一种CAR-NK细胞及其制备方法

摘要

本发明涉及医药领域，特别是涉及一种CAR‑NK细胞及其制备方法，将包含编码CAR的核酸构建体感染培养了5~8天的NK细胞，感染后继续培养获得CAR‑NK细胞；所述NK细胞通过下述方法获得：将待扩增的NK细胞接种至已包被抗CD16抗体和抗NKp46抗体的细胞培养容器中培养即获得所述NK细胞，所述抗NKp46抗体的包被浓度为5μg/ml~15μg/ml。本发明的CAR‑NK细胞制备方法安全性高、NK细胞纯度高、扩增倍数高、CAR阳性率显著增加，大大降低成本，NK细胞所含的比例均达到98%以上，CAR阳性率提高2‑3倍，NK活化比例达到85%以上。

权利要求

1.一种NK细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：将待扩增的NK细胞接种至已用抗CD16抗体和抗NKp46抗体包被液包被的细胞培养容器中培养，NK细胞的培养条件为35~37℃、4.5~5.5% CO2、静置培养，所述抗CD16抗体包被液的浓度为1μg/ml~15μg/ml，所述抗NKp46抗体包被液的浓度为5μg/ml 15μg/ml，NK细胞的培养基中添加IL‑2、IL‑~

15、IL‑18、IL‑21、IFN‑γ细胞因子，以细胞培养基的总体积为基准，所述IL‑2的浓度为100‑

500 IU/ml，所述IL‑15的浓度为50‑150 IU/ml，所述IL‑18的浓度为1‑10 ng/ml，所述IL‑21的浓度为0.5‑5 ng/ml，所述IFN‑γ的浓度为1‑5 ng/ml。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞培养容器选自TC处理的细胞培养容器。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞培养基中还包括血清替代物，和/或，培养期间补加细胞培养基。

4.一种CAR‑NK细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将包含编码CAR的核酸构建体感染培养了5 8天的权利要求1‑3任一所述的制备方法获得的NK细胞，感~染后继续培养获得CAR‑NK细胞，感染后培养所用的培养基为感染培养基，感染培养基中添加IL‑2、IL‑15、IL‑18、IL‑21、IFN‑γ、P188，以细胞培养基的总体积为基准，所述IL‑2的浓度为100‑500 IU/ml，所述IL‑15的浓度为50‑150 IU/ml，所述IL‑18的浓度为1‑10 ng/ml，所述IL‑21的浓度为0.5‑5 ng/ml，所述IFN‑γ的浓度为1‑5 ng/ml。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，还包括如下特征中的一项或多项：

1）所述包含编码CAR的核酸构建体选自慢病毒、腺相关病毒或腺病毒中的任一种或多种；

2）感染时添加病毒感染增强剂。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，还包括如下特征中的一项或多项：

1）所述感染培养基中还包括血清替代物；

2）感染后培养7 10天；

~

3）培养期间补加感染培养基。

说明书

一种CAR‑NK细胞及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医药领域，特别是涉及一种CAR‑NK细胞及其制备方法。

背景技术

[0002] NK细胞是一类对肿瘤细胞具有强力杀伤作用且MHC非依赖的淋巴细胞，其对肿瘤细胞的识别主要依赖于其表面活化性受体和抑制性受体的相互交叉调控。当识别肿瘤细胞之后，NK细胞通过释放杀伤介质穿孔素和颗粒酶使靶细胞凋亡、表达膜TNF家族分子诱导靶细胞凋亡和抗体依赖的细胞毒作用等多种途径杀伤肿瘤细胞。通过CAR修饰NK细胞有望增强其靶向杀伤肿瘤细胞的能力并研制出具有强大抗肿瘤作用的效应细胞。

[0003] 目前，针对NK的扩增培养主要有两种方式：1）采用滋养层细胞进行NK细胞的扩增培养，扩增倍数高，但具有风险性；2）采用纯因子方式进行NK细胞扩增培养，安全性高但扩增倍数远不及滋养层培养方法。而且常规的慢病毒转导方式获得的转导效率不高。

发明内容

[0004] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种CAR‑NK细胞及其制备方法，用于解决现有技术中的问题。

[0005] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种NK细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将待扩增的NK细胞接种至已用抗CD16抗体和抗NKp46抗体包被液包被的细胞培养容器中培养，所述抗NKp46抗体包被液的浓度为5μg/ml 15μg/ml。~

[0006] 本发明还提供所述制备方法获得的NK细胞。

[0007] 本发明还提供一种CAR‑NK细胞的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将包含编码CAR的核酸构建体感染培养了5 8天的所述NK细胞，感染后继续培养获得CAR‑NK细胞。~

[0008] 本发明还提供抗NKp46抗体在扩增NK细胞或CAR‑NK细胞中的用途。

[0009] 如上所述，本发明的CAR‑NK细胞及其制备方法，具有以下有益效果：CAR‑NK细胞制备及扩增方法安全性高、NK细胞纯度高、扩增倍数高、CAR阳性率显著增加，大大降低成本，NK细胞所含的比例均达到98%以上，CAR阳性率提高2‑3倍，NK活化比例达到85%以上，该方法简单、高效、有利于规模化生产。

附图说明

[0010] 图1显示为本发明的总细胞扩增倍数，图中MockNK为未转导慢病毒的NK细胞。

[0011] 图2显示为本发明的NK细胞扩增倍数。

[0012] 图3显示分别为CAR‑NK组流式检测NK细胞纯度和各组NK细胞纯度统计柱状图。

[0013] 图4显示为分别为CAR‑NK组、对照组2和对照组3细胞的CAR阳性率。

[0014] 图5显示为NK细胞表面活化标志CD16。

[0015] 图6显示为细胞表面活化标志NKG2D。

[0016] 图7 显示为CAR‑NK细胞与K562细胞共培养后IL‑2分泌检测结果；

[0017] 图8 显示为CAR‑NK细胞对K562的杀伤检测结果。

具体实施方式

[0018] 本发明提供一种NK细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将待扩增的NK细胞接种至已用抗CD16抗体和抗NKp46抗体包被液包被的细胞培养容器中培养，所述抗NKp46抗体包被液的浓度为5μg/ml 15μg/ml。~

[0019] 待扩增的NK细胞可以是从PBMC中分选获得的原代NK细胞，还可以是传代NK细胞。在一种实施方式中，为采用CD3磁珠阴选获得的原代NK细胞。

[0020] 在一种实施方式中，所述抗CD16抗体包被液的浓度为1μg/ml 15μg/ml。所述抗~NKp46抗体包被液或抗CD16抗体包被液的溶剂为DPBS。

[0021] 在一种实施方式中，所述抗CD16抗体或抗NKp46抗体的包被方法为：将含抗CD16抗体和/或抗NKp46抗体的包被液铺至细胞培养容器的底面，2‑8℃孵育6 20小时，或30 37℃~ ~孵育1.5 2h。
~

[0022] 在一种实施方式中，将包被后的细胞培养容器洗涤后再接种NK细胞。洗涤例如可以用PBS洗涤或生理盐水洗涤。洗涤次数一般是1 3次。~

[0023] 在一种实施方式中，所述细胞培养容器选自TC处理的细胞培养容器。

[0024] NK细胞的培养条件为35~37℃、4.5~5.5% CO2、静置培养。

[0025] 在一种实施方式中，NK细胞的培养基中包括IL‑2、IL‑15、IL‑18、IL‑21、IFN‑γ中的任一种多种细胞因子。所述细胞因子可以刺激诱导NK细胞扩增。

[0026] 以细胞培养基的总体积为基准，所述IL‑2的浓度为100‑500 IU/ml。所述IL‑2的浓度选自以下中的任一浓度：100 200 IU/ml、200 300 IU/ml、300 400 IU/ml或400 500 IU/~ ~ ~ ~ml。

[0027] 以细胞培养基的总体积为基准，所述IL‑15的浓度为50‑150 IU/ml。所述IL‑15的浓度选自以下中的任一浓度：50 70 IU/ml、70 90 IU/ml、90 110 IU/ml、110 130 IU/ml或~ ~ ~ ~130 150 IU/ml。
~

[0028] 以细胞培养基的总体积为基准，所述IL‑18的浓度为1‑10ng/ml。所述IL‑18的浓度选自以下中的任一浓度：1 3 ng/ml、3 5ng/ml、5 7ng/ml或7 10ng/ml。~ ~ ~ ~

[0029] 以细胞培养基的总体积为基准，所述IL‑21的浓度为0.5‑5 ng/ml。所述IL‑21的浓度选自以下中的任一浓度：0.5 1 ng/ml、1 2ng/ml、2 3 ng/ml、3 4ng/ml或4 5 ng/ml。~ ~ ~ ~ ~

[0030] 以细胞培养基的总体积为基准，所述IFN‑γ的浓度为1‑5 ng/ml。所述IFN‑γ的浓度选自以下中的任一浓度：1 2ng /ml、2 3ng /ml、3 4ng/ml或4 5 ng/ml。~ ~ ~ ~

[0031] 所述细胞培养基中还包括血清替代物SR，以细胞培养基的总体积为基准，所述血清替代物的体积分数为5%‑10%。优选的，所述血清替代物的体积分数例如为：5 6%、6 7%、7~ ~ ~8%、8 9%、9 10%。
~ ~

[0032] 在一种实施方式中，培养期间补加细胞培养基。

[0033] 本发明还提供所述制备方法获得的NK细胞。

[0034] 本发明还提供一种CAR‑NK细胞的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将包含编码CAR的核酸构建体感染培养了5 8天的所述NK细胞，感染后继续培养获得CAR‑NK细胞。~

[0035] 在一种实施方式中，所述包含编码CAR的核酸构建体选自慢病毒、腺相关病毒或腺病毒中的任一种或多种。

[0036] 在一种实施方式中，感染时添加病毒感染增强剂。

[0037] 所述病毒感染增强剂可以是现有技术中常规的病毒感染增强剂，例如miltenyi 货号为130‑111‑163的试剂。

[0038] 所述病毒感染增强剂的使用终浓度为5‑10μg/ml。

[0039] 所述NK细胞为培养了5 6天、6 7天或7 8天的细胞。~ ~ ~

[0040] 在一种实施方式中，感染后培养所用的培养基为感染培养基，感染培养基中包括IL‑2、IL‑15、IL‑18、IL‑21、IFN‑γ、P188中的任一种多种。

[0041] 以细胞培养基的总体积为基准，所述IL‑2的浓度为100‑500 IU/ml。所述IL‑2的浓度选自以下中的任一浓度：100 200 IU/ml、200 300 IU/ml、300 400 IU/ml或400 500 IU/~ ~ ~ ~ml。

[0042] 以细胞培养基的总体积为基准，所述IL‑15的浓度为50‑150 IU/ml。所述IL‑15的浓度选自以下中的任一浓度：50 70 IU/ml、70 90 IU/ml、90 110 IU/ml、110 130 IU/ml或~ ~ ~ ~130 150 IU/ml。
~

[0043] 以细胞培养基的总体积为基准，所述IL‑18的浓度为1‑10ng/ml。所述IL‑18的浓度选自以下中的任一浓度：1 3ng/ml、3 5 ng/ml、5 7 ng/mll或7 10ng/ml。~ ~ ~ ~

[0044] 以细胞培养基的总体积为基准，所述IL‑21的浓度为0.5‑5 ng/ml。所述IL‑21的浓度选自以下中的任一浓度：0.5 1 ng/ml、1 2ng/ml、2 3 ng/ml、3 4 ng/ml或4 5ng/ml。~ ~ ~ ~ ~

[0045] 以细胞培养基的总体积为基准，所述IFN‑γ的浓度为1‑5 ng/ml。所述IFN‑γ的浓度选自以下中的任一浓度：1 2ng /ml、2 3ng /ml、3 4ng/ml或4 5 ng/ml。~ ~ ~ ~

[0046] 以细胞培养基的总体积为基准，所述P188的浓度为1%‑5%（体积分数）。所述P188的浓度选自以下中的任一体积分数：1 2%、2 3%、3 4%或4 5 %。~ ~ ~ ~

[0047] 所述感染培养基中还包括血清替代物SR，以感染培养基的总体积为基准，所述血清替代物的体积分数为5%‑10%。优选的，所述血清替代物的体积分数例如为：5 6%、6 7%、7~ ~ ~8%、8 9%、9 10%。
~ ~

[0048] 在一种实施方式中，感染后培养7 10天。~

[0049] 在一种实施方式中，培养期间补加感染培养基。每2 3天补加一次。补加时间本领~域技术人员可以根据经验判断。

[0050] 本发明还提供所述制备方法获得的CAR‑NK细胞。

[0051] 本发明还提供所述CAR‑NK细胞在制备治疗疾病产品中的用途。

[0052] 在一种实施方式中，所述治疗疾病产品选自肿瘤。

[0053] 本发明还提供抗NKp46抗体在扩增NK细胞或CAR‑NK细胞中的用途。

[0054] 所述NKp46即NK细胞蛋白46。

[0055] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

[0056] 在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

[0057] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

[0058] 实施例中大致方法如下：首先通过培养瓶包被抗NKp46抗体孵育，对NK细胞起到了活化刺激作用，扩增能力强，经过5‑8天的培养，扩增可达5‑10倍，在进行慢病毒转导后，添加的促转导剂显著提高了CAR阳性率，添加的细胞因子显著提高了NK细胞转导后的活率，经过7‑10天的继续培养后即获得CAR‑NK细胞。

[0059] 实施例1

[0060] 本实施例采用健康供者来源的冻存PBMC（外周血单个核细胞）进行CAR‑NK细胞的制备，具体涉及PBMC复苏与包被、NK细胞分选，NK细胞培养、慢病毒转导、扩增培养、收获细胞和检测等几个步骤，具体如下：

[0061] 1）PBMC复苏：取健康供者来源的冻存PBMC，于37℃水浴复苏后，加入5‑10倍体积的预热完全培养基1（200IU/ml IL‑2、150IU/ml IL‑15、5ng/ml IL‑18、3ng/ml IL‑21、3ng/ml IFN‑γ）清洗PBMC，400g、10min离心后弃上清。根据计数结果补加完全培养基1调整到密度6
为（2 4）×10个/mL，将PBMC接种于培养瓶中，并放入37℃培养箱中过夜培养。
~

[0062] 2）培养板包被：用含有6μg/ml 抗CD16抗体（北京同立海源生物，货号：GMP‑TL201）和10μg/ml 抗NKp46抗体（R&D公司，货号：MAB1850‑SP）包被液铺满TC处理的培养瓶中，置于4℃冰箱，孵育过夜，或37℃孵育2h；包被完成后吸弃包被液，并用PBS洗涤2次，备用，4℃活化过夜。

[0063] 3） PBMC接种培养并分选NK细胞

[0064] 取出过夜培养的PBMC，400g、10min离心后弃上清，再以预热的完全培养基1重悬后均匀后取样进行AO/PI计数，根据计数结果取样送检CD3/56，剩余细胞采用CD3磁珠阴选出6
NK细胞，调整细胞密度为（2~4）×10 个/mL，加入到包被的培养瓶中，于37℃、5% CO2培养箱进行静置培养，每2‑3天进行补液。同时取部分细胞直接接种于未包被的培养瓶中作为对照组1。

[0065] 4） 慢病毒转导

[0066] 取培养至7天的NK细胞进行慢病毒转导，慢病毒CAR为anti CD19 CAR，序列和制备方法与申请号为CN201910625785.4的国内专利相同。加入对应量的慢病毒，并加入Vectofusin‑1（10μg/ml，厂家：miltenyi，货号为130‑111‑163），同时设Mock NK组（不加慢病毒）、对照组2（不加Vectofusin‑1）和对照组3（第5天转导），以预热完全培养基2(200IU/ml IL‑2、150IU/ml IL‑15、5ng/ml IL‑18、3ng/ml IL‑21、3ng/ml IFN‑γ, 5% P188)调整6
细胞密度为（1 2）×10cells/mL，1000g、离心30 min，升速3，降速3。离心结束后放于37℃、~
5%CO2培养箱培养进行静置病毒感染。

[0067] 5）病毒稀释及补液

[0068] 病毒感染12‑24 h后，按照1:1添加新鲜的完全培养基1，于37℃、5% CO2培养箱培养。

[0069] 6）细胞补液培养

[0070] 取细胞进行计数，根据计数结果，将细胞调（1 2）×106cells/mL的密度，于37℃、~5% CO2培养箱培养，每2‑3天进行细胞补液培养。

[0071] 7）细胞收获

[0072] CAR‑NK细胞培养至16天后进行收获，并送检流式检测CD3/CD56、CD16、NKG2D等。

[0073] 8）流式结果：

[0074] 如图1至图6，按照本发明方法培养的CAR‑NK细胞，总细胞和NK细胞扩增倍数分别达到1500倍和3000倍，纯度达到99%以上，CAR阳性率相比对照组2和3高2倍以上，NK激活标志的表达如CD16和NKG2D均达到90%以上。对照组1、2和3的总细胞和NK细胞扩增倍数分别为500‑1000倍，纯度分别为90.34%、98.28%和92.21%。

[0075] 实施例2 CAR‑NK细胞对K562的杀伤检测

[0076] 1）取靶细胞K562细胞悬液100μl，按照“靶细胞自发释放组”（即靶细胞单独培养的体系，检测时不进行裂解，仅检测其自发释放的LDH）、“最大释放组”（即对单独培养的靶细胞进行全部裂解后检测其释放LDH的组）和“杀伤效应组”（即效靶细胞共孵育组）分组，加入至96孔圆底板中，每组设置3个平行孔。

[0077] 2）分别取效应细胞CAR‑NK和Mock NK细胞100μl，分别加至“杀伤效应组”对应的96孔圆底板孔中，每组设置3个平行孔，混匀，效靶比为5:1，同时设置“效应细胞自发释放组”，即仅加入效应细胞，检测时不进行裂解，仅检测其自发释放的LDH。

[0078] 3) 分别向“自发释放组”、“最大释放组”及“杀伤效应组”加入100μl培养基，使最终体积为200μl。

[0079] 4）将培养平板置于37±1℃,5±0.5%的CO2培养箱培养，约16小时后将“最大释放组”进行裂解检测，在492nm的波长处测定OD值。终止反应10min内完成上机检测[0080] 5）计算公式：

[0081] 杀伤率%=（杀伤效应组‑靶细胞自发释放组‑效应细胞自发释放组）/（最大释放组‑靶细胞自发释放组）

[0082] 6）结果

[0083] CAR‑NK和Mock NK细胞采用LDH释放法测得最终杀伤效率分别为82.56%和18.11%，可以得出结论，本发明方法培养得到的CAR‑NK细胞对靶细胞具有较强的杀伤效应。

[0084] 实施例3 CAR‑NK细胞与K562细胞共培养后IL‑2分泌检测

[0085] 具体步骤见实施例2中的1）‑3）

[0086] 1）将培养平板置于37±1℃,5±0.5%的CO2培养箱培养约16小时后，取杀伤效应组（共孵育）和效应细胞自发释放组（自孵育）上清进行IL‑2因子分泌检测，检测方法采用IL‑2因子检测试剂盒进行检测。

[0087] 2）结果

[0088] 自孵育与共孵育组IL‑2的分泌量分别为2487.54 pg/ml和6267.89pg/ml，可以得出结论，本发明的方法培养得到的CAR‑NK细胞在与靶细胞进行共孵育后能够促进其释放IL‑2等杀伤性验证因子。

[0089] 以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。