一株降硫酵母菌及其在果蔬脱硫中的应用

摘要

本发明公开了一株降硫酵母菌及其在果蔬脱硫中的应用，属于微生物领域。本发明公开了一株降硫酵母(Meyerozyma caribbica）GAADS 0917，保藏号为GDMCC NO：62855。本发明将降硫酵母GAADS 0917应用于热杀菌果汁中降解挥发性硫化物，从而降低果汁中由挥发性硫化物导致的“蒸煮”异味，可用于改善果汁风味品质，提高消费者的可接受度，具有广阔的应用前景。

权利要求

1.一株卡利比克迈耶氏酵母（Meyerozyma caribbica）GAADS 0917，已于2022年10月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62855。

2.含有权利要求1所述卡利比克迈耶氏酵母GAADS 0917的微生物制剂。

3.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中卡利比克迈耶氏

7 7

酵母GAADS 0917的数量≥1×10CFU/mL或1×10CFU/mg。

4.根据权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂是所述卡利比克迈耶氏酵母GAADS 0917的细胞培养液。

5.根据权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂的制备方法包括：将所述卡利比克迈耶氏酵母GAADS 0917在培养基中培养一段时间，收集含所述卡利比克迈耶氏酵母GAADS 0917菌体细胞的细胞培养液直接作为微生物制剂，或将所述菌体细胞经洗涤、冻干处理获得微生物制剂。

6.一种降低荔枝汁中含硫化合物含量的方法，其特征在于，将权利要求1所述的卡利比克迈耶氏酵母GAADS 0917加入至所述荔枝汁中，使卡利比克迈耶氏酵母GAADS 0917的菌浓6

度≥1×10CFU/mL，于25 35℃发酵2 8 h；所述含硫化合物为二甲基硫醚、3‑甲硫基丙醛、~ ~二甲基二硫醚、二甲基三硫醚中的一种或多种。

7.权利要求1所述的卡利比克迈耶氏酵母GAADS 0917或权利要求2 5任一所述的微生~物制剂在降解含硫化合物方面的应用；所述含硫化合物为二甲基硫醚、3‑甲硫基丙醛、二甲基二硫醚、二甲基三硫醚中的一种或多种。

说明书

一株降硫酵母菌及其在果蔬脱硫中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株降硫酵母菌及其在果蔬脱硫中的应用，属于微生物领域。

背景技术

[0002] 荔枝是我国最具特色的热带、亚热带水果之一，含有丰富的营养，独特的风味，深受消费者的喜爱。中国是荔枝生产大国，面积与产量均居世界第一，分别约占世界总种植面积和产量的70%和65%。因荔枝成熟期集中，保鲜技术难以攻克，每年因腐烂变质造成的损失率达25 30％左右，因此荔枝深加工对荔枝产业健康发展至关重要。~

[0003] 果汁营养价值高，富含维生素、矿物质和纤维素，具有抗氧化、促进肠胃功能和降低心血管疾病等功效，深受消费者的喜爱。热杀菌处理因具有良好的钝酶、杀菌效果，是果汁加工领域应用最为普遍的技术手段。但荔枝是典型热敏性水果的代表，当加热温度超过55℃，就会出现明显的“蒸土豆/煮白菜味”，并且随着加热温度的升高和时间的延长，蒸煮异味增强，“蒸土豆/煮白菜味”会变成“大蒜/洋葱味”，后期甚至有臭鸡蛋味产生，显著降低了荔枝果汁的品质。我们前期研究发现四种挥发性硫化合物：二甲基硫醚（DMS）、3‑甲硫基丙醛（MTP）、二甲基二硫醚（DMDS）、二甲基三硫醚（DMTS）是热杀菌荔枝汁中“蒸土豆/煮白菜味”、 “大蒜/洋葱味”等“蒸煮”异味的主要贡献物质。

[0004] 针对热杀菌导致的果蔬汁异味问题，国内外学者常采用麦芽糊精包埋、脱气以及添加抑制剂（多酚、Vc）对异味进行控制。然而脱气处理的稳定性较低；麦芽糊精包埋更多用于果皮脱苦；多酚和Vc对异味抑制效果不佳。微生物转化是通过微生物细胞将复杂的底物进行结构修饰，也就是利用微生物代谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物特定部位（基因）进行的催化反应。生物脱硫技术是在20世纪90年代发展起来的，在国外已得到了广泛的研究，但其核心技术仍掌握在国外少数跨国公司手里，目前国内在生物脱硫方面的研究基础还比较薄弱。

发明内容

[0005] 本发明的目的是解决果蔬汁因加热杀菌产生的“热异味”的问题，提供一株可以高效降解挥发性硫化物的酵母菌菌株。

[0006] 本发明提供了一株卡利比克迈耶氏酵母（Meyerozyma caribbica）GAADS 0917，分类命名为Meyerozyma caribbica，已于2022年10月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62855，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

[0007] 本发明还提供含有所述卡利比克迈耶氏酵母GAADS 0917的微生物制剂。

[0008] 在一种实施方式中，所述微生物制剂中卡利比克迈耶氏酵母GAADS 0917的数量≥7 7
1×10CFU/mL或1×10CFU/mg。

[0009] 在一种实施方式中，所述微生物制剂是所述卡利比克迈耶氏酵母GAADS 0917的细胞培养液。

[0010] 在一种实施方式中，所述微生物制剂的制备方法包括：将所述卡利比克迈耶氏酵母GAADS 0917在培养基中培养一段时间，收集含所述卡利比克迈耶氏酵母GAADS 0917菌体细胞的细胞培养液，直接作为微生物制剂或经洗涤、冻干处理获得微生物制剂。

[0011] 本发明还提供所述卡利比克迈耶氏酵母GAADS 0917或所述微生物制剂在降解含硫化合物方面的应用。

[0012] 在一种实施方式中，所述含硫化合物包括但不限于二甲基硫醚（DMS）、3‑甲硫基丙醛（MTP）、二甲基二硫醚（DMDS）、二甲基三硫醚（DMTS）中的一种或多种。

[0013] 在一种实施方式中，所述应用是将所述卡利比克迈耶氏酵母GAADS 0917或所述微生物制剂加入至含有含硫化合物的环境中，于25 35 ℃处理一段时间。~

[0014] 在一种实施方式中，所述含有含硫化合物的环境包括但不限于果汁。

[0015] 在一种实施方式中，所述果汁包括但不限于巴氏灭菌（85℃，30 min）后的荔枝清汁。

[0016] 在一种实施方式中，所述应用是将所述卡利比克迈耶氏酵母GAADS 0917加入至果6
汁中，使卡利比克迈耶氏酵母GAADS 0917的菌浓≥1×10CFU/mL，在25 35 ℃发酵2 8 h。
~ ~

[0017] 在一种实施方式中，所述卡利比克迈耶氏酵母GAADS 0917是在麦芽汁培养基中培养一段时间后，转接至果汁中。

[0018] 有益效果：

[0019] 本发明提供了一种对二甲基硫醚（DMS）、3‑甲硫基丙醛（MTP）、二甲基二硫醚（DMDS）、二甲基三硫醚（DMTS）等多种挥发性硫化物都具有很好降解能力的非酿酒酵母，能更广泛地应用于热杀菌果汁中挥发性硫化物的降解，从而降低果汁中由挥发性硫化物导致的“蒸煮”异味，使其更容易被消费者接受。本发明所提供的酵母应用于荔枝果汁的降硫处理中，还能增加荔枝汁的特征香气成分，从而显著改善荔枝果汁的风味品质，同时具有处理方法简单，成本低等优点。

[0020] 生物材料保藏

[0021] 卡利比克迈耶氏酵母（Meyerozyma  caribbica）GAADS  0917，分类命名为Meyerozyma caribbica，已于2022年10月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62855，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

附图说明

[0022] 图1 为酵母菌株接种6 h后对荔枝汁风味感官评价图。

[0023] 图2为酵母菌GAADS 0917及同批筛选的其它菌株模版DNA的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。

[0024] 图3为菌株GAADS 0917降解麦芽汁培养基中硫化物的GC‑MS图。

[0025] 图4为菌株GAADS 0917与相同属种菌的降解荔枝汁中硫化物的效果对比图。

具体实施方式

[0026] 以下结合具体实施例对本发明进行详细说明。

[0027] 实施例1菌株的筛选分离

[0028] 以新鲜、未经防腐处理的荔枝表皮为原料，筛选具有降解荔枝“蒸煮”异味的菌株，确定6株对热杀菌荔枝汁的风味具有改善作用的菌株，经感官分析、GC‑MS检测最终确定GAADS 0917具有较强的降解热杀菌荔枝汁 “蒸煮”异味的作用，筛选分离过程如下：

[0029] 将10 mL 荔枝汁样品于 90 mL 的生理盐水中，于 30℃下恒温摇床培养3 h，得到荔枝菌悬液，并进行梯度稀释，每个梯度平行三组。在超净工作台中，吸取每组菌悬液各 100 uL，于麦芽汁培养基上进行均匀涂布并标记，后于 30℃培养箱中恒温培养，培养一定的时间后，从平板中挑取形态不同的菌落于新的相对应的培养基上进行平板划线，继续 30℃ 下培养 2天后观察所生长的菌落大小、形态特征，重复以上操作，直至平板上的菌落大小、形态特征一致，用石炭酸复红染液染色后镜检，确定其纯化，得到纯培养物。纯化后的菌株用接种针从培养好的平板上取菌块4‑7环（带少量培养基），接入菌株保藏管中，拧紧盖子，充分剧烈震荡，置于‑80℃冰箱中保存备用。

[0030] 接种纯化后的菌株至热杀菌后的荔枝汁中，通过感官初筛得到发酵后能使荔枝原本特征香气、甜香、花香味道保留较好，以及能降低热杀菌荔枝汁“番薯味”、“洋葱味”等“蒸煮”异味的六株菌J01、J03、J05、J06、J07、R02，这六株菌对果汁的风味没有不良影响。J01、J03、J05、J06、J07、R02菌落形态为圆形菌落，表面湿润光滑，轻微隆起，为酵母菌菌株常见菌落形态。经验证，均为Meyerozyma属的菌株。

[0031] 实施例2菌种的鉴定

[0032] 1. DNA的提取

[0033] （1）将Spin Column置于Collection Tube中，加入250 μL Buffer BL，12000 rpm/min离心1 min活化硅胶膜；

[0034] （2）取样本干燥组织（不大于20 mg），加入液氮充分研磨。研磨后置于1.5 mL离心管中，加入400 μL Buffer GP1，涡旋振荡1 min，65 ℃水浴10   30 min，期间可取出颠倒~混匀以充分裂解；

[0035] （3）加入150 μL Buffer GP2，涡旋振荡1 min，冰浴5 min；12000 rpm/min离心5 min，将上清转移至新的离心管中；

[0036] （4）加入上清等体积的无水乙醇，立即充分振荡混匀，液体全部转入Spin Column中，12,000 rpm/min离心30 s，弃废液。

[0037] （5）向Spin Column中加入500 μL Buffer Pw（使用前已加入无水乙醇）， 12000 rpm/min离心30 s，弃废液；

[0038] （6）向Spin Column中加入500 μLWash Buffer（使用前已加入无水乙醇），12000 rpm/min离心30 s，弃废液；重复一次；

[0039] （7）将Spin Column放回Collection Tube中，12,000 rpm/min离心2 min，开盖晾干1 min；

[0040] （8）取出Spin Column，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中央处加50  100 μ~L TE Buffer（65 ℃预热TE Buffer），20   25 ℃放置2 min，12,000 rpm/min 离心2 min。
~

[0041] 2. 降硫菌株ITS区的PCR扩增

[0042] （1）真菌菌种鉴定通用引物：提取菌株的基因组DNA，采用通用引物ITS1/ITS4对ITS区域的序列进行扩增。

[0043] （2）PCR反应条件为：98 ℃，2min；98 ℃，10s；56 ℃，10s；72 ℃，10s，循环35次，72 ℃延伸5 min。

[0044] （3）PCR反应体系为：1×TSE101金牌mix 45 μL，ITS1 2 μL，ITS4 2 μL，基因组DNA 1 μL，共50 μL。

[0045] 3.菌株目的基因片段回收

[0046] （1）将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（2 μL样品+6 μL溴酚蓝），300V电压下12 min，获取鉴定胶图（图2所示）。

[0047] （2）将扩增好PCR产物送至武汉擎科创新生物科技有限公司进行测序。

[0048] 实施例3 菌种降低“蒸煮味”的感官评价

[0049] 对实施例1筛选获得的6株菌在整体降低热杀菌荔枝汁“蒸煮”异味方面的效果进行评价，具体方法如下：

[0050] （1）热杀菌荔枝汁的制备：将新鲜荔枝果肉预冷后打浆（300 W，5 min），双层纱布过滤后，采用低温离心机（4℃, 9000 r/min, 10 min）离心，得到荔枝清汁。然后密封进行巴士灭菌，条件为85 ℃，30 min。

[0051] （2）将实施例1筛选获得的菌株分别在麦芽汁培养基（12.05±0.01 Brix，pH 5.6±0.2）中进行活化扩大培养（30℃，200 r/min，12 h）。将活化扩大培养后的菌液（OD=4）按7％的体积分数加入到灭菌后的荔枝清汁中，使接种后的荔枝清汁中的菌浓度达1×
6
10CFU/mL，在30 ℃恒温动态培养6 h，按表1进行感官评价，结果如图1所示。

[0052] 表1荔枝汁样品风味剖面分析用香气特征感官描述词

[0053] 香气分属性 定义 参比标准品 参比强度值整体气味 样品呈现给评价者的整体气味强弱，不分好坏
果香 与新鲜成熟水果相关联的混合香气 3‑辛酮 3
甜香 与蜂蜜、焦糖和棉花糖关联的香气 乙酸异戊酯 3
花香 与玫瑰、月季等关联香气 芳樟醇 3
青草香 与新鲜切割青草相关的气息 苯乙醛 3
蒸煮味 与蒸煮鸡蛋或土豆相关联的不良气味 甲硫基丙醛 3
洋葱味 与洋葱大蒜等相关联的不良气味 二甲基硫醚 3
酸败味 与乳制品（奶酪、酸奶）及酵母相关的气味 乙酸 3

[0054] 香气感官评价分析：采用5点强度法（5‑很强，3‑中等强度，0‑无）对样品的香气特征进行评价，具体操作如下：准确量取40 mL样品于125 mL嗅闻瓶中，用铝箔纸包裹（避免视觉效果引入的误差）并随机三位数字编号后呈送给感官评价室（21±1 ºC）的每个评价员，评价员以各属性标准品的香气强度为标尺。嗅闻评价三次，每两次评价中间休息时间20 min。取三次重复实验平均值绘制香气轮廓雷达图。

[0055] 结果分析：从图1可知，热杀菌荔枝汁接种J01、J03、J05、J06、J07、R02后，热杀菌荔枝汁的风味均得到了改善，“蒸煮”异味均有不同程度降低，短时间发酵的荔枝汁（3‑8 h）酒精极低（<0.50%），发酵果汁形态接近于鲜汁，并且再次灭菌后无明显异味。其中，J06号菌株效果最为突出。经J06号发酵的荔枝汁果香、甜香及花香等荔枝特征香气强度明显高于其他菌株，并且“番薯味”、“洋葱味”等气味强度也显著低于其它菌株发酵汁，J06号菌株对热杀菌荔枝汁风味的改善效果最为明显。

[0056] 实施例4 菌种降低挥发性硫化物的效果试验

[0057] 对实施例3验证的降解蒸煮味较好的6种菌株处理6 h后的热杀菌荔枝汁中二甲基硫醚（DMS）、3‑甲硫基丙醛（MTP）、二甲基二硫醚（DMDS）、二甲基三硫醚（DMTS）的含量进行测定，具体方法如下：

[0058] 样品平衡：准确称取15 mL荔枝汁于50 mL顶空萃取瓶中，加入2 g氯化钠及磁力搅拌转子，于45℃水浴中平衡20 min；

[0059] 样品吸附：三相固相微萃取针（PDMS/DVB/CAR）在45℃水浴条件下萃取挥发性组分30 min后，迅速将针管插入气相色谱仪的进样口，推出纤维头热解析10 min，同时启动气相色谱仪采集数据。

[0060] GC‑MS 条件：采用全扫描模式（scan mode）采集信号，电离方式EI，离子源的电子能量为 70 eV；接口温度Aux‑2为280℃，离子源温度为230℃，四级杆温度为150℃，扫描质量范围为35‑350 amu；扫描速度：5.2次/秒。

[0061] DMS、MTP、DMDS、DMTS精准定量：采用SIM模式，标准品及内标，建立标准曲线并计算降解率。

[0062] 表2四种硫化物标准曲线

[0063]

[0064] 降解率的计算：降解率（%）=100×（A‑B）/A

[0065] 式中：A为热处理后果汁中硫化物含量ug/mL；B为接菌后硫化物含量ug/mL。

[0066] 表3荔枝果汁降硫前后硫化物含量变化（μg/mL）及降解率（%）

[0067]

[0068] 由表3数据分析可知，热杀菌后的荔枝汁中含有较高浓度的二甲硫醚、二甲基硫醚、三甲基硫醚、甲硫基丙醛等挥发性含硫化合物，利用J06菌株对以上四种硫化物均有很好的降解效果，二甲基硫醚的降解率为69.27%，且其余三种硫化物降解率为100%。

[0069] 根据测序结果表示，片段碱基序列与将测序结果所得的ITS区序列在NCBI上进行分析处理，结果显示J06菌株与Meyerozyma caribbica的序列同源性超过99％，因此，将该菌株命名为卡利比克迈耶氏酵母 (Meyerozyma caribbica) GAADS 0917。

[0070] 实施例5 菌株降硫效果的验证

[0071] 将菌株GAADS 0917在含有不同浓度挥发性硫化物的培养基中验证降硫效果，具体步骤为：

[0072] 将菌株GAADS 0917在麦芽汁培养基（12.05±0.01 Brix，pH 5.6±0.2）中于30 ℃培养12 h，获得菌体培养液（OD=4），以7％体积分数加入到含有终浓度为0、0.5、1 ug/mL的6
含硫化合物的麦芽汁培养基中，使接种后的菌浓达10 CFU/mL，在30 ℃培养6 h，检测含硫化合物的含量及降解率，结果如表4所示。

[0073] 表4菌株GAADS 0917在挥发性硫化物的培养基中的降解能力

[0074]

[0075] 对比例

[0076] 具体实施方式同实施例4，区别在于，将GAADS 0917替换为同属、同种的另一株菌株SHBCC D55517（购自上海保藏生物技术中心），结果如表5所示。

[0077] 表5 不同卡利比克迈耶氏酵母对挥发性硫化物的降解能力

[0078]

[0079] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。