一种高效分离并检测D-丝氨酸中有关物质的高效液相色谱法

摘要

本发明提供一种高效分离并检测D‑丝氨酸中有关物质的高效液相色谱法，D‑丝氨酸可以作为拉考沙胺等多个药物的起始物料，对其杂质的研究与控制可以保证终产品的质量和患者用药安全，具有重要的产业价值。本发明的方法采用优选的亲水色谱柱，实现了D‑丝氨酸的制备相关杂质以及二聚体杂质等多个常规方法难以分离的化合物的有效分离。

权利要求

1.一种高效分离并检测D‑丝氨酸及其有关物质的高效液相色谱法，其中色谱柱为Ultimate HILIC Silica 4.6×250mm 5μm，流动相由A相和B相组成，所述A相为浓度为10‑

30mmol/L缓冲盐水溶液，B相为乙腈，采用等度洗脱程序，A相和B相的体积比为13‑17：87‑

83，紫外检测器的检测波长为180nm‑220nm，流动相的流速为1.1ml/min‑1.3ml/min，色谱柱柱温为28℃‑32℃，进样体积为1μl‑20μl，所述缓冲盐水溶液选自甲酸铵缓冲液、乙酸铵缓冲液、磷酸铵缓冲液、磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钠缓冲液的任一种或其组合，所述有关物质选自有关物质1、有关物质2、有关物质3和有关物质4的任一种或其组合。

2.根据权利要求1所述的高效液相色谱法，所述缓冲盐水溶液用pH调节剂调节pH，所述pH调节剂选自甲酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸的任一种或其组合。

3.根据权利要求2所述的高效液相色谱法，所述A相为20mmol/L乙酸铵，所述乙酸铵用甲酸调节pH至3.0。

4.根据权利要求1所述的高效液相色谱法，所述有关物质的出峰顺序依次为有关物质

1、有关物质2、D‑丝氨酸、有关物质3和有关物质4，其中，各有关物质峰及D‑丝氨酸峰与相邻化合物峰的分离度均大于1.5。

5.根据权利要求1所述的高效液相色谱法，所述高效液相色谱法包括下述步骤：

1）溶液配制：

空白溶剂：水：流动相，且体积比为1:1；

供试品溶液：取供试品100mg，置10ml量瓶中，用5ml水溶解，流动相稀释至刻度，摇匀即得；

定位溶液：取有关物质1‑4各10mg，分别用水溶解并配制为0.5mg/ml的浓度；

混合溶液：称取供试品100mg，量取各杂质定位溶液各1ml，置同一10ml量瓶中，溶解，流动相稀释至刻度，摇匀即得；

2）以亲水色谱柱Ultimate HILIC Silica 4.6×250mm 5μm为固定相，流动相A为

20mmol/L乙酸铵，且所述乙酸铵用甲酸调节pH至 3.0，流动相B为乙腈，流动相A与B的体积比为15：85，进行等度洗脱，流动相流速为1.2ml/min，柱温为30℃，紫外检测器检测波长为

200nm，进样体积为10μl，记录色谱图。

6.根据权利要求1‑5任一项所述的高效液相色谱法在高效分离并检测D‑丝氨酸中的有关物质中的应用。

说明书

一种高效分离并检测D‑丝氨酸中有关物质的高效液相色谱法

技术领域

[0001] 本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种高效分离并检测D‑丝氨酸中有关物质的高效液相色谱法。

背景技术

[0002] 拉考沙胺（lacosamide，(2R)‑2‑(乙酰氨基)‑N‑苄基‑3‑甲氧基丙酰胺）为抗癫痫药物，包括片剂、注射剂和口服液。D‑丝氨酸是制备拉考沙胺的关键起始物料。

[0003]

[0004] CN107778190A公开了D‑丝氨酸的制备方法，先将甘氨酸、甲醛和辅酶投入反应釜中反应，连续降温保温，离心处理得到产物，控制了终产品的光学纯度、甲醛残留以及最大单杂和总杂等，但并未公开任何D‑丝氨酸相关杂质的结构、种类以及可行的分离检测方法。

[0005] IN2988MUM2011A公开了采用反相液相色谱法分离检测D‑丝氨酸中的L‑丝氨酸的方法，但需采用marfey试剂（Na‑（5‑氟‑2，4‑二硝基苯基）‑L‑丙氨酰胺））将待测分子衍生化前处理，才能将其有效分离。

[0006] 药品杂质分为工艺杂质（包括制备中未反应完全的反应物及试剂、中间体、副产物等）、降解产物、从反应物及试剂中混入的杂质等。对原料药起始物料的杂质分析与控制至关重要。D‑丝氨酸的相关杂质及分离检测方法未见报道，各国药典也未收载其质量标准。另外，本发明人在实践中发现，采用常规色谱分离方法无法实现D‑丝氨酸和其潜在有关物质的有效分离。为此，需要研究D‑丝氨酸杂质的分离与检测方法。

发明内容

[0007] 本发明的目的一方面在于提供一种高效分离并检测D‑丝氨酸及其有关物质的高效液相色谱法，其中色谱柱固定相为亲水色谱柱，流动相由A相和B相组成，所述A相为浓度为10‑30mmol/L缓冲盐水溶液，B相为乙腈，流动相为梯度洗脱或等度洗脱的任一种，A相和B相的体积比为5‑35：95‑65，紫外检测器的检测波长为180nm‑220nm，流动相的流速为0.8ml/min‑1.5ml/min，色谱柱柱温为10℃‑40℃，进样体积为1μl‑20μl，其中，所述亲水色谱柱选自Polar‑100、Polar‑Diol、Polar‑Silica、Polar‑Pyridine、Polar‑imidazole、TSKgel Amide、TSKgel NH2、Venusil HILIC、Merck ZIC、COSMOSIL HILIC、Ultimate HILIC Amphion、Ultimate HILIC NH2、Ultimate HILIC Silica、Ultimate HILIC Amide、SepaFlash HILIC的任一种或其组合。

[0008] 本发明优选的技术方案中，所述亲水色谱柱为Ultimate HILIC Silica 4.6×250mm 5μm。

[0009] 本发明优选的技术方案中，所述缓冲盐水溶液选自甲酸铵缓冲液、乙酸铵缓冲液、磷酸铵缓冲液、磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钠缓冲液的任一种或其组合。

[0010] 本发明优选的技术方案中，所述缓冲盐水溶液的浓度为15‑25mmol/L，优选为18‑23mmol/L。

[0011] 本发明优选的技术方案中，所述缓冲盐水溶液pH2.0‑4.0，优选pH2.5‑3.5，更优选pH2.7‑3.2。

[0012] 本发明优选的技术方案中，所述缓冲盐水溶液用pH调节剂调节pH，所述pH调节剂选自甲酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸的任一种或其组合。

[0013] 本发明优选的技术方案中，所述A相为20mmol/L乙酸铵（用甲酸调节pH3.0）。

[0014] 本发明优选的技术方案中，所述A相和B相的体积比为10‑25：90‑75，优选为15‑20：85‑80。

[0015] 本发明优选的技术方案中，所述流动相的流速为1.0ml/min‑1.3ml/min，优选为1.1ml/min‑1.2ml/min。

[0016] 本发明优选的技术方案中，所述色谱柱柱温为15℃‑35℃，优选为20℃‑30℃。

[0017] 本发明优选的技术方案中，所述紫外检测器的检测波长190nm‑210nm，优选为195nm‑205nm。

[0018] 本发明优选的技术方案中，进样体积为5μl‑15μl，优选为10μl‑12μl。

[0019] 本发明优选的技术方案中，所述有关物质选自有关物质1、有关物质2、有关物质3和有关物质4的任一种或其组合：

[0020]

[0021] 本发明优选的技术方案中，出峰顺序依次为有关物质1、有关物质2、D‑丝氨酸、有关物质3和有关物质4，其中，各有关物质峰及D‑丝氨酸峰与相邻化合物峰的分离度均大于1.5。

[0022] 本发明优选的技术方案中，所述高效液相色谱法包括下述步骤：

[0023] 1）溶液配制：

[0024] 空白溶剂：水：流动相（1:1）；

[0025] 供试品溶液：取供试品约100mg，置10ml量瓶中，用5ml水溶解，流动相稀释至刻度，摇匀即得；

[0026] 定位溶液：取有关物质1‑4各10mg，分别用水溶解并配制为0.5mg/ml的浓度；

[0027] 混合溶液：称取供试品约100mg，量取各杂质定位溶液各1ml，置同一10ml量瓶中，溶解，流动相稀释至刻度，摇匀即得；

[0028] 2）以亲水色谱柱为固定相（Ultimate HILIC Silica 4.6×250mm 5μm），流动相A为20mmol/L乙酸铵（用甲酸调节pH至2.9‑3.1），流动相B为乙腈，流动相A与B的体积比为13‑17：87‑83，进行等度洗脱，流动相流速为1.1‑1.3ml/min，柱温为28‑32℃，紫外检测器检测波长为200nm，进样体积为10μl，记录色谱图。

[0029] 本发明优选的技术方案中，所述高效液相色谱法包括下述步骤：

[0030] 1）溶液配制：

[0031] 空白溶剂：水：流动相（1:1）；

[0032] 供试品溶液：取供试品约100mg，置10ml量瓶中，用5ml水溶解，流动相稀释至刻度，摇匀即得；

[0033] 定位溶液：取有关物质1‑4各10mg，分别用水溶解并配制为0.5mg/ml的浓度；

[0034] 混合溶液：称取供试品约100mg，量取各杂质定位溶液各1ml，置同一10ml量瓶中，溶解，流动相稀释至刻度，摇匀即得；

[0035] 2）以亲水色谱柱为固定相（Ultimate HILIC Silica 4.6×250mm 5μm），流动相A为20mmol/L乙酸铵（用甲酸调节pH至 3.0），流动相B为乙腈，流动相A与B的体积比为15：85，进行等度洗脱，流动相流速为1.2ml/min，柱温为30℃，紫外检测器检测波长为200nm，进样体积为10μl，记录色谱图。

[0036] 本发明的另一目的在于提供本发明所述的分离并检测D‑丝氨酸及其有关物质的高效液相色谱法在用于高效分离并检测D‑丝氨酸中的有关物质中的应用。

[0037] 除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。

[0038] 与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：本发明的高效液相色谱法首次实现D‑丝氨酸中多个有关物质的高效分离与检测，包括D‑丝氨酸的制备相关杂质以及二聚体杂质等，并具有灵敏度高（杂质含量低至ng级）、重现性好、稳定性好、检测时间短（30min内）、成本更优等优点，实现起始物料丝氨酸及其制备药品（如拉考沙胺）的质量控制，显著提高制备药品（如拉考沙胺）的质量、收率及产率分离纯化的难度和成本，显著提高拉考沙胺的纯度、质量、用药安全有效性、产率和生产效率。

附图说明

[0039] 图1 对比例1的色谱图。

[0040] 图2 对比例2的色谱图。

[0041] 图3 对比例3的色谱图。

[0042] 图4 对比例4的色谱图。

[0043] 图5 实施例1的色谱图。

具体实施方式

[0044] 下面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是以下具体实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

[0045]  对比例1 D‑丝氨酸及有关物质的HPLC分离检测

[0046] 液相色谱仪：LC‑20A（岛津）

[0047] 色谱柱：IntertSustain AX‑C18(4.6×250,5um)（GL sciences公司）

[0048] 柱温：30℃

[0049] 流动相：水

[0050] 流速：0.5ml/min

[0051] 紫外检测器检测波长：200nm

[0052] 进样体积：10ul

[0053] 取D‑丝氨酸约1mg、有关物质3约1mg，置2ml小瓶，加2ml水溶解。精密量取10μl，将其注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱图见图1。

[0054] 结果显示：D‑丝氨酸与有关物质3重合，不能实现有效分离，无法控制产品质量。

[0055]  对比例2 D‑丝氨酸及有关物质的HPLC分离检测

[0056] 液相色谱仪：LC‑20A（岛津）

[0057] 色谱柱：waters XTerra RP C18(4.6×250,5um)（waters公司）

[0058] 柱温：35℃

[0059] 流动相：0.7%三氟乙酸水溶液

[0060] 流速：0.8ml/min

[0061] 检测器：蒸发光检测器（漂移管温度：55℃，氮气流速1.6ml/min）

[0062] 进样体积：10ul

[0063] 取D‑丝氨酸样品约1mg、有关物质2、3和4样品各约1mg，置2ml小瓶，加2ml水溶解。精密量取10μl，将其注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱图见图2。

[0064] 结果显示：D‑丝氨酸与有关物质2及有关物质3重合，不能实现有效分离，无法控制产品质量。

[0065]  对比例3 D‑丝氨酸及有关物质的HPLC分离检测

[0066] 液相色谱仪：LC‑20A（岛津）

[0067] 色谱柱：氨丙基键合硅胶色谱柱 4.6×250mm 5μm（GL sciences公司）

[0068] 柱温：35℃

[0069] 流动相：乙腈

[0070] 流速：1.2ml/min

[0071] 检测器：蒸发光检测器（漂移管温度：30℃，氮气流速1.6ml/min）进样体积：10ul[0072] 取D‑丝氨酸样品约1mg、有关物质2、3和4样品各约1mg，置2ml小瓶，加2ml水溶解。精密量取10μl，将其注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱图见图3。

[0073] 结果显示：D‑丝氨酸与有关物质3重合，另外有关物质2和有关物质4未出峰。

[0074]  对比例4 D‑丝氨酸及有关物质的HPLC分离检测

[0075] 液相色谱仪：LC‑20A（岛津）

[0076] 色谱柱：CROWNPAK CR(+) 4.0×150mm 5μm(大赛璐公司)

[0077] 柱温：0℃

[0078] 流动相：高氯酸的水溶液（9.5ml：1000ml）

[0079] 流速：0.2ml/min

[0080] 紫外检测器检测波长：200nm

[0081] 进样体积：10ul

[0082] 取D‑丝氨酸样品约1mg、有关物质1、2、3、4样品各约1mg，置2ml小瓶，加2ml水溶解。精密量取10μl，将其注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱图见图4。

[0083] 结果显示：D‑丝氨酸与有关物质2及4部分重合，另外有关物质1和有关物质3重合。

[0084] 实施例1 D‑丝氨酸及有关物质的HPLC分离检测

[0085] 液相色谱仪：LC‑20A（岛津）

[0086] 色谱柱：Ultimate Hilic Silica 4.6×250mm 5μm（月旭科技（上海）股份有限公司）

[0087] 柱温：30℃

[0088] 流动相：20mmol/L乙酸铵水溶液（用甲酸调节pH至3.0）：乙腈（15:85）[0089] 流速：1.2ml/min

[0090] 紫外检测器检测波长：200nm

[0091] 进样体积：10μl

[0092] 空白溶剂：水：流动相（1:1）

[0093] 供试品溶液：取供试品约100mg，置10ml量瓶中，用5ml水溶解，流动相稀释至刻度，摇匀即得，

[0094] 定位溶液：取有关物质1‑4各10mg，分别用水溶解并配制为0.5mg/ml的浓度，[0095] 混合溶液：称取供试品约100mg，量取各杂质定位溶液各1ml，置同一10ml量瓶中，溶解，流动相稀释至刻度，摇匀即得。

[0096] 照上述色谱条件，精密量取定位溶液和混合溶液各10μl，将其注入液相色谱仪，记录色谱图。混合溶液色谱图见图5。实验数据见表1。

[0097]

[0098]  结论：空白溶剂不干扰有关物质的检测。混合溶液：各杂质及主成分与相邻杂质的分离度的最小值为2.2，大于1.5。方法专属性良好。

[0099]  实施例2 D‑丝氨酸及有关物质的HPLC分离检测

[0100] 在实施例1色谱条件的基础上，改变部分色谱条件。

[0101] 混合溶液的配制同实施例1。分离度结果见下表2。

[0102]

[0103] 结果表明：对实施例1的色谱条件做部分调整后，各成分分离度仍大于1.5，方法的耐用性良好。

[0104] 实施例3 D‑丝氨酸及有关物质的HPLC分离检测准确度

[0105] 取有关物质1‑4各约10mg，分别用水溶解并配制为约0.5mg/ml的浓度，作为有关物质储备液溶液。

[0106] Accu‑50%溶液：取D‑丝氨酸样品约100mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取有关物质储备液溶液各0.5ml，加水4ml使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀。平行制备3份。

[0107] Accu‑100%溶液：取D‑丝氨酸样品约100mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取有关物质储备液溶液各1ml，加水4ml使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀。平行制备3份。

[0108] Accu‑150%溶液：取D‑丝氨酸样品约100mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取有关物质储备液溶液各1.5ml，加水4ml使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀。平行制备3份。

[0109] 精密量取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪，结果见下表3。

[0110] 表3

[0111]

[0112]

[0113] 注:均回收率是指9份样品的回收率平均值。

[0114] 各有关物质回收率均在90% 110%之间，RSD均小于10%。该方法准确度良好。~

[0115]  实施例4 D‑丝氨酸及有关物质的HPLC分离检测定量限

[0116] D‑丝氨酸对照品储备液：取D‑丝氨酸对照品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀。

[0117] 定量限溶液：精密量取D‑丝氨酸对照品储备液0.28ml、实施例1的有关物质1‑4的定位溶液各0.07ml、0.06ml、0.28ml和0.06ml，置同一10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀即得。

[0118] 色谱条件同实施例1，定量限结果见下表4。

[0119] 。

[0120] 结果表明，各杂质S/N均大于10，满足检测要求，本发明的方法在各化合物低至ng级别即可完成定量检测。

[0121] 实施例5 拉考沙胺的制备

[0122] 。

[0123] 参考例5a：制备Boc‑D‑丝氨酸

[0124] 向3L三口瓶中加入100g D‑丝氨酸（有关物质1含量0.07%，有关物质2含量0.20%，有关物质3含量0.35%，有关物质4含量0.42%），分别加入水1L和四氢呋喃1L，碳酸氢钠400g，Boc酸酐250g，40 50℃反应24小时，过滤，滤液调节pH值至1 2，使用乙酸乙酯500ml萃取两~ ~次，合并有机相，有机相使用500ml饱和食盐水洗，有机相减压浓缩至干，加入甲苯500ml搅拌结晶过夜，过滤，40 50℃干燥得到白色粉末166g，收率85%。
~

[0125] 参考例5b：制备（R）‑2‑叔丁氧羰基氨基‑3‑羟基‑N苄基丙酰胺

[0126] 向3L三口瓶中依次加入1640g的二氯甲烷、166g的Boc‑D‑丝氨酸和89.4g的三乙胺，降温至‑20 ‑10℃，滴加氯甲酸正丁酯120.9g，滴加完毕后保温搅拌30min，控制温度‑20~‑10℃滴加86.13g的苄胺，反应完毕后升温至室温，滴加稀盐酸调节pH值至2 3，分液，有机~ ~
相使用饱和碳酸氢钠330ml洗涤，有机相减压浓缩，得到淡黄色油状物262g，直接投下一步。

[0127] 参考例5c：制备（R）‑2‑叔丁氧羰基氨基‑3‑甲氧基‑N苄基丙酰胺

[0128] 向3L反应瓶中加入2200g的二氯甲烷和792.8g的氢氧化钠溶液（80.8g的氢氧化钠溶于712的水中），降温至0 10℃，分别加入加入上步骤中间体262g，和304g的硫酸二甲酯，0~10℃保温反应，反应完毕后室温至20 30℃，加入氨水调节pH值至8 9，保温2小时，分液，有~ ~ ~
机相使用270g的水洗，减压浓缩，得到淡黄色油状物265g，直接投下一步。

[0129] 参考例5d：制备拉考沙胺

[0130] 10L反应瓶中依次加入680g的二氯甲烷和217g的盐酸，加入上步全部的中间体，控制温度20 30℃反应，反应完全后分出有机相，有机相使用260g的水萃取，合并水相，加入水~780g，加入二氯甲烷3200g，降温至‑5 5℃，使用碳酸钾调节pH值至8 9，滴加82.0g的乙酸~ ~
酐，反应完毕后升温至室温，分出有机相，水相使用520g的二氯甲烷萃取两次，合并有机相，有机相使用500ml的饱和食盐水洗，减压浓缩至干，加入乙酸乙酯1950g，加热至70 80℃，溶~
解后加入活性炭12g，热滤，滤液缓慢降温至0 5℃，过滤，40 60℃干燥后得到白色结晶性样~ ~
品151.8g，收率75%，HPLC检测纯度99.6%，其中杂质I含量0.21%，杂质II含量0.17%。

[0131]

[0132]

[0133] 以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明做出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。