殖生根联合培养基中包括植物生长调节物质6‑苄氨基嘌呤(6‑BA)、苯基噻二唑基脲(TDZ)、萘乙酸(NAA)；步骤2，第一阶段，接种起至第3天或第4天，温度20±1℃，暗培养；第二阶段，接种第4天或第5天起至第24天或第25天，温度为25±1℃，光照强度为2000LUX；
第三阶段，第25天或第26天起至第40天，温度为28±1℃，光照为5000～7000LUX，得到生根幼苗。

[0005] 进一步地，所述增殖生根联合培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：6‑BA：0.3mg/L、TDZ：0.2mg/L、NAA：0.5mg/L。

[0006] 进一步地，所述增殖生根联合培养基还包括：琼脂粉：4.5g/L、蔗糖：20g/L。

[0007] 进一步地，所述增殖生根联合培养基pH为5.8～6.0。

[0008] 进一步地，所述步骤1的初代培养的培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：6‑BA：0.5mg/L、TDZ：1.0mg/L、琼脂粉：4.5g/L、蔗糖：30g/L、椰子汁：5％，pH为5.8～6.0。

[0009] 进一步地，所述步骤1的初代培养的培养温度为25±1℃，光照强度为2000LUX，光照时间为12h/d，培养时间为25天。

[0010] 进一步地，步骤1中是将红掌愈伤组织切为1.0cm×1.0cm的小块，切面朝下，接种到增殖生根联合培养基上。

[0011] 进一步地，步骤2中第二阶段和第三阶段的光照时间为14h/d。

[0012] 有益效果

[0013] (1)设计同一培养基的增殖和生根联合培养中各植物生长物质的最优配置，再配合梯度式的光照和温度培养，进一步提升幼苗质量和移栽成活率，切实缩短红掌组织培养的周期，对比试验表明本发明的红掌愈伤组织生长良好，红掌组培苗可以不经过单独的生根培养阶段，直接进入移栽环节，缩短培养周期20‑40天，从根本上降低了工厂化生产的成本、提高了经济效益。

[0014] (2)采用高光照和高温培养来缩短培养周期，红掌愈伤组织可能会失活以及增殖能力下降。本发明采用梯度式光照和温度，在第三阶段使用温度28±1℃，光照5000～7000LUX瓶内炼苗，并未加重愈伤组织褐变，也未造成愈伤组织失活，推断是本发明的增殖生根联合培养基中物质配比起到了作用，尤其是TDZ为0.2mg/L维持了原有愈伤组织的活性，并刺激新的愈伤组织产生。将TDZ引入红掌增殖生根培养中，在确保了愈伤组织活性的基础之上，实现了红掌组培苗在同一培养基中的增殖和生根联合培养。

附图说明

[0015] 图1是本发明实施例1的生根幼苗图；

[0016] 图2是本发明对比例1的生根幼苗图。

具体实施方式

[0017] TDZ具有极强的细胞分裂活性，细胞分化活性相对较低，因此常用于植物愈伤组织的诱导，一般不用于增殖和生根培养。本发明中将TDZ引入红掌增殖和生根培养中，在确保愈伤组织活性的基础之上，实现了红掌组培苗在同一培养基中的增殖和生根联合培养。鉴于增殖和生根同瓶培养效果，为进一步提升幼苗质量和移栽成活率，切实缩短红掌组织培养的周期，结合大田炼苗启示，将红掌大田炼苗的试验条件引入到组培苗中，确定梯度式光照和温度培养。

[0018] 本发明的增殖生根联合培养基包括植物生长调节物质6‑BA、TDZ、NAA，增殖生根培养基还包括以1/2MS培养基为基本培养基，其中，琼脂粉：4.5g/L、蔗糖：20g/L，pH：5.8‑6.0。本发明进行最佳植物生长物质配置试验，植物生长调节物质6‑BA、TDZ、NAA的9种不同配置如表1所示，标记为T1至T9。

[0019] 表1增殖生根联合培养基中植物生长调节物质配置

[0020]

[0021]

[0022] 试验具体步骤为：在超净工作台上，以30天左右叶龄的红掌健壮叶柄为外植体，消毒处理后对其进行初代培养，在初代培养中，初代培养的培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括6‑BA：0.5mg/L、TDZ：1.0mg/L、琼脂粉：4.5g/L、蔗糖：30g/L、椰子汁：5％，pH：5.8‑6.0；培养温度为25℃，光照强度为2000LUX，光照时间为12h/d，培养时间为25天；在超净工作台上，将初代培养后的红掌愈伤组织切为约1.0cm×1.0cm小块，切面朝下，分别接种到不同的增殖生根联合培养基上，采用培养温度为25℃，光照强度为2000LUX，光照时间为14h/d，每一种增殖生根联合培养基处理接种外植体100个，重复3次，接种40d统计每100块外植体中生根幼苗的平均数量和愈伤组织体积增量并记录愈伤组织及幼苗生长状态，结果如表
2所示。

[0023] 愈伤组织体积增量是培养40天愈伤组织体积减去接种时愈伤组织体积。愈伤组织体积的测试方法是在超净工作台上，用排水法测量每100块外植体的体积增量，取多次试验的平均值。

[0024] 表2不同增殖生根联合培养基上生根幼苗数量及生长状态

[0025]

[0026] 注：Duncan's显著性检验，不同字母表示在0.01水平下差异显著。

[0027] 根据表2的试验结果可知：不同植物生长物质配置对红掌愈伤组织及幼苗的生长发育有着极其显著的影响，且在不同植物生长物质配置的培养基上愈伤组织及幼苗的生长状态有很大差异。

[0028] 从生根幼苗数量分析：T1至T9的各个处理中，随着植物生长调节物质配置的变化，生根幼苗的数量总体呈现先上升后下降的变化趋势，且各处理之间差异极显著；各处理中T1处理生根幼苗数量最低，T5处理生根幼苗数量高达152.68株，是T1处理的12.39倍，与其它各处理相比较T5有明显的生根优势。

[0029] 从愈伤组织体积增量及生长状态分析：T1至T9的各个处理中，随着TDZ浓度的升高，愈伤组织增量呈现显著上升趋势，这说明本试验中TDZ是影响愈伤组织增量的主要因3
素；各处理中，T1处理愈伤组织的体积增量最低，仅为21.41cm ，T9处理愈伤组织体积增量
3
最高，达214.73cm ，是T1处理的10.03倍，但T9处理中愈伤组织松散、玻璃化、再生和生根能力较低，生根幼苗数量仅为16.43株；T8处理中愈伤组织体积增量具有明显优势，但愈伤组织较松散、玻璃化，不利于幼苗再生和生根；T6处理中愈伤组织体积增量较高，但是生根幼苗数量较低，仅为65.33株；在T5处理中，愈伤组织呈现黄绿色、生长速度适中且相对致密，具有较高的再生能力，该种愈伤组织活力强、再生的幼苗叶片平滑、植株性状优良，符合正常组培苗特征；

[0030] 综合考虑愈伤组织和外植体生长状态及生根幼苗数量，本发明确定T5处理即6‑BA：0.3mg/L、TDZ：0.2mg/L、NAA：0.5mg/L的植物生长调节物质配置。

[0031] 实施例1

[0032] 缩短红掌组织培养周期的方法：步骤1，在超净工作台上，将初代培养25天的红掌愈伤组织切为约1.0cm×1.0cm小块，切面朝下，接种到增殖生根联合培养基上，增殖生根联合培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括6‑BA：0.3mg/L、TDZ：0.2mg/L、NAA：0.5mg/L、琼脂粉：4.5g/L、蔗糖：20g/L，pH：5.8‑6.0；步骤2，接种起至第3天，温度20±1℃，暗培养；接种第4天起至第25天，温度25℃，光照2000LUX，光照时间14h/d；接种第26天起至第40天，温度28℃，光照6000LUX，光照时间14h/d。在初代培养中，在超净工作台上，以30天左右叶龄的红掌健壮叶柄为外植体，消毒处理后对其进行初代培养，初代培养的培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括6‑BA：0.5mg/L、TDZ：1.0mg/L、琼脂粉：4.5g/L、蔗糖：30g/L、椰子汁：5％，pH：5.8‑6.0；培养温度为25℃，光照强度为2000LUX，光照时间为12h/d，培养时间为25天。

[0033] 每处理接种外植体100个，重复3次。

[0034] 实施例2

[0035] 与实施例1相同，区别在于：步骤2，接种起至第3天，温度20±1℃，暗培养；接种第4天起至第25天，温度24℃，光照2000LUX，光照时间14h/d；接种第26天起至第40天，温度27℃，光照7000LUX，光照时间14h/d。

[0036] 每处理接种外植体100个，重复3次。

[0037] 实施例3

[0038] 与实施例1相同，区别在于：步骤2，接种起至第4天，温度20±1℃，暗培养；接种第5天起至第24天，温度26℃，光照2000LUX，光照时间14h/d；接种第25天起至第40天，温度29℃，光照5000LUX，光照时间14h/d。

[0039] 每处理接种外植体100个，重复3次。

[0040] 对比例1

[0041] 与实施例1相同，区别在于：步骤2，接种起至第40天，培养温度为25℃，光照强度为2000LUX，光照时间为14h/d。

[0042] 对实施例1‑3和对比例1分别统计每100块外植体中生根幼苗的平均数量和愈伤组织体积增量并记录愈伤组织及幼苗生长状态，结果如表3所示。

[0043] 表3不同光照和温度下生根幼苗数量及生长状态

[0044]

[0045] 根据表3的试验结果可知：实施例1‑3表明红掌组培苗的生长发育对温度和光照的反应较敏感，合理的温度、光照可以显著促进红掌幼苗生根，实施例1的生根幼苗如图1所示。本发明条件下，红掌幼苗在培养第25天前后，单株叶片可达2‑3片，已具备较好的光合自养条件，适合进行瓶内炼苗。对比例1的生根幼苗如图2所示，愈伤组织有少量褐变。

[0046] 在接种40天后，实施例1处理生根幼苗数量是对比例1的1.36倍，愈伤组织切口处无褐变现象产生，幼苗叶片圆润、浓绿、平滑，植株健壮，已经具备大田苗特征，达到移栽需3
求，且该处理中愈伤组织体积增量达119.57cm ，基本无褐变，表明本发明使用温度28℃，光照6000LUX瓶内炼苗，并未加重愈伤组织褐变，也未造成愈伤组织失活；实施例2处理愈伤组织基本无褐变现象，黄绿色、致密、体积膨大，幼苗叶片浓绿，植株健壮，根系数量多，具有明显大田苗特征，虽有少部分幼苗叶片有烧尖现象，基本可满足增殖生根需求；实施例3处理也愈伤组织基本无褐变现象，黄绿色、致密，体积膨大，根系数量较多，幼苗叶片圆润、较绿，基本具备大田苗特征。

[0047] 因此，第一阶段，接种起至第3天或第4天，温度20±1℃，暗培养；第二阶段，接种第4天起或第5天起至第24天或第25天，温度为25±1℃，光照强度为2000LUX；第三阶段，第25天起或第26天起至第40天，温度为28±1℃，光照为5000～7000LUX，温度和光照培养的梯度式培养条件可显著提高红掌增殖生根联合培养的效率。