GhGPX5和GhGPX13基因在提高植物盐胁迫耐受性中的应用

摘要

本发明公开了一种GhGPX5和GhGPX13基因在提高植物盐胁迫耐受性中的应用，所述GhGPX5和GhGPX13基因在NCBI中基因序列号分别为XM_041083558.1和XM_016881552.2。本发明通过基因沉默方式获得GhGPX5/13沉默的植株，结果表明基因沉默植株在高盐胁迫下叶片萎蔫严重，黄化现象严重，表明其对高盐处理更为敏感。接着构建GhGPX5/13的过表达载体p35S‑GhGPX5‑GFP和p35S‑GhGPX13‑GFP，利用农杆菌花序侵染法转化野生型拟南芥（Clo‑0，WT），获得过表达植株，分析结果表明在高盐胁迫下，相对于野生型，GhGPX5/13能够提高种子萌发率，增强拟南芥幼苗盐胁迫耐受性，从而为作物耐盐分子育种提供了基因资源。

权利要求

1.GhGPX5和GhGPX13基因在提高植物盐胁迫耐受性中的应用，其特征在于，所述GhGPX5和GhGPX13基因在NCBI中基因序列号分别为XM_041083558.1和XM_016881552.2，通过构建GhGPX5和GhGPX13过表达载体，获得盐胁迫耐受性高的转基因植株，所述植物为棉花或拟南芥。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述盐胁迫耐受性为高浓度盐胁迫耐受性，所述高浓度盐浓度为400 mM。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述盐胁迫耐受性表现为：在盐胁迫下，GhGPX5和GhGPX13基因沉默株系的叶片萎蔫程度和黄化程度均高于野生型，而GhGPX5和GhGPX13过表达株系的种子萌发率高于野生型，叶片的黄化程度低于野生型。

4.一种植物育种方法，其特征在于，所述方法为以下（1）或（2）：

（1）通过促进目的植物中GhGPX5和GhGPX13基因的表达，获得盐胁迫耐受性强于目的植物的植株；

（2）通过抑制目的植物中的GhGPX5和GhGPX13基因的表达，获得盐胁迫耐受性低于目的植物的植株；

所述GhGPX5和GhGPX13基因在NCBI中基因序列号分别为XM_041083558.1和XM_

016881552.2，所述目的植物为棉花或拟南芥。

说明书

GhGPX5和GhGPX13基因在提高植物盐胁迫耐受性中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及GhGPX5和GhGPX13基因在提高植物盐胁迫耐受性中的应用。

背景技术

[0002] 植物在整个生育期中，会遭受各种生物胁迫和非生物胁迫的环境，各种胁迫因素最终造成植物体内过量活性氧的积累，从而影响植物的生长发育。已有研究认为，活性氧是植物新陈代谢过程中的一个副产物，在细胞信号传递和氧化还原平衡等过程中起着重要的作用。低浓度的活性氧在植物体内可作为信号分子起作用，而高浓度的活性氧会对植物细胞产生毒害作用，会氧化胞内组分如DNA、蛋白和质膜等生物大分子，从而影响植物生长发育，进而降低作物的产量。

[0003] 植物体在进化过程中形成了复杂的酶促系统和非酶促系统以消除由活性氧产生的氧化损伤，维持活性氧动态平衡。其中酶促系统包括各种过氧化酶家族，研究这些抗氧化基因的功能可以为提高植物抗逆性提供理论依据和应用基础。

[0004] 植物GPXs能清除由于胁迫环境产生的过量的活性氧，其通常以Trx作为还原剂，而不是GSH，因此被认为其具有硫氧还蛋白过氧化物酶活性。有些植物GPXs同时表现谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白过氧化物酶的活性，但以硫氧还蛋白为底物，其酶活性较以谷胱甘肽为底物的活性高。但总体而言，由于GPXs基因及其对应蛋白类型较多，作用过程较为复杂，因而尚需进一步加以研究，以便为基因的具体应用奠定理论基础。

[0005] 我国对原棉的需求日益加剧，但依靠扩大耕地面积提高总产量是不现实的，我国有1亿多亩地产盐碱地，3亿亩盐碱荒地，60% 80%棉田在干旱和半干旱地区。由于棉花比其~它作物需要相对较强的抗旱性和耐盐碱性，生长过程中容易受到多种胁迫因素影响，因而生物体内易于积累大量活性氧，而GPXs家族具有清除活性氧，进而抵御外界环境胁迫的能力。因而通过对棉花中GPXs基因研究，可以更清楚的了解棉花在生物和非生物胁迫下GPXs蛋白家族所起的作用。进而利用转基因技术培育能够抵御外界胁迫条件的棉花品种，对于我国棉花生产的长期稳定发展有着十分重要的意义，了解并找到与抗旱性和耐盐碱性更多相关的基因，从分子层面研究基因对棉花的生长发育及逆境抗性的影响具有重要意义。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供GhGPX5和GhGPX13基因在提高植物盐胁迫耐受性中的应用。

[0007] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案概述如下：

[0008] 本发明采用的GhGPX5基因在NCBI中基因序列号（Sequence ID）为XM_041083558.1，GhGPX5基因的信使RNA（mRNA）序列长度为1313 bp， GhGPX5基因的编码序列长度为702 bp，包括233个氨基酸；

[0009] GhGPX13基因在NCBI中基因序列号（Sequence ID）为XM_016881552.2，GhGPX13的信使RNA（mRNA）序列长度1256 bp，GhGPX13基因的编码序列长度为702 bp，包括233个氨基酸。GhGPX5和GhGPX13的氨基酸序列之间具有较高的同源性。

[0010] 本发明还构建一系列植物表达载体，含有上述基因的表达载体、重组载体或转基因植物系以及含有所述载体的宿主细胞在提高植物耐盐胁迫方面的功能也落入本发明的保护范围之内。

[0011] 本发明所保护的基因的功能，不仅包括上述GhGPX5和GhGPX13基因，还包括与GhGPX5和GhGPX13基因具有较高同源性（同源性高达99％）的同源基因在耐盐胁迫方面的功能。

[0012] 本发明公开的GhGPX5和GhGPX13基因在植物耐盐胁迫中的生物学功能，具体表现在：在盐胁迫下，GhGPX5和GhGPX13基因沉默株系的叶片萎蔫程度、黄化程度高于野生型，而GhGPX5和GhGPX13过表达株系的种子萌发率高于野生型，叶片黄化程度低于野生型。

[0013] 根据其功能，可以通过转基因的方式来获得耐盐胁迫的植株，具体地，可以通过将GhGPX5和GhGPX13基因导入目的植物，得到转基因植物，该植株耐盐胁迫能力高于目的植物。

[0014] 具体地，GhGPX5和GhGPX13基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物。所述方法中，所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

[0015] 为了提高植物的优良性状，本发明还保护一种新的植物育种方法，所述方法为以下（1）或（2）或（3）：

[0016] （1）通过增加目的植物中GhGPX5和GhGPX13蛋白的活性，获得盐胁迫耐受性强于目的植物的植株；

[0017] （2）通过促进目的植物中GhGPX5和GhGPX13基因的表达，获得盐胁迫耐受性强于目的植物的植株；

[0018] （3）通过抑制目的植物中的GhGPX5和GhGPX13基因的表达，获得盐胁迫耐受性低于目的植物的植株。

[0019] “促进目的植物中GhGPX5和GhGPX13基因的表达”的实现方式可为如下（1）或（2）或（3）:

[0020] （1）将GhGPX5和GhGPX13基因导入目的植物；

[0021] （2）引入强启动子和/或增强子；

[0022] （3）本领域内的其它常见方法。

[0023] 其中，目的植物，本发明所述目的植物是棉花、拟南芥。

[0024] 目的基因，也称靶标基因，在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因。可以是生物体本身的，也可以是来自不同生物体的。

[0025] “调控植物中的GhGPX5和GhGPX13基因的表达”的方法为过表达、沉默或定向突变 GhGPX5和GhGPX13基因。

[0026] 调控基因表达水平包括利用DNA同源重组技术、病毒介导的基因沉默技术和农杆菌介导的转化体系调控所述 GhGPX5和GhGPX13表达，获得转基因植物株系。

[0027] 本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是（不限于）：双子叶植物、单子叶植物或裸子植物。

[0028] 作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：棉花、拟南芥，尤其是陆地棉（Gossypium hirsutum），凡是具有该基因或者与之同源的基因均适用。

[0029] 本发明中所说的“植物”包括整株植物，其亲本和子代植株以及植物的不同部位，包括种子、果实、芽、茎、叶、根（包括块茎）、花、组织和器官，在这些不同的部分均有我们目的基因或者核酸。这里所提及的“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样，其中每种前述对象包含目的基因/核酸。

[0030] 本发明包括任何植物细胞，或任何由其中的方法获得或可获得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本专利也包含由任何前述方法所获得的转染细胞、组织、器官或完整植物。唯一的要求是子代表现出相同的基因型或表型特征，使用本专利中的方法获得的子代特性相同。

[0031] 本发明还扩展到如上所述的植物的可收获的部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。同时进一步涉及植株收获后的其他衍生物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及由相关植物获得的食品或食品添加剂。

[0032] 本发明的优点：

[0033] （1）本发明采用比较转录组学的方法，创新性地对陆地棉（Gossypium hirsutum）中响应逆境胁迫、参与抗氧化调节过程的谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）GhGPX5和GhGPX13（合称GhGPX5/13）进行了克隆。构建原核表达载体6P1‑GhGPX5/13，将重组载体转化至大肠杆菌表达感受态细胞Rosette(DE3)中，诱导GST‑GhGPX5/13大量表达并进行纯化，结果显示GhGPX5/13具有过氧化物酶活性和氧化还原状态。进一步构建GhGPX5/13基因沉默载体TRV2‑GPX5/13，利用农杆菌侵染棉花叶片的方法将含有TRV2‑GPX5/13的农杆菌注射棉花叶片，获得GPX5/13沉默的植株，结果表明基因沉默植株在高盐胁迫下叶片萎蔫严重，黄化现象严重，表明对高盐处理更为敏感。接着构建GPX5/13的过表达载体p35S‑GhGPX5‑GFP和p35S‑GhGPX13‑GFP，利用农杆菌花序侵染法转化野生型拟南芥（Clo‑0，WT），获得过表达植株，分析结果表明在高盐胁迫下，相对于野生型，GhGPX5/13能够提高种子萌发率。为作物耐盐分子育种提供基因资源。

[0034] （2）可以通过转基因的方式来获得耐盐性的植株，具体地，可以通过将GhGPX5/13基因导入目的植物，得到转基因植物，该植株耐盐性高于目的植物，为植物耐盐育种提供一种新的途径。

附图说明

[0035] 图1是 GhGPX5和GhGPX13 CDS序列和所编码氨基酸序列比对分析；图1A显示GhGPX5和GhGPX13的CDS序列，仅存在七个位点的差异；图1B显示BGhGPX5和GhGPX13所编码的氨基酸仅存在三个位点差异；

[0036] 图2是 GhGPX5/13蛋白的酶活性和氧化还原状态分析；图3A显示高盐胁迫诱导表达的标志基因GhERF38的表达量在盐胁迫处理8 h时上升到10倍以上，在盐胁迫处理12 h时上升到15倍；图3B显示在盐胁迫处理12 h时，GhGPX5/13的表达量升高到2.5倍；图4A显示在农杆菌侵染7天后，作为阳性对照组的转化TRV::GhCLA（TRV::00）植株出现叶片白化的表型；图4B显示创制GPX5/13沉默的不同植株中GPX5/13的表达水平；

[0037] 图3是盐胁迫条件下GhERF38和GhGPX5/13基因表达水平分析；

[0038] 图4是 GhGPX5/13基因沉默植株中GhGPX5/13表达水平分析；图4A显示在农杆菌侵染7天后，作为阳性对照组的转化TRV::GhCLA（TRV::00）植株出现叶片白化的表型；图4B显示创制GPX5/13沉默的不同植株中GPX5/13的表达水平；

[0039] 图5是盐胁迫下棉花GhGPX5/13沉默植株（TRV::GPX5/13）和正常植株（TRV::00）表型对比；

[0040] 图6是盐胁迫下棉花GhGPX5/13沉默植株和正常植株表型，生理指标及酶活性分析；图6A显示GhGPX5和GhGPX13的共同沉默使叶片出现数量较多的黄斑，严重的部位呈现大面积的黄化现象；图6B显示高盐处理后的叶片中棕褐色沉积物明显较对照组（H2O浸泡）的叶片中多，而且，TRV::GPX5/13叶片出现大面积的棕褐色部位，其染色程度较TRV::00更深；

[0041] 图6C显示高盐胁迫造成TRV::GPX5/13叶片中过量H2O2的积累；图6D显示高盐处理后的叶片中蓝色沉积物明显增多；图6E显示相对于TRV::00叶片，TRV::GPX5/13植株的叶片中蓝色部位明显增多；图6F显示在高盐处理条件下，叶片中H2O2和超氧阴离子的含量增加；

[0042] 图6G显示与TRV::00相比，TRV::GPX5/13叶片中H2O2和超氧阴离子的含量更高；图6H显示与TRV::00相比，TRV::GPX5/13叶片中积累了更多的MDA；图6I和图6J显示GPX5/13基因沉默导致叶片内CAT和SOD的活性较TRV::00叶片中酶活性更低；

[0043] 图7是 GhGPX5和GhGPX13转基因拟南芥表达水平分析和荧光检测结果；图7A显示GhGPX5的表达量在2个不同株系中上调了约40倍；图7B显示GhGPX13的表达量在2个不同株系中上调了超过50倍；图7C显示在GhGPX5和GhGPX13转基因植株的根部，均能检测到GFP荧光；

[0044] 图8是高盐胁下过表达GhGPX5和GhGPX13拟南芥种子萌发率和幼苗生长状况分析；图8A显示过表达GhGPX13的种子萌发率大于70%，而WT的种子萌发率不超过30%；图8B显示过表达GhGPX5和GhGPX13的萌发率超过90%，而WT的种子萌发率约为70%；图8C显示过表达GhGPX5的种子萌发率接近100%，过表达GhGPX13的萌发率约为90%，而WT的种子萌发率不到
70%；图8D显示过表达GhGPX5的种子萌发率接近80%，过表达GhGPX13的萌发率约为60%，而WT的种子萌发率不到20%；图8E显示在不同浓度盐处理条件下，过表达GhGPX5和GhGPX13的幼苗长势明显较WT好，表现为其生长相对于WT对高盐胁迫不敏感；

[0045] 图9是高盐胁下过表达GhGPX5和GhGPX13拟南芥植株生长状况分析。

具体实施方式

[0046] 下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

[0047] 若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。

[0048] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

[0049] 除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、DNA重组及生物信息学技术。这些技术均在已经公开的文献中进行了充分解释，另外，本发明所采用的DNA提取、系统发育树的构建、基因编辑方法、基因编辑载体的构建、基因编辑植物获得等方法，除了下述实施例采用的方法外，采用现有文献中已经公开的方法均能实现。

[0050] 此处使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”术语意思是指包括分离的DNA分子(例如，cDNA或者基因组DNA)，RNA分子(例如，信使RNA)，自然类型，突变类型，合成的DNA或RNA分子，核苷酸类似物组成的DNA或RNA分子，单链或是双链结构。这些核酸或多聚核苷酸包括基因编码序列、反义序列及非编码区的调控序列，但不仅限于此。这些术语包括一个基因。“基因”或“基因序列”广泛用来指一有功能的DNA核酸序列。因此，基因可能包括基因组序列中的内含子和外显子，和/或包括cDNA中的编码序列，和/或包括cDNA及其调控序列。在特殊实施方案中，例如有关分离的核酸序列，优先默认其为cDNA。

[0051] 生物材料

[0052] 棉花TM‑1种子为实验室保存；拟南芥Col‑0种子为实验室保存；

[0053] 原核表达载体pGEX6P1；基因沉默载体空载体和阳性对照载体TRV::GhCLA为实验室保存；过表达载体pSuper‑1300‑GFP为实验室保存；

[0054] 大肠杆菌DH5α和农杆菌GV3101为实验室保存；

[0055] 引物合成及测序，由郑州擎科生物公司完成。

[0056] 实验试剂

[0057] RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购买自诺唯赞生物科技有限公司；

[0058] NaCl等常用试剂购买自索莱宝公司；

[0059] 潮霉素购买自索莱宝生物公司；

[0060] MS培养基购买自北京酷来搏科技有限公司；

[0061] 各种核酸内切酶购买自莫纳生物科技有限公司；

[0062] 一步克隆酶购买自诺唯赞生物科技有限公司；

[0063] 质粒小量提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购买自北京天根生物技术有限公司。

[0064] 实验设备

[0065] PCR仪购买自Bio‑rad公司；

[0066] 制冷离心机购买自Eppendorf公司；

[0067] 定量PCR仪购买自Bio‑rad公司；

[0068] 激光共聚焦显微镜购买自蔡司公司；

[0069] 高温高压灭菌器MLS‑3750购买自日本三洋公司；

[0070] 核酸检测仪Nanodrop 2000C购买自Thermo Scientific公司；

[0071] 常温离心机、酶标仪SpectraMax iD5购买自Thermo Scientific公司。

[0072] 实施例1 GhGPX5/13基因的克隆及其氨基酸序列分析

[0073] 提取生长15天的陆地棉TM‑1的RNA，以反转录反应获得的cDNA为模板，由NCBI数据库中获得的基因序列经Primer Premier5.0设计特异性引物经过PCR反应，分别克隆GhGPX5/13二个基因的编码序列，经Translate（https://www.expasy.org/resources/在线工具将核酸序列转化为蛋白质序列。进一步地，利用DNAMAN软件对GhGPX5/13基因序列和所编码蛋白质序列进行比对。

[0074] 结果表明，棉花谷胱甘肽过氧化物酶GhGPX5/13基因的编码序列，均包含702 bp碱基。所编码的蛋白均包括233个氨基酸。GhGPX5和GhGPX13的CDS序列，仅存在七个位点的差异（图1A），所编码的氨基酸仅存在三个位点差异（图1B），同源性较高。

[0075] 实施例2 表达载体pGEX6P1‑GhGPX5/13的构建

[0076] 为了探究GhGPX5/13蛋白的特性，发明人分别构建了原核表达载体pGEX6P1‑GhGPX5/13，具体过程简要介绍如下。

[0077] 首先，设计带有限制性内切酶EcoR Ⅰ酶切位点的的引物，序列如下:

[0078] 6P1‑X5‑F：5'‑GGGATCCCCGGAATTCATGCTCGTTCGACGAAAT‑3'

[0079] 6P1‑X5‑R：5'‑GTCGACCCGGGAATTCGCCAAGCAGTTTCTTTAT‑3'

[0080] 6P1‑X13‑F：5'‑GGGATCCCCGGAATTCATGCTCGTTCGACGAAATCT‑3'

[0081] 6P1‑X13‑R：5'‑GTCGACCCGGGAATTCCGTATCCACTCCCAATGCTT‑3'

[0082] 然后，以实例1制备的cDNA样品为模板，进行PCR扩增，并纯化回收扩增产物；

[0083] 第三，对PGEX6P1载体采用EcoR Ⅰ进行单酶切，对酶切产物进行纯化。

[0084] 第四，把PCR扩增产物和酶切后的载体进行同源重组连接，构建6p1‑GhGPX5/13表达载体；

[0085] 第五，采用热激转化法，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，进行A（氨苄霉素，50 μg/mL）抗性筛选，选择阳性菌落进行PCR检测，对PCR检测鉴定正确菌落进行扩增、送测序，测序正确的菌液提取质粒备用。

[0086] 第六，将所提取的质粒转化至大肠杆菌表达感受态细胞Rosette(DE3)中，诱导GST‑GhGPX5/13大量表达并进行纯化，获得GhGPX5/13蛋白。

[0087] 在H2O2存在的条件下，以Trx为底物检测纯化的GhGPXs是否具有过氧化物酶活性。结果发现，GhGPX5/13具有过氧化物酶活性（图2）。为了进一步分析GhGPX5/13是否具有氧化还原状态的特征，以β‑巯基乙醇（β‑ME），二硫苏糖醇（DTT）和H2O2处理纯化到的GhGPX5/13蛋白，通过聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS‑PAGE）分析，发现具有过氧化物酶的GhGPX5/13均具有氧化还原状态。

[0088] 实施例3 沉默GhGPX5/13基因验证其在棉花盐胁迫耐受性中的功能

[0089] 为了分析GhGPX5/13是否参与棉花响应高盐胁迫的过程，首先，分析了高盐胁迫条件下GhGPX5/13的表达模式。以400 mM NaCl溶液浸泡生长18天的野生型棉花植株TM‑1，分别于0 h，2 h，4 h，8 h，12 h和24 h对叶片进行取样，通过实时荧光定量PCR（qRT‑PCR）检测GhGPX5/13（GhGPX5/13的同源性较高，根据其保守序列设计一对引物能同时检测二个基因的表达水平）的表达水平。

[0090] 结果发现，高盐胁迫诱导表达的标志基因GhERF38的表达量在盐胁迫处理8 h时上升到10倍以上，在盐胁迫处理12 h时上升到15倍（图3A），表明棉花幼苗确实受到高盐胁迫的处理；在盐胁迫处理12 h时，GhGPX5/13的表达量升高到2.5倍（图3B）。这一结果暗示，GhGPX5/13可能参与调节棉花对高盐胁迫的响应过程。

[0091] 为了深入研究GhGPX5/13在陆地棉对高盐响应中的功能，针对GhGPX5/13的保守区域，利用病毒诱导的基因沉默（virus‑induced gene silencing, VIGS）体系，发明人构建了GhGPX5/13的基因沉默载体TRV2‑GPX5/13，获得了GPX5/13沉默的棉花植株（GhGPX5/13的同源性较高，构建的TRV2‑GPX5/13载体能同时沉默二个基因。）。具体过程简要介绍如下。

[0092] 第一，设计带有限制性内切酶EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切位点的的引物，序列如下：

[0093] TRV2‑GPX5/13‑F：GTGAGTAAGGTTACCGAATTCGAGTCCTCCAAGGGGTCAGTT

[0094] TRV2‑GPX5/13‑R：GAGACGCGTGAGCTCGGTACCACCTTTGCTAGCCTTCAGGAA

[0095] 第一，以实例1制备的cDNA样品为模板，进行PCR扩增，并纯化回收扩增产物；

[0096] 第三，对TRV2载体采用EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ进行双酶切，对酶切产物进行纯化；

[0097] 第四，把PCR扩增产物和酶切后的载体进行同源重组连接，构建TRV2‑GhGPX5/13表达载体；

[0098] 第五，采用热激转化法，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，进行K+（卡那霉素，50 μg/mL）抗性筛选，选择阳性菌落进行PCR检测，对PCR检测鉴定正确菌落进行扩增、送测序，测序正确的菌液提取质粒备用。

[0099] 第六，将所提取的质粒转化至农杆菌感受态细胞GV3101中，‑80℃保存备用。

[0100] 第七，利用农杆菌侵染棉花叶片的方法将含有TRV2‑GPX5/13、TRV2、TRV‑CLA、TRV1的农杆菌注射棉花叶片，获得GPX5/13沉默的植株。

[0101] 结果显示在农杆菌侵染7天后，作为阳性对照组的转化TRV::GhCLA（TRV::00）植株出现叶片白化的表型（图4A），表明基因沉默体系发挥了作用。通过qRT‑PCR实验检测VIGS体系创制GPX5/13沉默的不同植株中GPX5/13的表达水平，结果显示，所检测的6株棉花幼苗中，1、2、3和6号植株的GPX5/13的表达水平为对照组的1/5，而3和4号植株中GPX5/13的表达水平仅为对照组的1/10（图4B），这些结果表明，成功创制了GPX5/13沉默植株。

[0102] 在前述实例4结果分析基础上，用含有400 mM NaCl的水溶液处理基因沉默植株TRV::GPX5/13和TRV::00，处理8天后TRV::00植株叶片仍为绿色，而TRV::GPX5/13植株叶片萎蔫严重（图5）。这一结果表明表明GhGPX5/13正调控棉花对高盐胁迫的耐受性。

[0103] 在前述结果分析基础上，将创制的基因沉默植株TRV::GPX5/13和TRV::00的第二片真叶分别浸泡在H2O和含有400 mM NaCl的水溶液中，24 h后水中浸泡的叶片仍为绿色，而高盐溶液中浸泡的叶片出现了不同程度的黄斑，表现为TRV::00叶片出现少数黄斑，而TRV::GPX5/13叶片上出现数量较多的黄斑，严重的部位呈现大面积的黄化现象（图6A）。这表明GhGPX5和GhGPX13的共同沉默使叶片的耐受高盐胁迫的能力显著降低。

[0104] 为了分析高盐胁迫下TRV::GPX5/13和TRV::00植株叶片内活性氧的水平，对高盐处理12 h后TRV::GPX5/13和TRV::00的第二片真叶进行DAB（3,3‑二氨基联苯胺四盐酸盐）染色，结果发现，高盐处理后的叶片中棕褐色沉积物明显较对照组（H2O浸泡）的叶片中多，而且，TRV::GPX5/13叶片出现大面积的棕褐色部位，其染色程度较TRV::00更深（图6B），表明高盐胁迫下TRV::GPX5/13叶片积累更多的H2O2。

[0105] 以Image J分别取不同叶片的相同部位，对叶片染色程度的定量结果也表明高盐胁迫造成TRV::GPX5/13叶片中过量H2O2的积累（图6C）。此外，以NBT（氯化硝基四氮唑蓝）染色分析叶片中超氧阴离子的积累量，结果发现，高盐处理后的叶片中蓝色沉积物明显增多（图6D），而相对于TRV::00叶片，TRV::GPX5/13植株的叶片中蓝色部位明显增多，对染色部位定量分析也验证了这一结果（图6E）。这些结果表明，GPX5/13三个基因的沉默导致高盐处理下TRV::GPX5/13植株积累更多的活性氧，从而对叶片造成更多的损害，表现为叶片黄化程度较深，对高盐处理更为敏感。

[0106] 为了分析高盐处理下叶片中TRV::GPX5/13和TRV::00植株叶片中H2O2和超氧阴离子的水平，我们检测了高盐胁迫下H2O2和超氧阴离子的含量。结果发现，在高盐处理条件下，叶片中H2O2和超氧阴离子的含量增加，而与TRV::00相比，TRV::GPX5/13叶片中H2O2和超氧阴离子的含量更高（图6F，G），这一结果与DAB和NBT染色的结果一致。

[0107] 为了进一步分析高盐胁迫下细胞内活性氧的水平，我们检测了叶片中丙二醛（MDA）的含量，结果显示，高盐胁迫导致叶片中积累较多的MDA，而与TRV::00相比，TRV::GPX5/13叶片中积累了更多的MDA（图6H）。MDA是衡量氧化胁迫程度的常用指标之一，能反映植物膜脂过氧化的程度，MDA的过量积累，表明在高盐胁迫条件下，GPX5/13基因沉默导致叶片细胞膜脂过氧化程度更高。此外，为了分析其它清除活性氧的酶对细胞内活性氧水平的影响，我们分别检测了叶片中过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性。结果表明，与对照组相比，高盐处理降低了CAT和SOD的活性，而且，GPX5/13基因沉默导致叶片内CAT和SOD的活性较TRV::00叶片中酶活性更低（图6I，J）。这一结果表明，高盐胁迫条件下，TRV::
GPX5/13叶片积累过量的活性氧，一方面是由于GPX5/13表达量下调导致，另一方面是由于叶片中CAT和SOD的活性降低造成的。

[0108] 实施例4 过表达拟南芥验证GhGPX5/13基因在拟南芥盐胁迫耐受性中的功能[0109] 为了进一步分析GPX5/13的功能，发明人分别构建了GPX5/13的过表达载体p35S‑GhGPX5‑GFP和p35S‑GhGPX13‑GFP，获得了过表达拟南芥植株。具体过程简要介绍如下。

[0110] 第一首先，设计带有限制性内切酶Sal Ⅰ酶切位点的的引物，序列如下：

[0111] 1300‑GPX5‑F：5' ‑GGGGCCCGGGGTCGACATGCTCGTTCGACGAAAT‑3'

[0112] 1300‑GPX5‑R：5' ‑GTATTTAAATGTCGACGGCCAAGCAGTTTCTTTAT‑3'

[0113] 1300‑GPX13‑F：5' ‑GGGGCCCGGGGTCGACATGCTCGTTCGACGAAATCT‑3'

[0114] 1300‑GPX13‑R：5' ‑GTATTTAAATGTCGACGGCCAAGCAGTTTCTTTATAT‑3'

[0115] 然后，以实例1制备的cDNA样品为模板，进行PCR扩增，并纯化回收扩增产物；

[0116] 第三，对1300‑GFP载体采用Sal Ⅰ进行单酶切，对酶切产物进行纯化。

[0117] 第四，把PCR扩增产物和酶切后的载体进行同源重组连接，构建1300‑GhGPX5/13过表达载体；

[0118] 第五，采用热激转化法，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，进行K+（卡那霉素，50 μg/mL）抗性筛选，选择阳性菌落进行PCR检测，对PCR检测鉴定正确菌落进行扩增、送测序，测序正确的菌液提取质粒备用。

[0119] 第六，将所提取的质粒转化至农杆菌感受态细胞GV3101中，‑80℃保存备用。

[0120] 第七，利用农杆菌花序侵染法转化野生型拟南芥（Clo‑0，WT），将收获的种子在含有潮霉素的MS培养基上筛选，对潜在的转基因植株单株收获种子，再次在含有潮霉素的培养基上筛选，直至T3代筛选获得潜在的纯合转基因植株。

[0121] 利用qRT‑PCR分别分析潜在转基因植株中GhGPX5和GhGPX13的表达水平。结果发现，在GhGPX5潜在转基因植株中，在GhGPX5潜在转基因植株中，GhGPX5的表达量在2个不同株系中上调了约40倍（图7A），在GhGPX13潜在转基因植株中，GhGPX13的表达量在2个不同株系中上调了超过50倍（图7B）。通过激光共聚焦显微镜观察过表达拟南芥根部GFP荧光，结果表明，所筛选到的GhGPX5和GhGPX13转基因植株的根部，均能检测到GFP荧光（图7C）。这些结果表明，所构建的GhGPX5和GhGPX13转基因拟南芥分别为GhGPX5‑GFP和GhGPX13‑GFP过表达植株。

[0122] 高盐胁迫能抑制种子的萌发，为了进一步分析GhGPX5和GhGPX13是否参与调控高盐胁迫抑制种子萌发的过程，我们将WT、过表达GhGPX5和GhGPX13拟南芥种子分别播种在含有不同浓度NaCl（0 mM、50 mM、100 mM和150 mM）的MS培养基上，在4°C低温处理3 d，然后放置于12h光照/12h黑暗的温室（21°C）中，每间隔12 h于体式显微镜下统计种子的萌发情况。

[0123] 结果表明，在MS培养基上生长的过表达种子萌发率在24 h与36 h时明显高于WT，表现为36 h时过表达GhGPX5的种子萌发率接近100%，过表达GhGPX13的种子萌发率大于70%，而WT的种子萌发率不超过30%（图8A）；不同浓度的NaCl处理明显抑制了种子的萌发，而且，随着MS培养基中NaCl浓度升高，抑制种子萌发的效果更加显著。在含有50 mM的MS培养基上生长36 h的种子，过表达GhGPX5和GhGPX13的萌发率超过70%，而WT的种子萌发率不到
20%，生长60 h后，过表达GhGPX5和GhGPX13的萌发率超过90%，而WT的种子萌发率约为70%（图8B）。

[0124] 在含有100 mM的MS培养基上生长48 h的种子，过表达GhGPX5和GhGPX13的萌发率超过60%，而WT的种子萌发率约为10%，生长72 h后，过表达GhGPX5的种子萌发率接近100%，过表达GhGPX13的萌发率约为90%，而WT的种子萌发率不到70%（图8C）；在含有150 mM的MS培养基上生长60 h的种子，过表达GhGPX5和GhGPX13的萌发率约为30%，而WT的种子萌发率约为5%，生长72 h后，过表达GhGPX5的种子萌发率接近80%，过表达GhGPX13的萌发率约为60%，而WT的种子萌发率不到20%（图8D）。

[0125] 这些结果表明，在拟南芥中过表达GhGPX5和GhGPX13可以促进高盐胁迫下种子的萌发。观察生长8天后的种子发现，在不同浓度盐处理条件下，过表达GhGPX5和GhGPX13的幼苗长势明显较WT好，表现为其生长相对于WT对高盐胁迫不敏感（图8E）。

[0126] 此外，用含有200 mM NaCl的水溶液处理生长25天的拟南芥WT和过表达GhGPX5和GhGPX13转基因植株，结果发现，高盐胁迫7天后，在对照组中（不含NaCl的水处理），过表达GhGPX5和GhGPX13转基因植株与WT没有明显的区别，而高盐胁迫明显抑制了过表达GhGPX5和GhGPX13转基因植株和WT的生长，表现出较小的莲座叶，而且，WT的叶片出现明显的黄化现象，与WT相比较，过表达GhGPX5和GhGPX13转基因植株未出现黄化的叶片（图9），表现出了更强的高盐耐受性。

[0127] 综上，沉默GhGPX5/13基因后棉花的盐胁迫耐受性降低，表明GhGPX5/13基因正调控棉花对高盐胁迫的耐受性；而过表达拟南芥后其盐胁迫耐受性提高，同样表明，GhGPX5/13基因正调控拟南芥对高盐胁迫的耐受性。可见，GhGPX5/13基因在调控植物高盐胁迫方面起着重要的作用，对于培育能够抵御外界胁迫条件的棉花品种具有重要的意义。

[0128] 以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。