本发明提出了对HEK293细胞进行悬浮培养的方法及其培养基，所述培养基包括DMEM/F12培养基和添加剂。利用本发明的方法可以高效地培养HEK293细胞，细胞活率高，同时能够在多项指标上获得比血清培养更优异的表现，尤其可以适用于转染、蛋白表达等领域。
1.一种用于悬浮培养HEK293细胞的培养基，其特征在于，由下列构成：DMEM/F12培养基；
291.55mg/L的L‑盐酸精氨酸；终浓度为531.258mg/L的L‑门冬酰胺；终浓度为
822.045mg/L的L‑天门冬氨酸；终浓度为256.5468806mg/L的L‑半胱氨酸盐酸盐一水合物；
终浓度为3.29mg/L的L‑胱氨酸二盐酸盐；终浓度为169.155mg/L的L‑谷氨酸；终浓度为
481.136328mg/L的L‑谷氨酰胺；终浓度为213.1518717mg/L的L‑盐酸组氨酸一水合物；终浓度为50.4mg/L的L‑羟脯氨酸；终浓度为423.8181818mg/L的L‑异亮氨酸；终浓度为
613.8987522mg/L的L‑亮氨酸；终浓度为482.114082mg/L的L‑盐酸赖氨酸；终浓度为
160.9366132mg/L的L‑甲硫氨酸；终浓度为222.1293405mg/L的L‑苯丙氨酸；终浓度为
195.125mg/L的L‑脯氨酸；终浓度为595.525mg/L的L‑丝氨酸；终浓度为269.1668449mg/L的L‑苏氨酸；终浓度为150.486mg/L的L‑色氨酸；终浓度为364.49mg/L的无水L‑酪氨酸二钠盐；终浓度为349.3411765mg/L的L‑缬氨酸；终浓度为0.12775mg/L的D‑生物素；终浓度为
0.035mg/L的烟酰胺；终浓度为0.0805mg/L的对氨基苯甲酸；终浓度为0.1792mg/L的维生素B6；终浓度为0.294mg/L的维生素B12；终浓度为0.0735mg/L的硫辛酸；终浓度为0.0056mg/L的1，4‑丁二胺二盐酸盐；终浓度为1.0836mg/L的精胺四盐酸；终浓度为0.0623mg/L的还原型谷胱甘肽；终浓度为2.016mg/L的乙醇胺盐酸盐；终浓度为14mg/L的无水氯化钙；终浓度为1.1081mg/L的七水硫酸亚铁；终浓度为35.812mg/L的无水硫酸镁；终浓度为98.56mg/L的六水氯化镁；终浓度为0.00014mg/L的氟化钠；终浓度为0.0658mg/L的氯化锌；终浓度为
0.0000189mg/L的二氧化锗；终浓度为0.001239mg/L的亚硒酸钠；终浓度为0.00042mg/L的钼酸铵；终浓度为0.0000007mg/L的溴化钾；终浓度为0.0000007mg/L的碘化钾；终浓度为
0.000112mg/L的乙酸钡；终浓度为0.00000126mg/L的硝酸银；终浓度为0.00007mg/L的二水氯化亚锡；终浓度为0.0000539mg/L的氯化铷；终浓度为0.000105mg/L的八水氧氯化锆；终浓度为0.000035mg/L的四水氯化锰；终浓度为0.000105mg/L的偏钒酸铵；终浓度为
0.00005145mg/L的六水氯化铝；终浓度为0.000952mg/L的五水氯化镉；终浓度为
0.000252mg/L的六水氯化钴；终浓度为0.00385mg/L的二水氯化铜；终浓度为0.000021mg/L的六水氯化铬；终浓度为1294.3mg/L的D‑无水葡萄糖；终浓度为2100mg/L的4‑羟乙基哌嗪乙磺酸；终浓度为700mg/L的消泡剂F68；终浓度为0.0168mg/L的九水偏硅酸钠；终浓度为
1.3741mg/L的柠檬酸铁；终浓度为0.000413mg/L的乙醇胺；终浓度为0.000532mg/L的氢化可的松；终浓度为0.000084mg/L的三碘甲状腺原氨酸和终浓度为1mg/L的IGF。
2.一种对HEK293细胞进行悬浮培养的方法，其特征在于，包括：将HEK293细胞接种于权利要求1所述培养基中；
3.权利要求1所述培养基在制备蛋白或者扩增病毒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述蛋白选自抗体，所述病毒选自腺病毒或慢病毒。
将外源基因转入HEK293细胞中，得到重组HEK293细胞；
采用权利要求2所述对HEK293细胞进行悬浮培养的方法对所述HEK293细胞进行培养，收集细胞液；
按照权利要求2所述的方法，对HEK293细胞进行培养，得到细胞液；和在所述细胞液中接种病毒进行培养，以便对所述病毒进行扩增。
7.一种制备疫苗的方法，其特征在于，包括：按照权利要求6所述的方法扩增病毒。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，进一步包括：
将所述扩增病毒所得到的病毒液进行减毒或者灭活处理，以便获得所述疫苗。
一种对HEK293细胞进行悬浮培养的方法及其培养基
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域。具体地，本发明涉及一种对HEK293细胞进行悬浮培养的方法及其培养基。
背景技术
[0002] HEK293细胞，又叫人胚胎肾细胞293，是一个衍生自人胚胎肾细胞的细胞系，具有转染效率高、易于培养等特点。目前，HEK293细胞可用于多种研究，例如，它可用于研究药物对钠通道的影响、可确定的RNA干扰系统和蛋白质中的核输出信号、基因表达载体的转染、蛋白表达。另外，由于HEK293细胞含有许多腺病毒基因，因此利用它们来传播目的基因所在的腺病毒载体是非常理想的。
[0003] 然而，目前适用于HEK293细胞悬浮培养的培养基和培养方法仍有待研究。
发明内容
[0004] 本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效地利用无血清培养基培养HEK293细胞的方法。
[0005] 本申请是基于发明人的下列发现而完成的：
[0006] 传统的HEK293细胞培养方式是在含有血清的DMEM/F12培养基中贴壁生长，血清能够为细胞的生长增殖提供所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质。但是血清的成分复杂，且不同产地、批次之间存在着质量差异，因而给细胞大规模培养工艺造成了诸多不利影响。另外，利用含血清培养基培养细胞获得产物的过程中，血清成为分离和纯化的主要障碍，残留的血清进入人体内会不可避免地引发不必要的免疫反应。
[0007] 有鉴于此，发明人结合之前在细胞培养领域积累的丰富经验，进行了大量的筛选和优化工作，意外地获得了一种利用无血清培养基培养HEK293细胞的方法，利用该方法可以高效地培养HEK293细胞，细胞活率高，同时能够在多项指标上获得比血清培养更优异的表现，尤其可以适用于疫苗领域时，以避免引发不必要的免疫反应。
[0008] 为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种用于悬浮培养HEK293细胞的培养基。根据本发明的实施例，所述培养基包括：DMEM/F12培养基；添加剂，所述添加剂包括：291.55重量份的L‑盐酸精氨酸；531.258重量份的L‑门冬酰胺；822.045重量份的L‑天门冬氨酸；256.5468806重量份的L‑半胱氨酸盐酸盐一水合物；3.29重量份的L‑胱氨酸二盐酸盐；169.155重量份的L‑谷氨酸；481.136328重量份的L‑谷氨酰胺；213.1518717重量份的L‑盐酸组氨酸一水合物；50.4重量份的L‑羟脯氨酸；423.8181818重量份的L‑异亮氨酸；
613.8987522重量份的L‑亮氨酸；482.114082重量份的L‑盐酸赖氨酸；160.9366132重量份的L‑甲硫氨酸；222.1293405重量份的L‑苯丙氨酸；195.125重量份的L‑脯氨酸；595.525重量份的L‑丝氨酸；269.1668449重量份的L‑苏氨酸；150.486重量份的L‑色氨酸；364.49重量份的无水L‑酪氨酸二钠盐；349.3411765重量份的L‑缬氨酸；0.12775重量份的D‑生物素；
0.035重量份的烟酰胺；0.0805重量份的对氨基苯甲酸；0.1792重量份的维生素B6；0.294重量份的维生素B12；0.0735重量份的硫辛酸；0.0056重量份的1，4‑丁二胺二盐酸盐；1.0836重量份的精胺四盐酸；0.0623重量份的还原型谷胱甘肽；2.016重量份的乙醇胺盐酸盐；14重量份的无水氯化钙；1.1081重量份的七水硫酸亚铁；35.812重量份的无水硫酸镁；98.56重量份的六水氯化镁；0.00014重量份的氟化钠；0.0658重量份的氯化锌；0.0000189重量份的二氧化锗；0.001239重量份的亚硒酸钠；0.00042重量份的钼酸铵；0.0000007重量份的溴化钾；0.0000007重量份的碘化钾；0.000112重量份的乙酸钡；0.00000126重量份的硝酸银；
0.00007重量份的二水氯化亚锡；0.0000539重量份的氯化铷；0.000105重量份的八水氧氯化锆；0.000035重量份的四水氯化锰；0.000105重量份的偏钒酸铵；0.00005145重量份的六水氯化铝；0.000952重量份的五水氯化镉；0.000252重量份的六水氯化钴；0.00385重量份的二水氯化铜；0.000021重量份的六水氯化铬；1294.3重量份的D‑无水葡萄糖；2100重量份的4‑羟乙基哌嗪乙磺酸；700重量份的消泡剂F68；0.0168重量份的九水偏硅酸钠；1.3741重量份的柠檬酸铁；0.000413重量份的乙醇胺；0.000532重量份的氢化可的松；0.000084重量份的三碘甲状腺原氨酸和1重量份的IGF（胰岛素样生长因子）。
[0009] 根据本申请的实施例，本申请的发明人发现不同细胞所适用的培养条件的通用性差，需要基于细胞自身的生长特性开发不同的培养方法，才能实现有效地细胞扩增或者培养。进而，发明人针对HEK293细胞特性进行了大量的优化和筛选实验，筛选获得了上述添加剂，将其添加至DMEM/F12培养基中可以实现在无血清条件下培养HEK293细胞，增殖倍数和细胞活率高，结团率低，在提高产能效率的同时降低血清等动物源性添加物的安全风险，本发明对于无血清细胞培养的工业化应用具有极强的现实意义。
[0010] 在本发明的另一方面，本发明提出了一种对HEK293细胞进行悬浮培养的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将HEK293细胞接种于前面所述培养基中；对所述HEK293细胞进行悬浮培养。由此，采用根据本发明实施例的方法培养所得HEK293细胞培养液有助于实现病毒增殖，提高病毒效价，从而更好地应用于疫苗病毒的扩增生产。
[0011] 在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述培养基在制备蛋白或者扩增病毒中的应用。利用前面所述培养基培养HEK293细胞，有助于表达基因在HEK293细胞中扩增表达，高产目标蛋白，而且也可适用于病毒转染HEK293细胞，实现病毒扩增，应用前景广泛。
[0012] 根据本发明的实施例，所述蛋白选自抗体，所述病毒选自腺病毒或慢病毒。
[0013] 在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备蛋白的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将外源基因转入HEK293细胞中，得到重组HEK293细胞；采用前面所述对HEK293细胞进行悬浮培养的方法对所述HEK293细胞进行培养，收集细胞液；从所述细胞液中分离提取出目标蛋白。由此，利用根据本发明实施例的方法可以高产蛋白。
[0014] 在本发明的又一方面，本发明提出了一种扩增病毒的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：按照前面所述的方法，对HEK293细胞进行培养，得到细胞液；和在所述细胞液中接种病毒进行培养，以便对所述病毒进行扩增。由此，采用根据本发明实施例的方法培养所得HEK293细胞培养液有助于实现病毒增殖，提高病毒效价，从而更好地应用于疫苗病毒的扩增生产。
[0015] 在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备疫苗的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：按照前面所述的方法扩增病毒。由此，利用根据本发明实施例的方法可以获得高病毒效价且高产量的疫苗，并且制备方法操作简便，产能高，适于规模化生产应用。
[0016] 根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将所述扩增病毒所得到的病毒液进行减毒或者灭活处理，以便获得所述疫苗。由此，可以避免病毒进入机体产生不良反应。
[0017] 在本发明的又一方面，本发明提出了一种疫苗。根据本发明的实施例，所述疫苗是通过前面所述制备疫苗的方法获得的。由此，根据本发明实施例的疫苗安全、有效，接种后不良反应小，适于推广应用。
[0018] 术语“疫苗”是指含有有效诱导受试者的抗特定病原体或疾病的治疗程度的免疫性的活性组分的试剂或组合物，在此是治疗性地针对感染病毒所引发的疾病。疫苗可以包括药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。
[0019] 在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述疫苗在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或者预防病毒相关疾病。
[0020] 术语“病毒相关疾病”是指因感染病毒所引发的疾病，本发明对于病毒的具体类型不做严格限定，例如，可以为狂犬病毒、流感病毒、冠状病毒、法氏囊病毒、登革热病毒、肠道病毒、脑炎病毒、痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、反向病毒、披膜病毒、黄病毒、肠道病毒、细小核糖核酸病毒、嵌沙样病毒、疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒、SARS病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、慢病毒、罗斯河病毒、西尼罗河病毒、黄热病毒、FSME病毒、甲型肝炎病毒。
[0021] 本发明的疫苗可以通过标准途径给药，所述途径包括但不限于胃肠外(例如，静脉内、椎管内的、皮下或肌肉内)、口服、粘膜(例如鼻内)或局部途径。
[0022] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
[0023] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0024] 图1显示了根据本发明一个实施例的HEK293细胞无血清培养细胞倍增时间（PDT）对比图，其中，标号1表示293SFM1培养基，标号2表示293SFM2培养基，标号3表示在DMEM/F12培养基中添加10%NBS的血清培养基（DMEM/F12+10%NBS），标号4表示市售商品培养基OPM‑CD Trans293（货号P82019）；
[0025] 图2显示了根据本发明一个实施例的细胞密度和细胞活率分析图；
[0026] 图3显示了根据本发明一个实施例的电镜图。
具体实施方式
[0027] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0028] 实施例1
[0029] 1、配制培养基
[0030] 1.1 DMEM/F12培养基
[0031]
[0032] 1.2 293SFM培养基
[0033] 293SFM1和293SFM2为分别在DMEM/F12培养基中添加如下成分：
[0034]
[0035]
[0036] 1.3 血清培养基
[0037] 在DMEM/F12培养基中添加10%NBS。
[0038] 1.4 市售商品培养基
[0039] OPM‑CD Trans293（货号P82019），按使用说明配制。
[0040] 2、细胞培养和检测
[0041] 在前面得到293SFM1培养基、293SFM2培养基、血清培养基（DMEM/F12+10%NBS）和市售商品培养基（OPM）后，按照下列方式对HEK293细胞进行悬浮摇瓶培养：
[0042] 按照1.0×106cells/ml细胞密度，分别用上述4种培养基接种HEK293细胞于摇瓶，置于37℃、5％CO2和110rpm的摇床培养箱内进行悬浮培养，每3天传代一次，传代过程中采用Countstar Biotech自动细胞计数仪检测每代细胞密度、细胞活率，计算细胞倍增时间。结果如图1所示，相同条件下4种培养基培养HEK293细胞，细胞倍增时间（PDT）为293SFM1培养基（22.89）＜OPM（23.23）＜293SFM2培养基（26.35）＜DMEM/F12+10%NBS（26.75）。由此，表明HEK293细胞在293SFM1培养基生长速度均优于其他培养基。
[0043] HEK293细胞稳定传代后，按照1.0×106cells/ml细胞密度，与分别用上述4种新鲜培养基稀释的含EGFP的质粒和PEI转染试剂混匀，室温孵育10‑15min，放回37℃培养箱中按日常条件培养，48h后检测细胞密度、细胞活率，并观察EGFP表达。图2为4种培养基转染48h的细胞密度、活率，图3为使用4种培养基进行转染的荧光图，结果表明，293SFM1培养基的细胞密度、细胞活率均优于其他对照组，293SFM1培养基与市售培养基的表达效果相当，均优于血清培养基，293SFM2的效果与血清培养基相当。
[0044] 综上所述，293SFM1培养基可以在不添加血清的条件下实现HEK293细胞的悬浮培养，且生长速度优于市售培养基，并均优于血清培养基；在转染过程中，使用293SFM1培养基EGFP的表达量与市售培养基效果相当，均优于血清培养基。无血清添加批间差异更小，降低生产纯化成本，可应用于转染、蛋白表达等领域大规模工业化生产。
[0045] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0046] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
