采用盐单胞菌株生产四氢嘧啶的方法

摘要

本发明提供了一种采用盐单胞菌株Halomonas sp. YL01发酵生产四氢嘧啶的方法，以该菌株为发酵菌菌株，将乙酸盐作为主碳源，通过对培养基及发酵条件的优化，可实现四氢嘧啶的工业化发酵生产。通过替代传统葡萄糖作为碳源，该发酵方法大幅降低生产四氢嘧啶的成本。

权利要求

1.一种采用盐单胞菌株生产四氢嘧啶的方法，其特征在于：所采用的碳源由乙酸盐与丙酸盐构成混合碳源，通过盐单胞菌株Halomonas sp. YL01进行发酵制备，所述盐单胞菌株Halomonas sp. YL01保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCC .No62420，保藏日期为2022年04月24日；所述乙酸盐在发酵液中的浓度20‑25 g/L，丙酸盐在发酵液中的浓度5‑10 g/L；所述发酵温度为35‑37℃，所述发酵所采用的培养基的pH值为

9‑11。

2.如权利要求1所述生产四氢嘧啶的方法，其特征在于：所述乙酸盐为乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵中的一种或几种混合。

3.如权利要求1或2所述生产四氢嘧啶的方法，其特征在于：所述丙酸盐为丙酸钠、丙酸钾、丙酸铵中的一种或几种混合。

4.如权利要求1或2所述生产四氢嘧啶的方法，其特征在于：当采用摇瓶发酵时，接种盐单胞菌株Halomonas sp. YL01至摇瓶培养基，发酵培养。

5.如权利要求4所述生产四氢嘧啶的方法，其特征在于：摇瓶培养基由乙酸钠20‑25 g/L、丙酸钠5‑10 g/L、尿素0.5‑10 g/L、天冬氨酸 0‑10 g/L、酵母粉1‑15 g/L、无水硫酸镁

0.05‑0.6 g/L、磷酸二氢钾1.5‑5.5 g/L、氯化钠50‑80 g/L、Fe(III)‑NH4‑Citrate 0.05‑

0.1 g/L、CaCl2·2H2O 0.02‑0.2 g/L、ZnSO4·7H2O 0.01‑0.1 g/L、MnCl2·4H2O 0.002‑

0.02 g/L、H3BO3 0.01‑0.05 g/L、CoCl2·6H2O 0.005‑0.02 g/L、CuSO4·5H2O 0.01‑0.08 g/L、NiCl2·6H2O 0.005‑0.01 g/L和NaMoO4·2H2O 0.02‑0.1 g/L组成。

6.如权利要求1或2所述生产四氢嘧啶的方法，其特征在于：当采用发酵罐发酵时，将菌种按接种量为5％‑15％接入发酵罐培养基；发酵过程中控制溶氧为20％‑40％；发酵培养，发酵期间检测乙酸含量，当乙酸含量低于10 g/L添加补料培养基，依据生长情况补料。

7.如权利要求6所述生产四氢嘧啶的方法，其特征在于：发酵罐培养基由乙酸钠20‑25 g/L、丙酸钠5‑10 g/L、氯化钠50‑80 g/L、酵母膏 1‑10 g/L、MgSO4 1‑10 g/L、尿素1‑4 g/L、磷酸二氢钾3‑10 g/L、第一微量元素组分 5‑15 g/L和第二微量元素组分1‑5 g/L组成。

8.如权利要求7所述生产四氢嘧啶的方法，其特征在于：第一微量元素组分具体包括 Fe(III)‑NH4‑Citrate 3‑7 g/L、CaCl2·2H2O 1‑3 g/L、HCl 3‑7 M，通过去离子水配制；第二微量元素组分具体包括ZnSO4·7H2O 0.1‑0.2 g/L、MnCl2·4H2O 0.02‑0.04 g/L、H3BO30.2‑0.4 g/L、CoCl2·6H2O 0.1‑0.3 g/L、CuSO4·5H2O 0.01‑0.03 g/L、NiCl2·6H2O

0.01‑0.03 g/L、NaMoO4·2H2O 0.02‑0.05 g/L，通过去离子水配制。

说明书

采用盐单胞菌株生产四氢嘧啶的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种全新的生产四氢嘧啶用盐单胞菌株及采用该菌生产四氢嘧啶的方法。

背景技术

[0002] 四氢嘧啶(ectoine，Ect)及其衍生物羟基四氢嘧啶(hydroxyectoine，5‑Hect)最初是从嗜盐和耐盐微生物中发现的一类重要的相容性溶质 (compatible solutes)。四氢嘧啶可以帮助嗜盐和耐盐微生物适应高盐、高渗透压和紫外辐射等环境，维持其在逆境中的正常生长。四氢嘧啶可以增强细胞在多种逆境(如高盐、热、干燥和冷冻等)中的耐受性，因此在生物保护、生物医药以及生物科技等领域都展现出广阔的应用前景。伴随着四氢嘧啶商业化应用的快速发展，四氢嘧啶的微生物合成研究一直是四氢嘧啶研究的重点和热点。

[0003] 现有四氢嘧啶生物合成主要有以下四种方法，第一种是利用野生菌株合成四氢嘧啶。野生菌株在高盐环境中可以快速生成四氢嘧啶以维持细胞渗透压的平衡，当细胞处于低盐环境中，细胞可感知渗透压的变化并将四氢嘧啶释放至胞外，保持细胞渗透压平衡。将细胞在高盐及低盐环境中反复循环，细胞可持续对外生成四氢嘧啶。这种生产方式被形象的称为“细菌挤奶”。

[0004] 第二种是筛选天然可在低盐环境中合成四氢嘧啶的菌株，利用天然菌株在低盐环境中可生产四氢嘧啶并分泌到胞外特性，实现四氢嘧啶的连续生产。

[0005] 第三种是利用合成生物学手段进行四氢嘧啶的异源合成，将四氢嘧啶合成基因簇ectABC转入大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等异源菌种。异源合成优势在于异源菌种中不存在四氢嘧啶的降解通路，不需对降解通路相关基因进行敲除即可实现四氢嘧啶的高产。

[0006] 第四种是利用合成生物学手段改造嗜盐微生物提升四氢嘧啶产量。主要是通过提升四氢嘧啶合成通路基因的表达及敲除四氢嘧啶降解相关基因来提升四氢嘧啶的产量。

[0007] 以上四种常用的发酵方式基本上采用葡萄糖为主要碳源进行发酵，少量利用谷氨酸盐、甘油和L‑天门冬氨酸等作为发酵碳源。谷氨酸盐、甘油及L‑天门冬氨酸价格高昂，在发酵中往往作为辅助材料，以这些为主要碳源生产成本较高，无法实现大规模的产业化应用。

[0008] 葡萄糖主要来源是淀粉，而淀粉是重要的粮食资源。因此寻找一种以非葡萄糖为主要碳源的微生物发酵产四氢嘧啶是现阶段行业亟需解决的问题。

[0009] 北京化工大学生命学院谭天伟院士研究团队和软物质高精尖中心兼职教授延斯尼尔森院士研究团队在 Nature Catalysis 刊文，提出了第三代生物炼制的概念，旨在利用微生物细胞工厂将可再生能源和二氧化碳转化为燃料和化学品。与传统生物炼制路线相比，第三代生物炼制更加环保，环境友好性高，且可以极大的降低原料加工成本。

[0010] 短链脂肪酸如丙酸、乙酸等来源广泛，可被微生物利用厨余垃圾、高浓度有机废水、城市垃圾等发酵生产。同时也存在电催化产乙酸，可利用电催化技术将二氧化碳转化为丙酸、乙酸，不仅解决了二氧化碳排放问题，同时生成可利用的生物碳源，助力碳减排碳中和。因此利用丙酸、乙酸等为碳源发酵生产四氢嘧啶不仅能解决利用葡萄糖发酵带来的一系列问题，同时能为碳中和碳减排贡献部分力量。

[0011] 本申请发明人在进行盐湖淤泥采样后获得一株高产四氢嘧啶的盐单胞菌Halomonassp. YL01，对其进行宏基因组测序及代谢通路分析表明，其可利用乙酸为唯一碳源进行代谢，且具有较高的乙酸盐耐受度。进一步通过研究发现，盐单胞菌Halomonassp. YL01可利用以乙酸盐、丙酸盐或者两者构成的混合碳源生产四氢嘧啶。

[0012] 本发明人通过研究对发酵培养基的调整优化，最终实现了利用以乙酸盐为主的碳源高产四氢嘧啶，解决了现有只能利用葡萄糖、谷氨酸盐、甘油等粮食作物生产四氢嘧啶的困境。

发明内容

[0013] 本发明所要解决的技术问题是提供一种盐单胞菌株Halomonassp. YL01，通过对该菌株基因组进行检测分析，发现其可利用以乙酸盐为主要碳源发酵生产四氢嘧啶，并进一步研究，经过对碳源的筛选和发酵工艺的优化，获得高效生产四氢嘧啶的培养基配方及发酵方法。

[0014] 基于此，本发明提供一种采用盐单胞菌株Halomonassp. YL01生产四氢嘧啶的发酵方法，所采用的碳源包括乙酸盐或乙酸盐与丙酸盐中构成的混合碳源，以盐单胞菌株Halomonassp. YL01为底盘菌进行发酵制备，所述乙酸盐在发酵液中的浓度10‑40g/L，丙酸盐在发酵液中的浓度不高于10g/L。

[0015] 其中，所述乙酸盐可以为乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵中的一种或几种混合。

[0016] 其中，所述丙酸盐可以为丙酸钠、丙酸钾、丙酸铵中的一种或几种混合。

[0017] 其中，所述碳源还可以包括葡萄糖。

[0018] 其中，所述发酵温度为32℃‑37℃。

[0019] 其中，所述发酵所采用的培养基的pH值为6‑11。

[0020] 其中，当采用摇瓶发酵时，接种盐单胞菌株Halomonassp. YL01至摇瓶培养基，发酵培养。

[0021] 其中，摇瓶培养基组成：乙酸钠10‑40 g/L、丙酸钠0‑10 g/L、葡萄糖0‑40 g/L、尿素0.5‑10g/L，天冬氨酸 0‑10 g/L，酵母粉1‑15 g/L，无水硫酸镁0.05‑0.6 g/L，磷酸二氢钾1.5‑5.5 g/L，氯化钠50‑80 g/L，Fe(III)‑NH4‑Citrate 0.05‑0.1 g/L，CaCl2·2H2O 0.02‑0.2 g/L，ZnSO4·7H2O 0.01‑0.1 g/L，MnCl2·4H2O 0.002‑0.02 g/L，H3BO30.01‑0.05 g/L，CoCl2·6H2O 0.005‑0.02 g/L，CuSO4·5H2O 0.01‑0.08 g/L，NiCl2·6H2O 0.005‑0.01 g/L，NaMoO4·2H2O 0.02‑0.1 g/L。

[0022] 其中，当采用发酵罐发酵时，将菌种按接种量为5％‑15％接入发酵罐培养基；发酵过程中控制溶氧为20％～40％；发酵培养，发酵期间检测乙酸含量，当乙酸含量低于10g/L添加补料培养基，依据生长情况补料。

[0023] 其中，发酵罐培养基组成(g/L)：

[0024] 乙酸钠10‑40、丙酸钠0‑10、葡萄糖0‑40、氯化钠50‑80 ；酵母膏 1‑10 、MgSO4 1‑10；尿素1‑4 ；磷酸二氢钾3‑10；第一微量元素组分5‑15、第二微量元素组分1‑5。

[0025] 其中，第一微量元素组分具体包括 Fe(III)‑NH4‑Citrate 3‑7 g/L、 CaCl2·2H2O1‑3 g/L、HCl 3‑7 M ，通过去离子水配制；第二微量元素组分具体包括ZnSO4·7H2O 0.1‑
0.2 g/L; MnCl2·4H2O； 0.02‑0.04g/L; H3BO30.2‑0.4g/L; CoCl2·6H2O 0.1‑0.3 g/L; CuSO4·5H2O 0.01‑0.03 g/L; NiCl2·6H2O 0.01‑0.03 g/L; NaMoO4·2H2O 0.02‑0.05 g/L ，通过去离子水配制。

[0026] 生物材料保藏信息

[0027] YL01，分类命名为Halomonassp.YL01，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(广东省微生物分析检测中心)，菌种保藏号为GDMCC.No62420，保藏日期为2022年04月24日，保藏地址为广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)，广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

[0028] 有益的技术效果

[0029] 与现有技术相比，本发明技术方案具有以下优点：

[0030] 1、与现有菌种相比，本发明Halomonas sp.YL01菌具有较高的pH耐受度，可耐受pH为6‑11，可耐受高浓度乙酸盐带来的高pH环境，常规的菌种无法耐受pH大于9的培养环境；

[0031] 2、与现有技术相比，本发明提供了一种以乙酸盐为主的碳源作为发酵培养基，可大幅度降低四氢嘧啶的发酵成本。

附图说明

[0032] 图1：Halomonassp.YL01利用乙酸盐和丙酸盐作为混合碳源生产四氢嘧啶代谢通路图；

[0033] 图2：Halomonassp.YL01碳源利用生化鉴定图；

[0034] 图3a为四氢嘧啶标准品谱图、图3b为Halomonassp.YL01利用乙酸盐产四氢嘧啶谱图。

具体实施方式

[0035] 本发明所采用的用于发酵的菌株为盐单胞菌株Halomonassp. YL01，其保藏于广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)，保藏日期为2022年4月24日，保藏编号为GDMCC.No62420。

[0036] 本发明首先在青海省盐湖淤泥取样，利用嗜盐菌筛选培养基60LB对盐湖中的嗜盐菌进行筛选，筛选获得一株盐单胞菌Halomonassp.YL01，然后对Halomonassp.YL01菌种进行碳源利用的生化鉴定，经验证Halomonassp.YL01可以利用乙酸盐、丙酸盐等作为碳源生长。

[0037] 随后，发明人利用常规的生产四氢嘧啶的培养基确定该菌种产四氢嘧啶的能力，再以乙酸盐为主作为碳源，设计60MM培养基为基础营养源，进行摇瓶发酵产四氢嘧啶。最后设计发酵培养基，利用发酵罐发酵，并设计补料培养基，获得菌种发酵以乙酸盐为主碳源生产四氢嘧啶的分批补料发酵方法。

[0038] 具体的，本发明提供一种采用盐单胞菌株Halomonassp. YL01生产四氢嘧啶的发酵方法，所采用的碳源包括乙酸盐或乙酸盐与丙酸盐中构成的混合碳源，通过盐单胞菌株Halomonassp. YL01进行发酵制备，所述乙酸盐在发酵液中的浓度10‑40g/L，丙酸盐在发酵液中的浓度不高于10g/L。发明人经过实验发现，高浓度丙酸盐将抑制菌体的生长，降低四氢嘧啶产量。

[0039] 所述乙酸盐可以为乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵中的一种或几种混合。所述丙酸盐可以为丙酸钠、丙酸钾、丙酸铵中的一种或几种混合。乙酸盐和丙酸盐可以通过市售的方式获得，也可以通过将二氧化碳通过热催化、电催化、光催化等手段转化而成，实现二氧化碳的再利用。

[0040] 所述碳源还可以包括葡萄糖。

[0041] 发酵温度优选为32℃‑37℃，发酵所采用的培养基的pH值为6‑11。

[0042] 其中，当采用摇瓶发酵时，接种盐单胞菌株Halomonassp. YL01至摇瓶培养基，发酵培养，搅拌转速150‑300rpm，发酵持续24h～48h。

[0043] 摇瓶培养基60MM组成：乙酸钠10‑40 g/L、丙酸钠0‑10 g/L、葡萄糖0‑40 g/L、尿素0.5‑10g/L，天冬氨酸 0‑10 g/L，酵母粉1‑15 g/L，无水硫酸镁0.05‑0.6 g/L，磷酸二氢钾
1.5‑5.5 g/L，氯化钠50‑80 g/L，Fe(III)‑NH4‑Citrate 0.05‑0.1 g/L，CaCl2·2H2O 0.02‑
0.2 g/L，ZnSO4·7H2O 0.01‑0.1 g/L，MnCl2·4H2O 0.002‑0.02 g/L，H3BO30.01‑0.05 g/L，CoCl2·6H2O 0.005‑0.02 g/L，CuSO4·5H2O 0.01‑0.08 g/L，NiCl2·6H2O 0.005‑0.01 g/L，NaMoO4·2H2O 0.02‑0.1 g/L。

[0044] 其中，当采用发酵罐发酵时，将菌种按接种量为5％‑15％接入发酵罐培养基；发酵过程中控制溶氧为20％～40％；搅拌转速200‑600rpm；发酵持续24h～48h，发酵期间检测乙酸含量，当乙酸含量低于10g/L添加补料培养基，依据生长情况，前0‑24h补料使用补料Ⅰ，后24‑48h补料使用补料Ⅱ。

[0045] 其中，发酵罐培养基组成(g/L)：

[0046] 乙酸钠10‑40、丙酸钠0‑10、葡萄糖0‑40、氯化钠50‑80 ；酵母膏 1‑10 、MgSO4 1‑10；尿素1‑4 ；磷酸二氢钾3‑10；第一微量元素组分 5‑15、第二微量元素组分1‑5。

[0047] 第一微量元素组分具体包括 Fe(III)‑NH4‑Citrate 3‑7 g/L； CaCl2·2H2O 1‑3 g/L；HCl 3‑7 M ，通过去离子水配制；

[0048] 第二微量元素组分具体包括ZnSO4·7H2O 0.1‑0.2 g/L; MnCl2·4H2O 0.02‑0.04g/L; H3BO30.2‑0.4g/L;CoCl2·6H2O 0.1‑0.3 g/L;CuSO4·5H2O 0.01‑0.03 g/L;
NiCl2·6H2O 0.01‑0.03 g/L;NaMoO4·2H2O 0.02‑0.05 g/L ，通过去离子水配制。

[0049] 进一步优选，第一微量元素组分： Fe(III)‑NH4‑Citrate 5g/L、 CaCl2·2H2O 2 g/L、HCl 5M ，去离子水配制；

[0050] 第二微量元素组分：ZnSO4·7H2O 0.1g/L; MnCl2·4H2O 0.03g/L; H3BO30.3g/L; CoCl2·6H2O 0.2 g/L; CuSO4·5H2O 0.01g/L; NiCl2·6H2O 0.02 g/L; NaMoO4·2H2O0.03g/L ，去离子水配制。

[0051] 其中，补料培养基Ⅰ：乙酸盐300‑1000g/L，尿素 15‑100 g/L，天冬氨酸0‑15 g/L。

[0052] 其中，补料培养基Ⅱ：乙酸钠500‑1000 g/L，尿素 2‑20 g/L，其中乙酸盐的种类可以是乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵中的一种或几种的混合物。

[0053] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

[0054] 下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本发明的不同实施方式。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，他们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。

[0055] 下面通过说明性的具体实施例对本发明进行描述，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。特别说明的是：本发明所用到的试剂除特别说明外均有市售。

[0056] 其他需要说明的是，除非另外定义，本发明实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

[0057] 实验材料和试剂

[0058] 1、菌种筛选所用培养基、乙酸盐发酵培养基及批次补料发酵营养物组分

[0059] 1、菌种筛选培养基

[0060] （1）60LB培养基（g/L）：蛋白胨5‑20，酵母粉3‑10，氯化钠50‑80，pH调至6‑10，用于Halomonassp.YL01的筛分和菌种培养；配置平板即需加入1.5‑2%的琼脂糖。

[0061] （2）60MM培养基（g/L）：乙酸钠10‑40、丙酸钠0‑10、葡萄糖0‑40、尿素0.5‑10，天冬氨酸 0‑10，酵母粉1‑15，无水硫酸镁0.05‑0.6，磷酸二氢钾1.5‑5.5，氯化钠50‑80，Fe(III)‑NH4‑Citrate 0.05‑0.1，CaCl2·2H2O 0.02‑0.2，ZnSO4·7H2O 0.01‑0.1，MnCl2·4H2O 0.002‑0.02，H3BO30.01‑0.05，CoCl2·6H2O 0.005‑0.02，CuSO4·5H2O 0.01‑0.08，NiCl2·6H2O 0.005‑0.01，NaMoO4·2H2O 0.02‑0.1，pH 6‑11。

[0062] 该用于Halomonassp.YL01菌生产四氢嘧啶的基础培养基，在此基础上增加碳源用于生产四氢嘧啶。在培养基中蛋白胨提供微生物生长所需的氮源、酵母粉提供微生物生长2+
所需的氮源、维生素、生长因子等营养；Mg 是TCA途径、EMP途径等多种酶的重要激活剂；磷元素是蛋白质、DNA的重要组成成分。该培养基首先创造高盐环境（5%‑8%），刺激菌体合成四氢嘧啶维持渗透压平衡；尿素转化为铵，铵转化为L‑谷氨酸进入四氢嘧啶合成途径提升四氢嘧啶产量，天冬氨酸是四氢嘧啶的前体物质，可快速转化为四氢嘧啶，提升四氢嘧啶产量，同时高浓度的尿素会抑制菌体产PHB，进一步提升四氢嘧啶产量。

[0063] （3）补料Ⅰ（g/L）：乙酸盐300‑1000，尿素 15‑100，天冬氨酸 0‑15；

[0064] （4）补料Ⅱ（g/L）：乙酸盐500‑1000，尿素 2‑20。

[0065] （5）发酵培养基

[0066] 第一微量元素组分： Fe(III)‑NH4‑Citrate 5g/L、 CaCl2·2H2O2g/L、HCl 5M ，去离子水配制

[0067] 第二微量元素组分：ZnSO4·7H2O 0.1 g/L；MnCl2·4H2O 0.03 g/L；H3BO30.3 g/L；CoCl2·6H2O 0.2 g/L；CuSO4·5H2O 0.01 g/L；NiCl2·6H2O 0.02 g/L；NaMoO4·2H2O 0.03 g/L 去离子水配制。

[0068] 配料（g/L）：乙酸钠10‑40、丙酸钠0‑10、葡萄糖0‑40、氯化钠 50‑80 ；酵母膏 1‑10 、MgSO4 1‑10；尿素1‑4 ；磷酸二氢钾3‑10；第一微量元素组分5‑15、第二微量元素组分1‑5。

[0069] 实施例1Halomonassp.YL01菌种碳源利用的生化鉴定

[0070] 1、盐单胞菌Halomonassp.YL01的获取

[0071] 取青海省盐湖淤泥样1 g后用无菌水连续稀释，涂布于60LB 平板上，37 ℃培养48 h，待菌落长出后挑取单菌落，继续划线传代培养30 d，驯化筛选直至获得纯菌。将得到的纯菌16S rDNA 扩增、测序以及序列比对后，即获得本发明的盐单胞菌Halomonassp.YL01，生物保藏号为：GDMCC.No62420。

[0072] 60LB培养基组分如下（g/L）：蛋白胨10，酵母粉8，氯化钠60，pH调至8。

[0073] 2、生理生化验证

[0074] 采用Biolog的PM高通量微生物代谢表型芯片系统对Halomonassp.YL01的碳源利用进行检测，经过检测获得菌种碳源利用的检测结果，见表1。

[0075] 表1 菌株Halomonassp.YL01生理生化特性‑碳源利用

[0076]

[0077] 通过对表1数据分析显示，Halomonassp.YL01可以利用丙酸、乙酸、丙酮酸等碳源进行生理代谢活动，具备开发以短链脂肪酸为碳源发酵的基础。

[0078] 3、通过测定生长量测定菌株对丙酸、乙酸盐的利用

[0079] ①取接种环在超净工作台上将菌株盐单胞菌Halomonassp.YL01划线至60LB平板上，37 ℃活化24 h，待其长出单克隆；

[0080] ②在超净工作台中用无菌接种环挑取上述①的单克隆抗体，接种至装有5 mL 60LB培养基中的50 mL摇菌管中，37℃200 rpm培养12h，获得种子液。

[0081] ③用移液器将种子液以5%添加量分别添加至含100 ml 60MM（对照组）、100 mL60MM+30g/L乙酸钠、100 mL 60MM+15g/L乙酸钠+15g/L丙酸钠、100 mL 60MM+30g/L丙酸钠、
100 mL60MM+30g/L葡萄糖培养基的500 mL三角瓶中，其中培养基pH为8.0，37℃200 rpm培养12h，测定其生物量（OD600），实验重复三次，结果见图1。

[0082] 60MM培养基个组分（g/L）如下：尿素1，天冬氨酸 0，酵母粉10，无水硫酸镁2，磷酸二氢钾4，氯化钠60，Fe(III)‑NH4‑Citrate 0.05，CaCl2·2H2O 0.02，ZnSO4·7H2O 0.05，MnCl2·4H2O 0.005，H3BO30.01，CoCl2·6H2O 0.005，CuSO4·5H2O 0.01，NiCl2·6H2O0.007，NaMoO4·2H2O 0.02。

[0083] 图2结果表明，盐单胞菌Halomonassp.YL01可以在60MM培养基中维持基本生理活动，但因缺少碳源，生物量没有明显增长。与60MM组对比，以丙酸盐或乙酸盐为唯一碳源均出现了生物量的明显增长，表明盐单胞菌Halomonassp.YL01可以利用单独利用丙酸盐或乙酸盐进行发酵，具有对应的代谢途径。可进行相关的发酵研究。

[0084] 进一步研究发现，以丙酸盐或乙酸盐为唯一碳源条件下，其生物增长量显著低于乙酸盐+丙酸盐的培养基，且乙酸盐+丙酸盐的培养基生物生长量与利用葡萄糖培养基无显著差距。因此选用丙酸盐和乙酸盐构成的混合碳源进一步进行四氢嘧啶发酵研究，其代谢路径如图1所示。

[0085] 实施例2 摇瓶发酵产四氢嘧啶

[0086] ①用接种环在超净工作台上将菌株盐单胞菌Halomonassp.YL01划线至60LB平板上，37 ℃活化24 h，待其长出单克隆；

[0087] ②在超净工作台中用无菌接种环挑取上述①的单克隆抗体，接种至装有5mL 60LB培养基中的50mL摇菌管中，37℃200 rpm培养12H，获得种子液。

[0088] ③在超净工作台上用移液器将种子液以5%添加量添加至含200 mL 60MM+20g/L乙酸钠+10g/L丙酸钠培养基（pH为9）的1000 mL三角瓶中，37℃，200 rpm培养24 h。

[0089] 60MM培养基个组分（g/L）如下：尿素1，天冬氨酸 0，酵母粉10，无水硫酸镁2，磷酸二氢钾4，氯化钠60，Fe(III)‑NH4‑Citrate 0.05，CaCl2·2H2O 0.02，ZnSO4·7H2O 0.05，MnCl2·4H2O 0.005，H3BO30.01，CoCl2·6H2O 0.005，CuSO4·5H2O 0.01，NiCl2·6H2O0.007，NaMoO4·2H2O 0.02。

[0090] 60LB培养基组分如下（g/L）：蛋白胨10，酵母粉8，氯化钠60，pH调至8。

[0091] 四氢嘧啶含量测定：取发酵后菌液，用超声波细胞破碎仪破碎细胞，将破碎后液体12200g离心10min，取上清， 0.22μm滤膜过滤，完成样品处理。高效液相色谱法（HPLC）采用C18色谱柱；流动相为乙腈（A 液）和纯水（B 液）且A:B=70:30；进样量 10 μL；流速 1 mL/min；检测波长 210 nm。

[0092] 从图3a的四氢嘧啶标准谱图和采用本实施例方法制备的四氢嘧啶谱图对比可以看出，两者相同，证明采用乙酸和丙酸作为碳源，采用盐单胞菌Halomonassp.YL01可以很好的生产四氢嘧啶。

[0093] 实施例3

[0094] 采用与实施例2相同的方法，区别在于，所采用的碳源为20g/L乙酸钠+10g/L丙酸钠。

[0095] 实施例4

[0096] 采用与实施例2相同的方法，区别在于，所采用的碳源为20g/L乙酸钠+5g/L乙酸钾+5g/L丙酸钠。

[0097] 实施例5

[0098] 采用与实施例2相同的方法，区别在于，所采用的碳源为10g/L乙酸钠+20g/L丙酸钠。

[0099] 实施例6

[0100] 采用与实施例2相同的方法，区别在于，所采用的碳源为25g/L乙酸钠+5g/L丙酸钠。

[0101] 实施例7

[0102] 采用与实施例2相同的方法，区别在于，所采用的碳源为5g/L乙酸钠+25g/L丙酸钠。

[0103] 实施例8

[0104] 采用与实施例2相同的方法，区别在于，所采用的碳源为15g/L 葡萄糖+10g/L乙酸钠+5g/L丙酸钠。

[0105] 实施例9

[0106] 采用与实施例2相同的方法，区别在于，所采用的碳源为10g/L 葡萄糖+10g/L乙酸钠+10g/L丙酸钠。

[0107] 比较例1

[0108] 采用与实施例2相同的方法，区别在于，所采用的碳源为30g/L乙酸钠。

[0109] 比较例2

[0110] 采用与实施例2相同的方法，区别在于，所采用的碳源为30g/L丙酸钠。

[0111] 比较例3

[0112] 采用与实施例2相同的方法，区别在于，所采用的碳源为30g/L葡萄糖。

[0113] 表2 不同乙酸盐和丙酸盐作为碳源条件下摇瓶发酵产四氢嘧啶的含量

[0114]

[0115] 由表2可知，采用葡萄糖作为碳源的比较例3的四氢嘧啶产量最高，而采用乙酸盐和丙酸盐作为混合碳源的实施例2的四氢嘧啶产量与比较例3较为接近，为8.1g/L，其次为实施例8。通过该表可以看出，当加丙酸盐浓度高于10g/L时，四氢嘧啶含量逐渐降低，表明在高浓度丙酸盐的刺激下，盐单胞菌的生长明显被抑制，四氢嘧啶产量随之下降。这是因为高浓度丙酸进入胞内时，可降低胞内pH值，同时破坏微生物细胞内环境稳态，抑制DNA复制、表达、抑制微生物增殖。

[0116] 菌株在以乙酸盐或丙酸盐为唯一碳源下，产量明显低于丙酸盐和乙酸盐。可能是因为当菌体同时利用两种盐时，不同的碳源可以进入不同的代谢途径，提升碳源利用效率，增强四氢嘧啶的合成。

[0117] 不同pH条件下摇瓶发酵产四氢嘧啶的含量

[0118] 实施例10

[0119] 采用与实施例2相同的方法，区别在于，pH值调整为6。

[0120] 实施例11

[0121] 采用与实施例2相同的方法，区别在于，pH值调整为10。

[0122] 比较例4

[0123] 采用与实施例2相同的方法，区别在于，pH值调整为4。

[0124] 比较例5

[0125] 采用与实施例2相同的方法，区别在于，pH值调整为5.5。

[0126] 表3 不同pH条件下摇瓶发酵产四氢嘧啶的含量

[0127]

[0128] 由表3可知，pH偏向酸性时，四氢嘧啶含量明显下降，且随着pH的逐渐下降，四氢嘧啶含量下降明显，当pH等于4时，菌株几乎不产生四氢嘧啶，而当pH偏碱性时，四氢嘧啶含量明显增加，当pH等于10时，四氢嘧啶含量最高。这是因为Halomonassp.YL01菌生长的原生环境为高盐碱环境，其最适生长的pH值为碱性，细胞壁结构更适应碱性环境，因此处于酸性环境时，细胞生长不良，对应四氢嘧啶产量较低。

[0129] 不同发酵温度下摇瓶发酵产四氢嘧啶的含量

[0130] 实施例13

[0131] 采用与实施例2相同的方法，区别在于，温度调整为32℃。

[0132] 实施例14

[0133] 采用与实施例2相同的方法，区别在于，温度调整为35℃。

[0134] 比较例6

[0135] 采用与实施例2相同的方法，区别在于，温度调整为20℃。

[0136] 比较例7

[0137] 采用与实施例2相同的方法，区别在于，温度调整为25℃。

[0138] 表4 不同温度条件下摇瓶发酵产四氢嘧啶的含量

[0139]

[0140] 由表4可知，随着温度的逐渐下降，四氢嘧啶含量逐渐降低，随着温度的下降，菌株体内酶的活性逐渐降低，菌体生长缓慢，对应四氢嘧啶合成酶的活性降低，导致四氢嘧啶生成量较低。

[0141] 不同底盘菌对发酵生产四氢嘧啶的影响

[0142] 比较例8

[0143] 采用与实施例2相同的方法，区别在于发酵菌种选用Halomonas elongate（菌种保藏编号：ATCC33173）

[0144] 比较例9

[0145] 采用与实施例2相同的方法，区别在于发酵菌种Halomonas salina（菌种保藏编号：ATCC49509）

[0146] 表5不同底盘菌对发酵生产四氢嘧啶的影响

[0147]

[0148] 由表5可知，选用同样的发酵方法，除Halomonas sp.YL01菌，其余菌不能很好的发酵乙酸盐和丙酸盐产四氢嘧啶。这与不同菌体代谢途径不同有关，当菌体缺少乙酸或丙酸代谢相关的酶时，高浓度的乙酸盐或丙酸盐会进入菌体内部，破坏菌体内环境的稳定，对菌体具有毒害作用，抑制菌体生长甚至杀死菌体。

[0149] 实施例15 发酵罐发酵产四氢嘧啶

[0150] ①用接种环在超净工作台上将菌株盐单胞菌Halomonassp.YL01划线至60LB平板上，37 ℃活化24 h，待其长出单克隆；

[0151] ②在超净工作台中用无菌接种环挑取上述①的单克隆抗体，接种至装有5mL60LB培养基中的50mL摇菌管中，37℃200rpm培养12H，获得一级种子液。

[0152] ③在超净工作台上用移液器将一级种子液以10%添加量接种至含有100ml 60LB培养基的中500mL三角瓶中，37℃200rpm培养12H，获得二级种子液。

[0153] ④发酵罐培养基配制

[0154] 配料（g/L）：乙酸钠20、丙酸钠10、葡萄糖0、氯化钠 50 ；酵母膏 1.5、MgSO4 5；尿素3 ；磷酸二氢钾5；第一微量元素组分 10、第二微量元素组分2。

[0155] 第一微量元素组分： Fe(III)‑NH4‑Citrate 5g/L、 CaCl2·2H2O 2 g/L、HCl 5M /L，去离子水配制

[0156] 第二微量元素组分：ZnSO4·7H2O 0.1 g/L；MnCl2·4H2O 0.03 g/L；H3BO30.3 g/L；CoCl2·6H2O 0.2 g/L；CuSO4·5H2O 0.01 g/L；NiCl2·6H2O 0.02 g/L；NaMoO4·2H2O 0.03 g/L 去离子水配制。

[0157] ⑤补料培养基配制

[0158] 补料Ⅰ（g/L）：乙酸盐500，尿素 50，天冬氨酸 2；

[0159] 补料Ⅱ（g/L）：乙酸盐800，尿素15。

[0160] 60LB培养基组分如下（g/L）：蛋白胨10，酵母粉8，氯化钠60，pH调至8。

[0161] 按上述发酵培养基配方配制发酵培养基。

[0162] 将二级种子液按8%接种于15L发酵罐（培养基总体积为10L）中的培养基中，调整发酵温度为37℃，pH为9，通气量为1vvm，控制发酵溶解氧为30%，搅拌转速联动溶解氧，发酵时间为48h，发酵期间检测乙酸含量，当乙酸含量低于10g/L添加补料培养基，依据生长情况，24h前使用补料Ⅰ补料，24h后使用补料Ⅱ补料，其中补料的乙酸盐类型为乙酸钾。

[0163] 实施例16 采用与实施例15相同的方法，区别在于发酵溶解氧为20%。

[0164] 实施例17 采用与实施例15相同的方法，区别在于发酵溶解氧为40%。

[0165] 表6 不同溶解氧下发酵罐发酵产四氢嘧啶的含量

[0166]

[0167] 由表6可知，发酵期间的溶解氧含量对四氢嘧啶产量影响较小，其溶解氧合适范围为20‑40%，其中最优为30%。

[0168] 通过对Halomonassp.YL01菌的代谢通路进行分析，可知该菌具有代谢乙酸的通路。进一步通过实验验证Halomonassp.YL01可发酵乙酸盐、丙酸盐产四氢嘧啶，且采用乙酸盐和丙酸盐构成的混合碳源进行发酵，使四氢嘧啶产量对比葡萄糖无显著差异，是一种很好的替代葡萄糖生产四氢嘧啶的手段。

[0169] 所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。

[0170] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。