毛囊细胞构成的多层组织工程皮肤及其制备方法与应用

摘要

本发明涉及一种毛囊细胞构成的多层组织工程皮肤及其制备方法与应用。制备方法，包括离体自体毛囊的消化、毛囊混合细胞扩大培养、毛囊混合细胞成熟分化及毛囊混合细胞成熟分化及组织结构形成。与现有技术相比，本发明提供的组织工程皮肤仅由自体毛囊细胞构成，形成类似生理基底层、棘层、颗粒层的层状结构，并且在基底层富含黑素细胞。该组织工程皮肤细胞间连接紧密，具有良好的韧性，富含分裂旺盛的类似基底层细胞，其内丰富的黑素细胞能促进白癜风白斑区皮肤复色，扩展了组织工程皮肤的使用领域。本发明采用自体毛囊取材，来源广泛，同时降低产业化成本。

权利要求

1.一种毛囊细胞构成的多层组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：离体自体毛囊的消化：

采用二步酶消化法进行毛囊组织消化，将主要含有毛囊干细胞和黑素母细胞的毛囊隆突区、富含角质形成细胞的外根鞘以及富含毛乳头细胞的毛包区进行有效消化，获得毛囊混合细胞；

毛囊混合细胞扩大培养：

将含有毛囊混合细胞的毛囊单细胞悬液采用培养液A和培养液B分两步扩大培养，得到扩大培养后毛囊混合细胞；

毛囊混合细胞成熟分化及组织结构形成：

扩大培养后毛囊混合细胞采用培养液B培养至融合率达80%后更换为培养液C培养，培养液C培养时每天换液，富含毛囊干细胞、黑素前体细胞、角质形成细胞的毛囊混合细胞在培养液C中完成向成熟表皮细胞方向诱导并分化，成熟后细胞分层排列，同时在培养液C的作用下形成表皮细胞间紧密连接，形成毛囊细胞构成的多层组织工程皮肤；

所述培养液A的组成为：

其组分按500ml体积计包括：商用成分明确角质形成细胞培养基500ml，胰岛素样生长因子1‑10ng/ml，角质细胞生长因子0.5‑5ng/ml，内皮素100‑500ng/ml，黑素细胞刺激素α 

20‑80ng/ml，庆大霉素20‑100 ug/ml；

所述培养液B的组成为：

其组分按500ml体积计包括：商用成分明确角质形成细胞培养基500ml，胰岛素样生长因子1‑10ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子1‑10ng/ml，表皮细胞生长因子10‑50ng/ml，促肾上腺皮质激素10‑50ng/ml，黑素细胞刺激素α 20‑80ng/ml；

所述培养液C的组成为：

其组分按500ml体积计包括：商用DMEM培养基370ml，商用F12培养基125ml，非必需氨基酸5ml，胰岛素样生长因子1‑10ng/ml，牛磺酸1‑10ug/ml，5‑羟基色胺盐酸盐1‑5ug/ml，胰岛素20‑80ug/ml，重组转铁蛋白10‑50ug/ml，碱性成纤维细胞生长因子1‑10ng/ml，三碘甲腺原氨酸1‑10nM，氢化可的松0.5‑5ug/ml，角质细胞生长因子0.5‑5ng/ml，表皮细胞生长因子

10‑50ng/ml，促肾上腺皮质激素10‑50ng/ml，腺苷10‑50ug/ml。

2.根据权利要求1所述的一种毛囊细胞构成的多层组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，采用二步酶消化法进行毛囊组织消化的方法包括以下步骤：第一次酶消化：将离体自体毛囊组织浸没于含0.6‑2.4U/ml中性蛋白酶的培养液A中，孵育；

第二次酶消化：将毛囊组织切碎，加入TrypLE消化10‑40分钟后用力吹打，吹打后含细胞和组织的悬液经过筛网过滤，滤液离心后细胞团中加入磷酸盐缓冲液洗涤3‑5次后加入培养液A，制成含有毛囊混合细胞的毛囊单细胞悬液。

3.根据权利要求1所述的一种毛囊细胞构成的多层组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，将含有毛囊混合细胞的毛囊单细胞悬液采用培养液A和培养液B分两步扩大培养的方法为：

4 6

毛囊混合细胞按照10‑10/ml细胞浓度接种于经过基质包被的培养皿，加入培养液A，在5%CO2、37℃条件下扩大培养，隔天换液，融合率达到80%以上后细胞传代；

4 6

传代后细胞按照10‑10/ml细胞浓度接种于经过基质包被的培养皿，加入培养液B，在

5%CO2、37℃条件下扩大培养，隔天换液，完成毛囊干细胞、黑素前体细胞、角质形成细胞的同步扩大培养，得到扩大培养后毛囊混合细胞。

4.根据权利要求3所述的一种毛囊细胞构成的多层组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，用于包被培养皿的基质的组成为：其组分按500ml体积计包括：商用磷酸盐缓冲液

500ml，IV型胶原蛋白10‑100ug/ml。

5.根据权利要求1所述的一种毛囊细胞构成的多层组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，毛囊混合细胞成熟分化及组织结构形成的过程中，扩大培养后毛囊混合细胞按照

4 5 2

10‑10个/cm密度接种至基质包被后培养皿，采用培养液B在5%CO2、37℃条件下培养，至融合率达80%后更换为培养液C，每天换液。

6.基于权利要求1‑5中任一项所述制备方法制备得到的多层组织工程皮肤，其特征在于，所述多层组织工程皮肤为具有生理基底层、棘层、颗粒层的层状结构组织，并在基底层富含黑素母细胞。

7.权利要求6所述多层组织工程皮肤的应用，其特征在于，所述多层组织工程皮肤用于制备生物医疗材料。

说明书

毛囊细胞构成的多层组织工程皮肤及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种毛囊细胞构成的多层组织工程皮肤及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 皮肤覆盖全身表面，是人体最大的器官之一，约占体重的16%。皮肤具有分泌、吸收、保护机体、感觉和免疫等重要功能。生理皮肤分为表皮层、真皮层和皮下组织。外伤、烧伤、炎症、溃疡等常常造成皮肤全层缺损；白癜风等自身免疫性疾病也会造成表皮层中黑素细胞缺失，皮肤肤色异常。

[0003] 组织工程皮肤是组织工程器官中最早被研发出来，并且发展速度最快，也是技术最成熟的组织工程产品。大量实验和临床研究证明，组织工程皮肤可以作为替代物，用于皮肤创面修复和重建，国内外也已经有成熟的组织工程皮肤产品上市。在白癜风疾病细分领域，尚未有组织工程表皮产品问世，其主要原因在于，无外源成分的皮肤混合细胞培养体系开发难度大。同时，由于表皮细胞在传统的体外培养过程中，有失去角质化特征的趋势，使得制备的组织工程表皮皮片脆性增加，难以形成类似生理性表皮的结构特征，而且影响其功能。

[0004] 在组织工程皮肤中，细胞的活力尤为重要。如果其中多为已经分化的细胞，干细胞很少且修复创面很大时，分化细胞逐渐老化脱落，缺乏足够的干细胞或周边移行的细胞来补充，移植物就不能存活。因此，足够的干细胞对于组织工程皮肤十分重要，是保证细胞的更新和移植物在创面上的长期存活的关键。毛囊上皮细胞与表皮层的角质形成细胞在组织结构上相延续。细胞形态相似并且在一定条件下可以相互转化。毛囊上皮细胞主要由毛母质细胞的外根鞘细胞组成。通过分析不同区段毛囊细胞的克隆形成能力，在毛囊隆突区发现具有高度增殖能力的细胞，证明了在毛囊隆突区存在着干细胞。近年来，毛囊隆突区被公认为是干细胞储存库。它可能不仅参与毛囊形成，维持毛发的周期性生长，还与表皮发育有关，形成表皮基底层的短暂扩增细胞，维持表皮自我更新，在皮肤的损伤过程中担当修复表皮的重要作用。同时，在毛囊隆突区还发现了黑色素干细胞。因此，毛囊是更为优秀的组织工程皮肤种子细胞来源。研究发现来源于毛囊外根鞘细胞的皮片有更强的粘附作用，形成“边缘效应”，皮片细胞释放大量生长因子和细胞因子刺激上皮细胞迁移，促使伤口收缩、创面缩小。这种现象在一般皮肤表皮移植物和常规单层培养的角质形成细胞移植中未见报道。

[0005] 现有的以毛囊上皮细胞为种子细胞来源，含活细胞的组织工程皮肤产品的细胞培养体系高度依赖血清和成纤维细胞滋养层。培养试剂的使用、培养条件、血清的使用、添加外源因子的种类、细胞培养密度等，造成细胞的异质性、分化能力、增殖能力、及扩增培养后的细胞功能等存在差异，限制了皮片的规范化生产和医疗使用。

发明内容

[0006] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种毛囊细胞构成的多层组织工程皮肤及其制备方法与应用。

[0007] 本发明提供的多层组织工程皮肤仅由自体毛囊细胞构成，形成类似生理皮肤的富含黑素细胞基底层、棘层、颗粒层的层状结构。

[0008] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

[0009] 本发明首先提供一种毛囊细胞构成的多层组织工程皮肤的制备方法，包括以下步骤：

[0010] 离体自体毛囊的消化：

[0011] 采用二步酶消化法进行毛囊组织消化，将主要含有毛囊干细胞和黑素母细胞的毛囊隆突区、富含角质形成细胞的外根鞘以及富含毛乳头细胞的毛包区进行有效消化，获得毛囊混合细胞；

[0012] 毛囊混合细胞扩大培养：

[0013] 将含有毛囊混合细胞的毛囊单细胞悬液采用培养液A和培养液B分两步扩大培养，得到扩大培养后毛囊混合细胞；

[0014] 毛囊混合细胞成熟分化及毛囊混合细胞成熟分化及组织结构形成：

[0015] 扩大培养后毛囊混合细胞采用培养液B培养至融合率达80%后更换为培养液C培养，培养液C培养时每天换液，富含毛囊干细胞、黑素前体细胞、角质形成细胞的毛囊混合细胞在培养液C中完成向成熟表皮细胞方向诱导并分化，成熟后细胞分层排列，同时在培养液C的作用下形成表皮细胞间紧密连接，形成毛囊细胞构成的多层组织工程皮肤；

[0016] 所述培养液A的组成为：

[0017] 其组分按500ml体积计包括：商用成分明确角质形成细胞培养基500ml，胰岛素样生长因子1‑10ng/ml，角质细胞生长因子0.5‑5ng/ml，内皮素100‑500ng/ml，黑素细胞刺激素α 20‑80ng/ml，庆大霉素20‑100 ug/ml；

[0018] 所述培养液B的组成为：

[0019] 其组分按500ml体积计包括：商用成分明确角质形成细胞培养基500ml，胰岛素样生长因子1‑10ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子1‑10ng/ml，表皮细胞生长因子10‑50ng/ml，促肾上腺皮质激素10‑50ng/ml，黑素细胞刺激素α 20‑80ng/ml；

[0020] 所述培养液C的组成为：

[0021] 其组分按500ml体积计包括：商用DMEM培养基370ml，商用F12培养基125ml，非必需氨基酸5ml，胰岛素样生长因子1‑10ng/ml，牛磺酸1‑10ug/ml，5‑羟基色胺盐酸盐1‑5ug/ml，胰岛素20‑80ug/ml，重组转铁蛋白10‑50ug/ml，碱性成纤维细胞生长因子1‑10ng/ml，三碘甲腺原氨酸1‑10nM，氢化可的松0.5‑5ug/ml，角质细胞生长因子0.5‑5ng/ml，表皮细胞生长因子10‑50ng/ml，促肾上腺皮质激素10‑50ng/ml，腺苷10‑50ug/ml。

[0022] 在本发明的一个实施方式中，离体自体毛囊是指已经脱离人体的毛囊。即本申请提供的方法是寄托于立体组织进行操作。

[0023] 在本发明的一个实施方式中，离体自体毛囊的获得方法可以采用常规的技术方法，例如通过取发器吸出毛囊。具体的获得方法可以采用植发操作中FUE（follicle unit extraction）毛囊提取方法，具体可以参考Follicular Unit Extraction: Minimally invasive surgery for hair transplantation. Dermatol Surg. 2002; 28: 720–7. 电动冲压下将取发器前端刺破头皮皮肤，吸出毛囊，将毛囊用无菌弯头镊子轻轻提取出来，整个过程毛囊结构完整。

[0024] 在本发明的一个实施方式中，采用二步酶消化法进行毛囊组织消化的方法包括以下步骤：

[0025] 第一次酶消化：将离体自体毛囊组织浸没于含0.6‑2.4U/ml中性蛋白酶的培养液A中，37℃孵育过夜；

[0026] 第二次酶消化：第二天将毛囊组织切碎，加入TrypLE于37℃消化10‑40分钟后用力吹打，吹打后含细胞和组织的悬液经过100um筛网过滤，滤液离心后细胞团中加入磷酸盐缓冲液洗涤3‑5次后加入培养液A，制成含有毛囊混合细胞的毛囊单细胞悬液。

[0027] 在本发明的一个实施方式中，将含有毛囊混合细胞的毛囊单细胞悬液采用培养液A和培养液B分两步扩大培养的方法为：

[0028] 毛囊混合细胞按照104‑106/ml细胞浓度接种于经过4小时基质包被的培养皿，加入培养液A，在5%CO2、37℃条件下扩大培养，隔天换液，融合率达到80%以上后细胞传代；

[0029] 传代后细胞按照104‑106/ml细胞浓度接种于经过4小时基质包被的培养皿，加入培养液B，在5%CO2、37℃条件下扩大培养，隔天换液，完成毛囊干细胞、黑素前体细胞、角质形成细胞的同步扩大培养，得到扩大培养后毛囊混合细胞。

[0030] 在本发明的一个实施方式中，用于包被培养皿的基质的组成为：其组分按500ml体积计包括：商用磷酸盐缓冲液500ml，IV型胶原蛋白10‑100ug/ml。

[0031] 在本发明的一个实施方式中，毛囊混合细胞成熟分化及毛囊混合细胞成熟分化及4 5 2
组织结构形成的过程中，扩大培养后毛囊混合细胞按照10‑10个/cm密度接种至基质包被后培养皿，采用培养液B在5%CO2、37℃条件下培养，至融合率达80%后更换为培养液C，每天换液。

[0032] 本发明进一步提供基于上述制备方法制备得到的多层组织工程皮肤。

[0033] 在本发明的一个实施方式中，所述多层组织工程皮肤包括类似生理状态的黑素母细胞和具有干性的角质形成细胞。

[0034] 在本发明的一个实施方式中，所述多层组织工程皮肤为类似具有生理基底层、棘层、颗粒层的层状结构组织，并在基底层富含黑素母细胞。该组织工程皮肤细胞间连接紧密，具有良好的韧性，富含分裂旺盛的类似基底层细胞。

[0035] 本发明进一步提供基于上述制备方法制备得到的多层组织工程皮肤的应用，所述多层组织工程皮肤用于制备生物医疗材料。可针对应用于色素缺损或表皮缺损疾病的治疗。

[0036] 在本发明的一个实施方式中，制备得到的多层组织工程皮肤在用于稳定期白癜风治疗时，可促使白斑复色，同时自体来源无免疫排斥，实现治愈白癜风。

[0037] 本发明提供的毛囊细胞构成的多层组织工程皮肤的制备方法，包括离体自体毛囊的消化、毛囊混合细胞扩大培养、毛囊混合细胞成熟分化及毛囊混合细胞成熟分化及组织结构形成。本发明提供的制备方法培养体系中无任何外源成分，所制备的组织工程表皮仅由自体细胞构成，无同种异体滋养层细胞存在，这一特性使得所制备的产品在临床使用上更具安全性。在细胞组成上由混合细胞构成，主要是黑素细胞和角质形成细胞。角质形成细胞形成了多层结构，在类似生理表皮的基底层上，排布着大量黑素细胞，这一细胞特性使该组织工程表皮扩大了适应症，可用于稳定期白癜风的外科移植治疗，促使白斑复色。

[0038] 本发明采用自体毛囊作为组织工程皮肤的种子细胞来源，能极大减少取材的限制和供者的痛苦，自体细胞可以避免移植后的免疫排斥作用，有利于组织工程皮肤与磨削创面的整合，达到更好的治疗效果；所采用的毛囊含丰富的干细胞，细胞代谢活跃，增殖能力强，传代次数多，有利于种子细胞的大规模扩增，减少取材数量，同时降低了产业化成本。

[0039] 本发明是自体毛囊取材，经过酶消化法分离毛囊上皮角质形成细胞、黑素前体细胞和毛囊干细胞，经体外高效扩增培养后，向成熟表皮细胞方向诱导并分化，培养后得到类似生理状态的多层组织结构表皮皮肤，该组织工程皮肤仅由自体毛囊细胞构成，形成类似生理基底层、棘层、颗粒层的层状结构，并且在基底层富含黑素细胞。该组织工程皮肤细胞间连接紧密，具有良好的韧性，富含分裂旺盛的类似基底层细胞，提高了移植的成功率，其内丰富的黑素细胞能促进白癜风白斑区皮肤复色，扩展了组织工程皮肤的使用领域；采用自体毛囊取材，来源广泛，取材过程无痛苦，同时降低产业化成本。

[0040] 本发明研究证实，建立成分确定、无血清、无滋养层的毛囊来源的混合细胞培养体系在生物技术上有实现可能，毛囊来源的混合细胞作为组织工程表皮的种子细胞应用于白癜风治疗成为可能。

附图说明

[0041] 图1：实施例1中毛囊混合细胞在培养液A中细胞形态（10倍物镜）；

[0042] 图2：实施例1中毛囊混合细胞在培养液B中细胞形态（10倍物镜）；

[0043] 图3：实施例1中毛囊混合细胞在培养液C中细胞形态（10倍物镜）；

[0044] 图4：实施例1中毛囊混合细胞中黑素细胞形态结构（10倍物镜）；

[0045] 图5：实施例1中毛囊细胞构成的多层组织工程皮肤（面积：21cm2）。

具体实施方式

[0046] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

[0047] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0048] 实施例1：

[0049] 步骤一：培养液准备

[0050] 配制包被基质：其组分按500ml体积计包括：商用磷酸盐缓冲液500ml，IV型胶原蛋白30ug/ml；

[0051] 配制培养液A：其组分按500ml体积计包括：商用成分明确角质形成细胞培养基500ml，胰岛素样生长因子10ng/ml，角质细胞生长因子3ng/ml，内皮素200ng/ml，黑素细胞刺激素α 50ng/ml，庆大霉素50 ug/ml；

[0052] 配制培养液B：其组分按500ml体积计包括：商用成分明确角质形成细胞培养基500ml，胰岛素样生长因子10ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子4ng/ml，表皮细胞生长因子
20ng/ml，促肾上腺皮质激素50ng/ml，黑素细胞刺激素α 50ng/ml；

[0053] 配制培养液C：其组分按500ml体积计包括：商用DMEM培养基370ml，商用F12培养基125ml，非必需氨基酸5ml，胰岛素样生长因子10ng/ml，牛磺酸5ug/ml，5‑羟基色胺盐酸盐
1ug/ml，胰岛素20ug/ml，重组转铁蛋白20ug/ml，碱性成纤维细胞生长因子4ng/ml，三碘甲腺原氨酸5nM，氢化可的松1.5ug/ml，角质细胞生长因子3ng/ml，表皮细胞生长因子20ng/ml，促肾上腺皮质激素50ng/ml，腺苷40ug/ml；

[0054] 步骤二：离体自体毛囊组织

[0055] 离体自体毛囊组织浸没于含2U/ml中性蛋白酶的培养液A中孵育过夜，第二天将毛囊组织切碎，加入TrypLE于37℃消化30分钟后用力吹打，吹打后悬液经过100um筛网过滤，滤液离心后加入磷酸盐缓冲液洗涤3次后加入培养液A，制成毛囊单细胞悬液。其中，毛囊混合细胞在培养液A中细胞形态如图1所示。

[0056] 步骤三：毛囊混合细胞扩大培养

[0057] 获得的毛囊单细胞悬液采用培养液A和培养液B分两步扩大培养。毛囊混合细胞按4
照5×10 /ml细胞浓度接种于经过4小时基质包被的培养皿，加入培养液A，在5%CO2、37℃条
4
件下扩大培养，隔天换液，融合率达到80%以上后细胞传代。传代后细胞按照5×10/ml细胞浓度接种于经过4小时基质包被的培养皿，加入培养液B，在5%CO2、37℃条件下扩大培养，隔天换液，直至细胞融合度达到80%，完成毛囊干细胞、黑素前体细胞、角质形成细胞的同步扩大培养。其中，毛囊混合细胞在培养液B中细胞形态如图2所示。

[0058] 步骤四：毛囊混合细胞分化及组织形成

[0059] 扩大培养后毛囊混合细胞按照1×104个/cm2密度接种至基质包被后培养皿，采用培养液B在5%CO2、37℃条件下培养，至融合率达80%后更换为培养液C，每天换液。富含毛囊干细胞、黑素前体细胞、角质形成细胞的毛囊混合细胞在培养液C中完成向成熟表皮细胞方向诱导并分化，成熟后细胞分层排列，同时在培养液C的作用下形成表皮细胞间紧密连接，形成类似生理表皮样组织结构，完成制备。其中，毛囊混合细胞在培养液C中细胞形态如图3所示。

[0060] 按照实施例1制备方法可以制备比较经济的毛囊细胞构成的多层组织工程皮肤，在此种制备条件下，可以得到数量最多的毛囊来源组织工程表皮。毛囊混合细胞中黑素细胞形态结构如图4所示。实施例1中毛囊细胞构成的多层组织工程皮肤如图5所示。

[0061] 实施例2：

[0062] 步骤一：培养液准备

[0063] 配制包被基质：其组分按500ml体积计包括：商用磷酸盐缓冲液500ml，IV型胶原蛋白50ug/ml；

[0064] 配制培养液A：其组分按500ml体积计包括：商用成分明确角质形成细胞培养基500ml，胰岛素样生长因子10ng/ml，角质细胞生长因子3ng/ml，内皮素200ng/ml，黑素细胞刺激素α50ng/ml，庆大霉素50 ug/ml；

[0065] 配制培养液B：其组分按500ml体积计包括：商用成分明确角质形成细胞培养基500ml，胰岛素样生长因子10ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子4ng/ml，表皮细胞生长因子
20ng/ml，促肾上腺皮质激素50ng/ml，黑素细胞刺激素α50ng/ml；

[0066] 配制培养液C：其组分按500ml体积计包括：商用DMEM培养基370ml，商用F12培养基125ml，非必需氨基酸5ml，胰岛素样生长因子10ng/ml，牛磺酸5ug/ml，5‑羟基色胺盐酸盐
1ug/ml，胰岛素20ug/ml，重组转铁蛋白20ug/ml，碱性成纤维细胞生长因子4ng/ml，三碘甲腺原氨酸5nM，氢化可的松1.5ug/ml，角质细胞生长因子3ng/ml，表皮细胞生长因子20ng/ml，促肾上腺皮质激素50ng/ml，腺苷40ug/ml；

[0067] 步骤二：离体自体毛囊组织

[0068] 离体自体毛囊组织浸没于含2U/ml中性蛋白酶的培养液A中孵育过夜，第二天将毛囊组织切碎，加入TrypLE于37℃消化50分钟（分2次）后用力吹打，吹打后悬液经过100um筛网过滤，滤液离心后加入磷酸盐缓冲液洗涤3次后加入培养液A，制成毛囊单细胞悬液。

[0069] 步骤三：毛囊混合细胞扩大培养

[0070] 获得的毛囊单细胞悬液采用培养液A和培养液B分两步扩大培养。毛囊混合细胞按5
照5×10 /ml细胞浓度接种于经过4小时基质包被的培养皿，加入培养液A，在5%CO2、37℃条
5
件下扩大培养，隔天换液，融合率达到80%以上后细胞传代。传代后细胞按照5×10/ml细胞浓度接种于经过4小时基质包被的培养皿，加入培养液B，在5%CO2、37℃条件下扩大培养，隔天换液，直至细胞融合度达到80%，完成毛囊干细胞、黑素前体细胞、角质形成细胞的同步扩大培养。

[0071] 步骤四：毛囊混合细胞分化及组织形成

[0072] 扩大培养后毛囊混合细胞按照8×104个/cm2密度接种至基质包被后培养皿，采用培养液B在5%CO2、37℃条件下培养，至融合率达80%后更换为培养液C，每天换液。富含毛囊干细胞、黑素前体细胞、角质形成细胞的毛囊混合细胞在培养液C中完成向成熟表皮细胞方向诱导并分化，成熟后细胞分层排列，同时在培养液C的作用下形成表皮细胞间紧密连接，形成类似生理表皮样组织结构，完成制备。

[0073] 按照实施例2制备方法可以较快速制备毛囊细胞构成的多层组织工程皮肤，在此种制备条件下，28天即可得到毛囊来源组织工程表皮，但是数量少于实施例1中所述。两种实施例中毛囊来源组织工程表皮质量相同。

[0074] 以上两个实施例中离体自体毛囊是指已经脱离人体的毛囊。

[0075] 离体自体毛囊的获得方法可以采用常规的技术方法，例如通过取发器吸出毛囊。具体的获得方法可以采用植发操作中FUE（follicle unit extraction）毛囊提取方法，具体可以参考Follicular Unit Extraction: Minimally invasive surgery for hair transplantation. Dermatol Surg. 2002; 28: 720–7. 电动冲压下将取发器前端刺破头皮皮肤，吸出毛囊，将毛囊用无菌弯头镊子轻轻提取出来，整个过程毛囊结构完整。

[0076] 上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。