一种促进毛发生长的脐带间充质干细胞定向分泌组的制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种促进毛发生长的脐带间充质干细胞定向分泌组的制备方法。该方法包括以下步骤：使用无血清培养基对人脐带间充质干细胞进行传代培养，然后在培养基中加入终浓度为1‑10 ng/mL的活化素B进行处理24‑72 h，收集培养基，经离心、过滤，得到脐带间充质干细胞定向分泌组。本发明获得的脐带间充质干细胞定向分泌组可显著促进脱发人群毛发的生长，具有优异的防治脱发效果。

权利要求

1.一种促进毛发生长的脐带间充质干细胞定向分泌组的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：使用无血清培养基对人脐带间充质干细胞进行传代培养，然后在培养基中加入终浓度为1‑10 ng/mL的活化素B进行处理72 h，收集培养基，经离心、过滤，得到脐带间充质干细胞定向分泌组；所述的离心是在4℃，3000 rpm下离心5‑10 min；所述的过滤是用0.40 μm过滤器过滤。

2.根据权利要求1所述的制备方法制备得到的脐带间充质干细胞定向分泌组。

3.权利要求2所述的脐带间充质干细胞定向分泌组在制备防治脱发的产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的脱发包括各种原因引起的毛囊异常导致的脱发。

5.一种防治脱发的产品，其特征在于，包含有效量的作为活性成分的权利要求2所述的脐带间充质干细胞定向分泌组。

6.根据权利要求5所述的防治脱发的产品，其特征在于，所述的产品包括药品。

说明书

一种促进毛发生长的脐带间充质干细胞定向分泌组的制备方

法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及干细胞技术领域，具体涉及一种促进毛发生长的脐带间充质干细胞定向分泌组的制备方法和应用。

背景技术

[0002] 毛发是由毛囊产生的，毛囊是人体中十分微小但结构完整的器官，每个毛囊都是个独立的单位，有着独立的生长周期，任何引起毛囊相关细胞正常代谢异常或者周期循环异常的均会引起毛发异常或者脱发，而目前大多防脱类原料为植物提取物，效果并不显著。

[0003] 干细胞得益于其强大的优势，目前在很多疾病研究和治疗中应用。目前干细胞疗法主要包括干细胞移植，干细胞条件培养基和干细胞外泌体。有文献表明干细胞疗法能促进毛发的生长，调节毛囊周期。最新的研究将干细胞在正常培养条件下分泌至胞外的各种分子，包括生长因子和细胞因子，以及微泡和外泌体的复合物称为干细胞分泌组，而且研究发现当给与干细胞不同的培养基，不同的培养条件，或者给予干细胞本身一定的处理因素后，干细胞分泌组的组成成分会发生显著的变化，将这种在特定条件下，干细胞分泌的复合物称为定向分泌组。

[0004] 脐带间充质干细胞是一种易于获取，免疫原性比较低的干细胞，研究发现脐带间充质干细胞在相同培养条件下，其分泌的各种细胞因子和外泌体较多，但是由脐带间充质干细胞制得的定向分泌组防治脱发的效果有待提高。

发明内容

[0005] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种处理脐带间充质干细胞的新方法，其获得的定向分泌组可显著促进脱发人群毛发的生长，具有优异的防治脱发效果。

[0006] 因此，本发明的第一个目的是提供一种促进毛发生长的脐带间充质干细胞定向分泌组的制备方法，其包括以下步骤：使用无血清培养基对人脐带间充质干细胞进行传代培养，然后在培养基中加入活化素B进行处理，收集培养基，经离心、过滤，得到脐带间充质干细胞定向分泌组。

[0007] 优选的，所述的活化素B在培养基中的终浓度为1‑10 ng/mL。

[0008] 优选的，所述的活化素B的处理时间为24‑72 h。

[0009] 优选的，所述的离心是在4℃，3000 rpm下离心5‑10 min。

[0010] 优选的，所述的过滤是用0.40 μm过滤器过滤。

[0011] 优选的，所述的传代培养是培养至P1‑P10代。

[0012] 所述的无血清培养基为常规市售产品，可选择上海世泽生物科技有限公司生产的无血清培养基，其货号为：AC‑1001043（PRF）；或依科赛生物科技（太仓）有限公司生产的无血清培养基，其货号为：ME000‑N023；或友康生物科技（北京）股份有限公司生产的无血清培养基，其货号为：NC0103或NC0103.S。

[0013] 本发明的第二个目的是提供一种由上述的制备方法制备得到的脐带间充质干细胞定向分泌组。

[0014] 本发明的第三个目的是提供上述的脐带间充质干细胞定向分泌组在防治脱发中的应用。

[0015] 优选的，所述的脱发包括各种原因引起的毛囊异常导致的脱发，包括并不局限于雄激素脱发/脂溢性脱发、植发后脱发、发际线脱发。

[0016] 本发明的第四个目的是提供一种防治脱发的产品，其包含有效量的作为活性成分的脐带间充质干细胞定向分泌组。

[0017] 优选的，所述的产品包括日化用品、药品或保健品。

[0018] 本发明首次发现在人脐带间充质干细胞的培养过程中加入细胞因子‑活化素B进行处理，其制得的定向上清分泌组，可以显著促进脱发人群毛发的生长，与没有添加活化素B的对照处理获得的定向上清分泌组比较，具有显著性差异。由本发明方法获得的脐带间充质干细胞定向分泌组可应用于制备防治脱发的日化用品、药品或保健品，具有广阔的应用前景。

附图说明

[0019] 图1为脐带间充质干细胞定向分泌组促进小鼠毛囊由静止期进入生长期的体表观测图。1. Control组，不做任何处理；2. CM组，无血清培养基组；3. SCT组，正常培养的上清分泌组；4. DSCT组，10 ng/mL活化素B处理的上清定向分泌组。

[0020] 图2为脐带间充质干细胞定向分泌组促进小鼠毛囊由静止期进入生长期的HE染色观测图。Control组，不做任何处理；CM组，无血清培养基组；SCT组，正常培养的上清分泌组；DSCT组，10 ng/mL活化素B处理的上清定向分泌组。

[0021] 图3为脐带间充质干细胞定向分泌组促进离体毛囊人毛发的生长。

[0022] 图4为不同浓度活化素B处理脐带间充质干细胞获得的定向分泌组促进小鼠毛囊由静止期进入生长期的体表观测图。1. Control组，不做任何处理；2. DSCT‑1组，1 ng/mL活化素B处理细胞获得的定向分泌组；3. DSCT‑5组，5 ng/mL活化素B处理细胞获得的定向分泌组；4. DSCT‑10组，10 ng/mL活化素B处理细胞获得的定向分泌组。

[0023] 图5为不同浓度活化素B处理获得的脐带间充质干细胞定向分泌组促进小鼠毛囊由静止期进入生长期的HE染色观测图。Control组，不做任何处理；DSCT‑1组，1 ng/mL活化素B处理细胞获得的定向分泌组；DSCT‑5组，5 ng/mL活化素B处理细胞获得的定向分泌组；DSCT‑10组，10 ng/mL活化素B处理细胞获得的定向分泌组。

具体实施方式

[0024] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

[0025] 实施例1

[0026] 1、脐带间充质干细胞原代培养及脐带间充质干细胞定向分泌组制备

[0027] （1）脐带间充质干细胞原代培养

[0028] 无菌采集胎儿脐带，装入预先放置PBS（含2%青霉素+2%链霉素，质量分数）的离心管中带回，于超净工作台内，反复冲洗以除去脐带组织表面的血凝块，用止血钳夹住脐带两端，放入75%医用酒精浸泡1 min左右；然后转移至PBS中清除脐带表面残余的酒精，将脐带剪成2‑3 cm的片段，放入PBS中，以除去脐带动脉、静脉中的血细胞；随后用组织剪剪开脐静脉，去除脐静脉、脐动脉及脐带外膜，分离出华通氏胶组织，PBS反复冲洗后将华通氏胶组织剪成2‑3 mm组织块均匀铺于培养皿中，加入脐带间充质干细胞无血清专用培养基（友康生物科技（北京）股份有限公司，货号：NC0103），于37℃、5% CO2培养箱中培养；待细胞长满至80‑90%后，用干细胞温和消化酶（友康生物科技（北京）股份有限公司，货号：NC1004.2）进行消化传代。

[0029] 分离获取脐带间充质干细胞后，对脐带间充质干细胞在光镜下进行细胞学评价并进行流式细胞术分析鉴定。

[0030] （2）脐带间充质干细胞定向分泌组制备

[0031] 使用无血清培养基对脐带间充质干细胞培养至P3代时，在培养基中加入终浓度分别为1 ng/mL，5 ng/mL，10 ng/mL的活化素B处理细胞72小时，之后收集脐带间充质干细胞条件培养基，4℃低速离心10分钟，3000转/分钟，之后用0.40 μm过滤器过滤细胞条件培养基，获得不同浓度活化素B处理的脐带间充质干细胞定向分泌组（即1 ng/mL，5 ng/mL，10 ng/mL活化素B处理的上清定向分泌组），置于‑80℃储存。

[0032] 参照上述方法制备正常培养的上清分泌组，即除了不加入活化素B进行处理，其余制备条件均与活化素B处理的上清定向分泌组的制备条件相同。

[0033] 2、脐带间充质干细胞定向分泌组促进小鼠毛囊由静止期进入生长期

[0034] 6‑8周的C57BL/6小鼠，6只，皮肤粉红色，毛囊处于静止期。同一只小鼠背部画4个直径1 cm的圈，分别处理：1. Control组，不做任何处理；2. CM组，无血清培养基组；3. SCT组，正常培养的上清分泌组；4. DSCT组，活化素B（10 ng/mL）处理的上清定向分泌组。涂抹14天，大体观察皮肤的颜色，判断毛囊的周期；毛发静观察毛发的生长，结果见图1。HE染色观察毛囊的结构，结果见图2。

[0035] 由图1可知，处理的第11天可以看到，Control组，CM组，SCT组的小鼠皮肤是粉红色，毛囊处于静止期，而DSCT组的小鼠皮肤已经变成深灰色，说明毛囊进入生长期，而且可以看到皮肤表面已经由毛发长出。第14天可以看到，Control组，CM组，SCT组的小鼠皮肤依然是粉红色，毛囊处于静止期，而DSCT组小鼠的皮肤已经变成深黑色，皮肤表面毛发长出较长。

[0036] 由图2可知，处理的第14天可以看到，Control组，CM组，SCT组的小鼠皮肤中毛囊毛乳头位置在皮肤真皮内，说明毛囊还是在静止期，而DSCT组小鼠皮肤中毛囊的毛乳头到达皮下组织深处，说明毛囊已经处于生长期。

[0037] 3、脐带间充质干细胞定向分泌组促进体外培养的人毛发的生长

[0038] 取临床毛发移植手术中废弃的毛囊，体外用William's E 培养基（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，货号：A1217601）进行离体器官培养，6孔板，将毛囊水平放入培养基中，分4组：1. Control组，不做任何处理；2. CM组，无血清培养基组；3. SCT组，正常培养的上清分泌组；4. DSCT组，活化素B（10 ng/mL）处理的上清定向分泌组。培养10天后观察毛发生长的相对长度。结果见图3。

[0039] 由图3中的A可知，相对于其他3组，DSCT组毛发的生长速度最快，而且相对于其他3组，DSCT组毛囊组织的细胞爬出的最多（箭头），提示DSCT组适合毛囊离体器官的生存。由图3中的B可知，培养至第10天，测量毛发的总长度，计算毛发的相对生长长度：（处理后的长度‑原始的长度），发现DSCT组毛发的相对生长长度最高。

[0040] 4、不同浓度活化素B处理脐带间充质干细胞获得的定向分泌组促进小鼠毛囊由静止期进入生长期。

[0041] 6‑8周的C57BL/6小鼠，6只，皮肤粉红色，毛囊处于静止期。同一只小鼠背部画4个直径1 cm的圈，分别处理：1. Control组，不做任何处理；2. DSCT‑1组，1 ng/mL活化素B处理细胞获得的定向分泌组；3. DSCT‑5组，5 ng/mL活化素B处理细胞获得的定向分泌组；4. DSCT‑10组，10 ng/mL活化素B处理细胞获得的定向分泌组。涂抹14天，大体观察皮肤的颜色，判断毛囊的周期；毛发静观察毛发的生长，结果见图4。HE染色观察毛囊的结构，结果见图5。

[0042] 由图4可知，处理的第11天可以看到，Control组的小鼠皮肤是粉红色，毛囊处于静止期，而DSCT‑1组，DSCT‑5组和DSCT‑10组的小鼠皮肤已经变成灰色或者深灰色，说明毛囊进入生长期，而且可以看到皮肤表面已经由毛发长出。第14天可以看到，Control组小鼠皮肤是灰色，毛囊刚进入生长期，而DSCT‑1组，DSCT‑5组和DSCT‑10组小鼠的皮肤已经变成深黑色，皮肤表面毛发长出较长。

[0043] 由图5可知，处理的第14天可以看到，Control组的小鼠皮肤中毛囊毛乳头位置在皮肤真皮内，说明毛囊还是在静止期，而DSCT‑1组，DSCT‑5组和DSCT‑10组小鼠皮肤中毛囊的毛乳头到达皮下组织深处，说明毛囊已经处于生长期。

[0044] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。