一种复合乳酸菌发酵溶胞物及其制备方法、应用转让专利
申请号 : CN202211609174.9
文献号 : CN115595333B
文献日 : 2023-04-07
发明人 : 陈美明 , 石俊芳 , 滕凌 , 梁庆 , 黄继英 , 张惠芬 , 姚晓林 , 谭雅超 , 谢钰怡
申请人 : 朗肽生物制药股份有限公司
摘要 :
本发明涉及一种复合乳酸菌发酵溶胞物及其制备方法、应用，涉及生物发酵领域。解决的技术问题是现有技术中乳酸菌的培养周期长，制备工艺繁琐。将植物乳杆菌、干酪乳杆菌、短乳杆菌复合乳酸菌发酵剂按比例接种于改良发酵培养基，37℃培养约30h至OD达到7‑10,将发酵液用高压匀浆机匀浆2次，将匀浆液和保护剂混合，保护剂选择黄原胶，按0.3%的比例进行混合，高速搅拌充分乳化，高温灭菌80℃30min进行灭活处理得到产品。本发明利用复合乳酸菌接种发酵，乳酸菌能迅速生长，并产生大量乳酸等副产物降低环境pH值，形成菌群优势，抑制大肠杆菌等杂菌的生长，同时发生同型发酵和异型发酵，产生大量代谢产物，增强乳酸菌发酵溶胞产物对皮肤的功效。
权利要求 :
1.一种复合乳酸菌发酵溶胞物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、将植物乳杆菌、干酪乳杆菌、短乳杆菌均为乳杆菌属菌种制成活性干燥的固体直投式复合乳酸菌发酵剂；步骤1中植物乳杆菌、干酪乳杆菌、短乳杆菌质量比为2：1：1；
步骤2、制备改良型的发酵培养基配方为牛肉浸粉2.0‑5.0g/L,酵母浸粉1.5g‑3.5/L,胰酪蛋白胨4.0‑7.0g/L,无水乙酸钠4‑5g,L‑半胱氨酸0.5g‑1g/L,葡萄糖10.0‑15.0g/L,磷酸二氢钾1.0‑2.0g/L,磷酸氢二钾1.0‑2.0g/L,硫酸镁0.1‑0.5g/L,异构化乳糖10‑15g/L,氯化钠1g‑2g/L,低聚果糖10g‑20g/L,硫酸锰0.06‑0.08g/L,吐温80 1.0‑1.5ml/L,pH值
6.8，121℃‑125℃高温灭菌20‑30min备用；
步骤3、按步骤1所得固体直投式复合乳酸菌发酵剂3％接种量接种于步骤2改良型的发酵培养中，温度37摄氏度，培养30h至OD7‑10；
步骤4、匀浆：将发酵液用高压匀浆机匀浆2次以上得到匀浆液；
步骤5、将匀浆液和保护剂混合，高速搅拌充分乳化得到复合乳酸菌发酵溶胞物；步骤5中的保护剂选择黄原胶，按0.3％的质量比比例与匀浆液进行混合；
步骤6、将复合乳酸菌发酵溶胞物高温灭菌进行灭活处理；步骤6中高温灭菌的温度为
80℃，持续30min。
2.根据权利要求1所述的复合乳酸菌发酵溶胞物的制备方法，其特征在于：改良型的发酵培养基配方为牛肉浸粉3.0g/L,酵母浸粉2.0g/L,胰酪蛋白胨5.0g/L,无水乙酸钠5g,L‑半胱氨酸0.5g/L,葡萄糖10.0g/L,磷酸二氢钾1.0g/L,磷酸氢二钾1.0g/L,硫酸镁0.2g/L,异构化乳糖10g/L,氯化钠1g/L,低聚果糖10g/L,硫酸锰0.06g/L,吐温80 1.0ml/L,pH值
6.8，121℃高温灭菌20min备用。
3.一种权利要求1或2所述制备方法制得的复合乳酸菌发酵溶胞物。
4.一种化妆品，其特征在于：添加权利要求3所述的复合乳酸菌发酵溶胞物。
说明书 :
一种复合乳酸菌发酵溶胞物及其制备方法、应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物发酵领域，尤其是涉及一种复合乳酸菌发酵溶胞物及其制备方法、应用。
背景技术
[0002] 现有技术中最为接近的的是乳酸菌发酵溶胞产物，乳酸菌菌种于种子培养基中，扩培后，于发酵培养基中发酵而得的初始体系，经离心、乳化和灭活处理后，得到的溶胞产物。乳酸菌可用于多种化妆品中，能有效促进皮肤更新、减少黑色素合成、具有美白功效、能有效清除自由基、改善真皮组织生理功能，具有抗衰功效。
[0003] 但是，乳酸菌的培养周期长，制备工艺繁琐，需要中间扩大培养操作过程，生产成本高，容易污染杂菌。
发明内容
[0004] 本发明设计了一种复合乳酸菌发酵溶胞物及其制备方法、应用，其解决的技术问题是现有技术中乳酸菌的培养周期长，制备工艺繁琐，需要中间扩大培养操作过程，生产成本高，容易污染杂菌。
[0005] 为了解决上述存在的技术问题，本发明采用了以下方案：
[0006] 一种复合乳酸菌发酵溶胞物的制备方法，包括以下步骤：
[0007] 步骤1、将植物乳杆菌（同型发酵乳酸菌）、干酪乳杆菌（异型发酵乳酸菌）、短乳杆菌（异型发酵乳酸菌）均为乳杆菌属菌种制成活性干燥的固体直投式复合乳酸菌发酵剂；
[0008] 步骤2、制备改良型的发酵培养基配方为牛肉浸粉2.0‑5.0g/L,酵母浸粉1.5g‑3.5/L,胰酪蛋白胨4.0‑7.0g/L,无水乙酸钠4‑5g,L‑半胱氨酸0.5g‑1g/L,葡萄糖10.0‑
15.0g/L,磷酸二氢钾1.0‑2.0g/L,磷酸氢二钾1.0‑2.0g/L,硫酸镁0.1‑0.5g/L,异构化乳糖
10‑15g/L,氯化钠1g‑2g/L,低聚果糖10g‑20g/L,硫酸锰0.06‑0.08g/L,吐温80 1.0‑1.5ml/L, pH值6.8，121℃‑125℃高温灭菌20‑30min备用；
15.0g/L,磷酸二氢钾1.0‑2.0g/L,磷酸氢二钾1.0‑2.0g/L,硫酸镁0.1‑0.5g/L,异构化乳糖
10‑15g/L,氯化钠1g‑2g/L,低聚果糖10g‑20g/L,硫酸锰0.06‑0.08g/L,吐温80 1.0‑1.5ml/L, pH值6.8，121℃‑125℃高温灭菌20‑30min备用；
[0009] 步骤3、按步骤1所得固体直投式复合乳酸菌发酵剂3%接种量接种于步骤2改良型的发酵培养中，温度37摄氏度，培养30h至OD7‑10；
[0010] 步骤4、匀浆：将发酵液用高压匀浆机匀浆2次以上得到匀浆液；
[0011] 步骤5、将匀浆液和保护剂混合，高速搅拌充分乳化得到复合乳酸菌发酵溶胞物；
[0012] 步骤6、将复合乳酸菌发酵溶胞物高温灭菌进行灭活处理。
[0013] 优选地，步骤1中植物乳杆菌（同型发酵乳酸菌）、干酪乳杆菌（异型发酵乳酸菌）、短乳杆菌（异型发酵乳酸菌）质量比为2：1：1。
[0014] 优选地，改良型的发酵培养基配方为牛肉浸粉3.0g/L,酵母浸粉2.0g/L,胰酪蛋白胨5.0g/L,无水乙酸钠5g,L‑半胱氨酸0.5g/L,葡萄糖10.0g/L,磷酸二氢钾1.0g/L,磷酸氢二钾1.0g/L,硫酸镁0.2g/L,异构化乳糖10g/L,氯化钠1g/L,低聚果糖10g/L,硫酸锰0.06g/L,吐温80 1.0ml/L, pH值6.8，121℃高温灭菌20min备用。
[0015] 优选地，步骤5中的保护剂选择黄原胶，按0.3%的质量比比例与匀浆液进行混合。
[0016] 优选地，步骤6中高温灭菌的温度为80℃，持续30min。
[0017] 一种上述制备方法制得的复合乳酸菌发酵溶胞物。
[0018] 一种化妆品，添加上述的复合乳酸菌发酵溶胞物。
[0019] 该复合乳酸菌发酵溶胞物及其制备方法、应用具有以下有益效果：
[0020] （1）本发明复合菌种发酵是指利用纯的单一或多种微生物进行发酵，发酵速度快、产物稳定。利用复合乳酸菌接种发酵，乳酸菌能迅速生长，并产生大量乳酸等副产物降低环境pH值，形成菌群优势，抑制大肠杆菌等杂菌的生长，同时发生同型发酵和异型发酵，产生大量代谢产物，增强乳酸菌发酵溶胞产物对皮肤的功效。
[0021] （2）本发明将乳酸菌制成活性干燥的固体直投式复合乳酸菌发酵剂，用于乳酸菌发酵溶胞产物制备，其具有菌种活力高，体积小，运输方便，保藏稳定等优点，不需要中间扩大培养操作过程，简化产品生产工艺，防止了菌种退化和杂菌污染，可直接用于生产，有利于乳酸菌发酵溶胞产物生产标准化和保持产品质量的稳定，可以使发酵时间缩短至自然发酵的1/2～1/3，降低了成本10～20%。
附图说明
[0022] 图1：本发明中细胞相对活力图；
[0023] 图2：本发明实验结果中Ⅰ型胶原蛋白含量变化趋势图。
[0024] 图3：本发明实验结果中酪氨酸酶抑制率示意图；
[0025] 图4：本发明实验结果中皮肤经表皮水分流失TEWL值分析图；
[0026] 图5：本发明实验结果中皮肤血红素值变化图；
[0027] 图6：本发明实验结果中皮肤角质层含水量变化图；
[0028] 图7：本发明实验结果中红色区面积占比变化图。
具体实施方式
[0029] 下面结合实施例，对本发明做进一步说明：
[0030] 实施例1：
[0031] 1、植物乳杆菌（同型发酵乳酸菌）、干酪乳杆菌（异型发酵乳酸菌）、短乳杆菌（异型发酵乳酸菌）均为乳杆菌属菌种，将此三种菌恰当配比(2：1：1)，制成活性干燥的固体直投式复合乳酸菌发酵剂.
[0032] 2、改良型的发酵培养基配方为牛肉浸粉3.0g/L,酵母浸粉2.0g/L,胰酪蛋白胨5.0g/L,无水乙酸钠5g,L‑半胱氨酸0.5g/L,葡萄糖10.0g/L,磷酸二氢钾1.0g/L,磷酸氢二钾1.0g/L,硫酸镁0.2g/L,异构化乳糖10g/L,氯化钠1g/L,低聚果糖10g/L,硫酸锰0.06g/L,吐温80 1.0ml/L,pH值6.8，121℃高温灭菌20min备用。
[0033] 3、按3%接种量接种于发酵培养基中，温度37度，培养30h至OD7‑10。
[0034] 4、匀浆：将发酵液用高压匀浆机匀浆2次。
[0035] 5、将匀浆液和保护剂混合，保护剂选择黄原胶，按0.3%的比例进行混合，高速搅拌充分乳化得到产品
[0036] 6、将产品高温灭菌80℃30min进行灭活处理。
[0037] 最终产品具有以下效果：
[0038] （1）增加皮肤成纤维细胞I型胶原蛋白的表达。 （2）改善皮肤保湿效果。（3）抗氧化。（4）美白。（5）抗炎。
[0039] 最终产品的功效研究‑体外实验：
[0040] 毒性测试
[0041] 1.1实验材料
[0042] 1.1.1细胞：人皮肤成纤维细胞（HSF）；
[0043] 1.1.2试剂：高糖DMEM培养基，胎牛血清，PBS，MTT，DMSO，胰蛋白酶；
[0044] 1.1.3实验分组：
[0045] 调零组：无细胞接种，每孔仅加入细胞培养液；
[0046] 阳性对照组：含10%DMSO的培养液；
[0047] 阴性对照组：细胞培养液；
[0048] 样品组：含有相应浓度样品的培养液，每个样品设置8个浓度梯度；
[0049] 1.2实验方法
[0050] 1.2.1收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至5000个/孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
[0051] 1.2.2按照下表用配制样品浓度梯度
[0052] 表1 配制样品浓度梯度
[0053]
[0054] （1）5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,每孔100ul,设3个复孔；
[0055] （2）5%CO2，37℃孵育24小时，倒置显微镜下观察。
[0056] （3）每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续避光培养4h。
[0057] （4）终止培养，小心吸去孔内培养液。
[0058] （5）每孔加入100ul DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
[0059] （6）根据以下公式计算细胞相对活力：
[0060] 细胞相对活力=［（样品孔‑调零孔）/（阴性对照孔‑调零孔）］×100%。
[0061] 1.3实验结果
[0062] 以样品所选8个浓度为横坐标， 细胞相对活力值为纵坐标，绘制细胞相对活力图（见图1)。 根据MTT结果，样品在6.00％浓度范围内未表现出成纤维细胞毒性。
[0063] 紧致功效测试：
[0064] 2.1实验材料
[0065] 2.1.1细胞：人皮肤成纤维细胞（HSF）
[0066] 2.1.2试剂：高糖DMEM培养基，胎牛血清，PBS，胰蛋白酶，人Ⅰ型胶原酶联免疫试剂盒，TGF‑β
[0067] 2.1.3实验分组：
[0068] 阳性对照组：100ng/ml TGF‑β
[0069] 阴性对照组：细胞培养液
[0070] 样品组：含有相应浓度样品的培养液（6%，3%，1.5%）
[0071] 2.2实验方法
[0072] 2.2.1收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至5000个/孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
[0073] 2.2.2 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,每孔100ul,设3个复孔
[0074] 2.2.3给药完毕后将 96 孔板放置在 CO2培养箱中培养 24 h
[0075] 2.2.4孵育培养结束后，每孔收集 100 μL 细胞培养上清液于 1.5 mL 无菌离心管中，置于‑80 ℃超低温冰箱冷冻保存。
[0076] 2.2.5 根据人Ⅰ型胶原酶联免疫试剂盒的使用说明书进行ELISA检测。
[0077] 2.3实验结果：
[0078] 参见图2中Ⅰ型胶原蛋白含量变化趋势（pg/ml），与阴性对照相比，样品在3% (v/v) 浓度下作用成纤维细胞 24h 后， I型胶原蛋白的含量显著上调（P<0.05），具有促进Ⅰ型胶原蛋白合成的能力，达到使皮肤紧致的功效。
[0079] 美白功效测试
[0080] 3.1试剂及受试物
[0081] 溶剂（PBS缓冲液）：pH=6.8，0.1 mol/L。
[0082] L‑酪氨酸溶液：称取 0.025 g L‑酪氨酸，用 PBS缓冲液溶解，超声助溶，定容至 50 mL，现配现用；
[0083] 酪氨酸酶溶液：用PBS 缓冲液将蘑菇酪氨酸酶配制成 500 U/mL，分装，‑20 ℃保存，避免二次冻融；
[0084] 阳性对照：1%曲酸；
[0085] 样品：3% 复合乳酸菌发酵溶胞物；
[0086] 3.2实验方法
[0087] 在96孔酶标板中设置溶剂本底孔（T0）、溶剂反应孔（T）、样品本底孔（C0）、样品反应孔（C）。每组做三个复孔。参照表2试剂添加量，在各孔依次加入L‑酪氨酸溶液、样品溶液、溶剂（PBS缓冲液），充分混匀，置于37 ℃恒温环境下孵育10 min后依次在各孔加入20 μL的酪氨酸酶溶液，37 ℃混匀反应5 min±5 s后即刻放入酶标仪，在475 nm波长处进行测定。
[0088] 试剂 溶剂本底孔T0 溶剂反应孔T 样品本底孔C0 样品反应孔CL‑酪氨酸溶液（μL） ‑ 40 ‑ 40
样品溶液（μL） ‑ ‑ 40 40
溶剂（PBS缓冲液）（μL）40 40 ‑ 0
PBS缓冲液（μL） 70 30 70 30
酪氨酸酶溶液（μL） 20 20 20 20
样品溶液（μL） ‑ ‑ 40 40
溶剂（PBS缓冲液）（μL）40 40 ‑ 0
PBS缓冲液（μL） 70 30 70 30
酪氨酸酶溶液（μL） 20 20 20 20
[0089] 表2 样品加液要求
[0090] 酪氨酸酶活性抑制率按公式计算：Y=(1‑(C‑C0)/(T‑T0))*100%
[0091] 3.3实验结果：
[0092] 如图3所示，实验证明，3%的复合乳酸菌发酵溶胞物对酪氨酸酶的抑制率为45.12%，1%曲酸对酪氨酸酶的抑制率为99.05%，如图3所示，即3%的复合乳酸菌发酵溶胞物相当于0.455%的曲酸的效果，具有一定的美白功效。
[0093] 功效研究‑活体试验：
[0094] 试验人群：30‑50岁之间的女性志愿者，共30例。
[0095] 试验方法：在志愿者的面部分别使用3%的复合乳酸菌发酵溶胞物和安慰剂，每天使用2 次，持续使用8周。在试用的第0,2,4,6,8周分别进行以下测量：
[0096] TewameterTM300测量皮肤经表皮水分流失TEWL值；
[0097] Mexameter MX 18测量皮肤血红素(EI)值；
[0098] Corneometer CM825 测量皮肤角质层含水量；
[0099] VISIA‑CR拍摄皮肤红色区面积情况，经ImagePro Plus软件进行分析。
[0100] 实验结果：
[0101] 皮肤经表皮水分流失TEWL值分析：
[0102] 如图4所示皮肤经表皮水分流失TEWL值分析，使用试验产品后，受试者面部经表皮水分流失TEWL值在回访时间点8周有下降趋势，与0周相比有显著性差异，说明使用产品后面部皮肤TEWL值下降， 产品对减少皮肤水分流失有效果，产品具有修护效果。
[0103] （1）皮肤血红素(EI)值分析
[0104] 如图5所示皮肤血红素值变化，使用试验产品后，受试者面部皮肤血红素值在回访时间点8周有下降趋势，与0周相比有显著性差异，说明使用产品后面部皮肤血红素含量有下降，面部泛红情况得到改善，产品具有缓解泛红、舒缓的效果。
[0105] （2）皮肤角质层含水量分析
[0106] 如图6所示皮肤角质层含水量变化，使用试验产品后，受试者面部皮肤角质层水分含掀在回访时间点8周有上升趋势， 与0周相比有显著性差异，说明使用产品后面部皮肤角质层的水分量有增加，产品具有保湿效果。
[0107] （3）皮肤红色区面积分析
[0108] 如图7所示红色区面积占比变化，使用试验产品后，受试者面部特定区域内红色区面积占比在回访时间点8周有下降趋势，与0周相比有显著性差异，说明使用产品后面部皮肤红色区面积占比有减少，面部泛红情况得到改善，产品具有缓解泛红、舒缓的效果。
[0109] 上面结合实施例对本发明进行了示例性的描述，显然本发明的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。