一种成品免疫细胞的冻存液及其制备方法和冻存方法

摘要

本发明公开一种成品免疫细胞的冻存液及其制备方法和冻存方法。冻存液包括聚蔗糖1‑3.7wt％，羟甲基壳聚糖1‑2wt％，人血白蛋白5‑15wt％，泛影葡胺1‑9wt％，二甲基亚砜5‑10v/v％，乙二胺四乙酸三钾的浓度为1.2‑2.5mg/ml，聚乙烯吡咯烷酮K30 10‑50mg/ml；采用磷酸盐缓冲液配制各组分再按上述组成进行配方得到冻存液。本发明冻存液成分明确，不含异种来源的血清及蛋白，可控性，安全性和稳定性；具有与成品免疫细胞一致的比重，配合快速降温方式，使细胞降温过程中始终保持悬着态，避免了细胞降温过程中沉底而导致细胞挤压受损，从而保证高密度冻存状态下仍能保持较好的细胞活性。

权利要求

1.一种成品免疫细胞的冻存液，其特征在于，组成如下：聚蔗糖 1‑3.7wt%，羟甲基壳聚糖1‑2wt%，人血白蛋白 5‑15wt%，泛影葡胺 1‑9wt%，二甲基亚砜5‑10 v/v%，乙二胺四乙酸三钾EDTAK3.H2O 在冻存液中的浓度为1.2‑2.5 mg/ml，聚乙烯吡咯烷酮K30在冻存液中的浓度为 10‑50 mg/ml ，其中wt%表示质量百分比，v/v%表示体积百分比，采用磷酸盐缓冲液配制；所述的成品免疫细胞的冻存液的制备方法，包括如下步骤：首先确定需要配置的冻存液体积，采用磷酸盐缓冲液配制乙二胺四乙酸三钾、聚蔗糖、羟甲基壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮K30、人血白蛋白、泛影葡胺，然后混合均匀，最后滴加二甲基亚砜DMSO混合均匀，并控制各组分的质量百分比、体积百分比或浓度满足组成要求。

2.权利要求1所述的成品免疫细胞的冻存液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：首先确定需要配置的冻存液体积，采用磷酸盐缓冲液配制乙二胺四乙酸三钾、聚蔗糖、羟甲基壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮K30、人血白蛋白、泛影葡胺，然后混合均匀，最后滴加二甲基亚砜DMSO混合均匀，并控制各组分的质量百分比、体积百分比或浓度满足权利要求1所述的组成要求。

3.一种成品免疫细胞的冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：

1，取培养好并检测合格的免疫细胞原液离心8‑15分钟，去上清；

2，将步骤1所得细胞沉淀用缓冲溶液重悬；

3，将步骤2所得细胞悬液用细胞筛过滤，离心8‑15分钟，去上清；

4，用定量的缓冲溶液重悬步骤3所得细胞，取样计数，计活率；

5，分出所需数量的细胞悬液分装配平，离心8‑15分钟，去上清；

6，采用预冷的权利要求1所述的冻存液将细胞重悬，将悬液转移到冻存容器中；

7，将冻存容器放入‑80℃保存10‑16小时后转存至液氮中保存。

4.根据权利要求3所述的成品免疫细胞的冻存方法，其特征在于，去上清时，将液体倒出，且保持细胞沉淀不动，残余液体用医用无菌吸水纸吸出。

5.根据权利要求3所述的成品免疫细胞的冻存方法，其特征在于，还包括冻存后的复苏，具体为：（1）从液氮中取出细胞，35‑40℃水浴中快速融化；

（2）准备两只50ml离心管，分别加入5‑20ml完全培养基，将细胞悬液平均转移到两只

50ml的离心管中，用缓冲液清洗冻存容器至少3次，并将液体一并转移到离心管中；

（3）将两支离心管分别定容至50ml，吹吸液体，使得原保存液与缓冲液充分互溶，降低整体比重，离心5‑15分钟，去上清；

（4）再次加入缓冲液，并向每支离心管加入1‑10ml质量分数为15‑20%的人血白蛋白，重悬步骤（3）所得细胞，每支离心管补齐50ml，混匀细胞后离心8‑15分钟，去上清；

（5）将步骤（4）所得细胞重悬液转移至一支50ml离心管中，加入1‑10ml质量分数为20%的人血白蛋白，重悬细胞，离心管补齐50ml，混匀细胞后离心8‑15分钟，去上清；

（6）向步骤（5）所得细胞中加入1‑10ml质量分数为20%的人血白蛋白并用缓冲液重悬细胞，取样计数及活率。

说明书

一种成品免疫细胞的冻存液及其制备方法和冻存方法

技术领域

[0001] 本发明涉及免疫细胞的保存，特别涉及一种成品免疫细胞的冻存液及其制备方法和冻存方法。

背景技术

[0002] 恶性肿瘤一直是人类挥之不去的疾病之一，是机体正常细胞恶变的产物,具有不断增殖并有可能在体内转移的特点。为了生存和生长，肿瘤细胞能够采用不同策略抑制人体的免疫系统,使其不能正常地杀伤肿瘤细胞，从而在抗肿瘤免疫应答的各阶段得以幸存。

[0003] 目前治疗肿瘤传统方式主要包括手术、化疗、放疗为主，辅以内分泌、中药等，但均存在较严重并发症和副作用。

[0004] 近年来，随着人类基因组和癌症基因组计划的顺利实施，免疫细胞疗法得到了突飞猛进的发展。

[0005] 其中，NK细胞是人体重要的免疫细胞之一。NK细胞一旦发现了癌细胞、细菌、病毒的踪迹，即可在5分钟以内将其消灭，高效密集保卫着我们的身体不受侵害。NK细胞免疫疗法是通过向肿瘤患者输注在体外培养扩增或激活后，具有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞，达到目的。

[0006] 又如，CIK细胞主要用于自体骨髓移植物的净化、微小残留病灶的清除及晚期恶性肿瘤(包括急慢性血液系统恶性疾病和各种实体瘤)的免疫治疗，副作用轻微，患者耐受较好。因此，CIK细胞免疫治疗值得我们进一步开展更为详细而深入的研究。

[0007] 2017年CAR‑T细胞免疫治疗首次获批，用于晚期的肿瘤治疗。2021年，中国首个CAR‑T细胞面世，免疫细胞用于治疗各种疾病的技术已经发展得越来越成熟。

[0008] 在免疫细胞的临床使用中，往往因为细胞质量检测、运输、患者病情不稳定等因素，导致细胞不能及时回输，此时就需要临时保存于液氮中，待需要时再取出应用。实验室常见的冻存方式一般是添加异种来源血清，和目前市售的无血清冻存液。但添加异种血清会存在一定的风险，再者目前这两种方式在高密度冻存后细胞活性很难保障，所以在本技术领域里，当前还缺乏一种免疫细胞成品细胞的高密度冻存，以确保在小体积冻存下方便操作，成本较低，不占宝贵的低温空间，同时保证细胞活性的方式。

发明内容

[0009] 针对现有技术存在的免疫细胞高密度冻存后活性很难保障的技术问题，本发明提供一种成品免疫细胞的冻存液及其制备方法和冻存方法，用于免疫细胞的高密度冻存，冻存后能够保持高活性。

[0010] 本发明成品免疫细胞的冻存液，组成如下：聚蔗糖1‑3.7wt％，羟甲基壳聚糖1‑2wt％，人血白蛋白5‑15wt％，泛影葡胺1‑9wt％，二甲基亚砜(DMSO)5‑10v/v％，控制乙二胺四乙酸三钾(EDTAK3.H2O)在冻存液中的浓度为1.2‑2.5mg/ml，聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)在冻存液中的浓度为10‑50mg/ml，其中wt％表示质量百分比，v/v％表示体积百分比，采用磷酸盐缓冲液(PBS)配制。

[0011] 上述成品免疫细胞的冻存液的制备方法，包括如下步骤：

[0012] 首先确定需要配置的冻存液体积，采用磷酸盐缓冲液(PBS)配制乙二胺四乙酸三钾(EDTAK3.H2O)、聚蔗糖、羟甲基壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、人血白蛋白、泛影葡胺，然后混合均匀，最后滴加二甲基亚砜(DMSO)混合均匀，并控制各组分的质量百分比、体积百分比或浓度满足上述组成的。

[0013] 采用上述冻存液冻存成品免疫细胞的方法，包括如下步骤：

[0014] 1，取培养好并检测合格的免疫细胞原液离心8‑15分钟，去上清；

[0015] 2，将步骤1所得细胞沉淀用缓冲溶液重悬(重悬要确保轻柔)；

[0016] 3，将步骤2所得细胞悬液用细胞筛过滤，离心8‑15分钟，去上清；

[0017] 4，用定量的缓冲溶液重悬步骤3所得细胞(重悬要确保轻柔)，取样计数，计活率；

[0018] 5，分出所需数量的细胞悬液分装配平，离心8‑15分钟，去上清(用无菌吸水纸吸净液体)；

[0019] 6，采用预冷的上述冻存液将细胞重悬(重悬要确保轻柔)，控制终体积为所需的冻存体积，将悬液转移到冻存容器中，整个过程动作轻柔，液体尽可能吸干净；

[0020] 7，将冻存容器放入‑80℃保存10‑16小时后转存至液氮中保存，此降温环节相比程序降温更快速便捷。

[0021] 上述冻存方法中，多处涉及去上清，去上清时，因为细胞数量多，容易残留较多液体或者损失较多细胞，因此在去上清时，优选将液体倒出，但保持细胞沉淀不动，残余液体用医用无菌吸水纸小心吸出，通过无菌吸水纸吸水，从而能够减少液体残留，降低对后续步骤中冻存液的稀释。

[0022] 采用上述方法对成品免疫细胞进行冻存后，复苏方法如下：

[0023] (1)从液氮中取出细胞，35‑40℃水浴中快速融化；

[0024] (2)准备两只50ml离心管，分别加入5‑20ml完全培养基，将细胞悬液平均转移到两只50ml的离心管中，用缓冲液清洗冻存容器至少3次，并将液体一并转移到离心管中；

[0025] (3)将两支离心管分别定容至50ml，吹吸液体(吹吸要确保轻柔)，使得原保存液与缓冲液充分互溶，降低整体比重，离心5‑15分钟，去上清；

[0026] (4)再次加入缓冲液，并向每支离心管加入1‑10ml质量分数为15‑20％的人血白蛋白，重悬步骤(3)所得细胞(重悬要确保轻柔)，每支离心管补齐50ml，混匀细胞后离心8‑15分钟，去上清；

[0027] (5)将步骤(4)所得细胞重悬液转移至一支50ml离心管中，加入1‑10ml质量分数为20％的人血白蛋白，重悬细胞(重悬要确保轻柔)，离心管补齐50ml，混匀细胞后离心8‑15分钟，去上清；

[0028] (6)向步骤(5)所得细胞中加入1‑10ml质量分数为20％的人血白蛋白并用缓冲液重悬细胞，取样计数及活率。

[0029] 以上步骤中添加的人血白蛋白，能够有效提升复苏细胞的活性以及细胞收获数量。

[0030] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

[0031] (1)本发明的冻存液各组分互相配合，共同发挥作用，EDTAK3.H2O能有效结合残留2+
的Ca 离子，使细胞与细胞间不能形成有效连接，使得细胞始终保持单个状态；羟甲基壳聚糖与PVP K30都具有非常强的生物相容性，同时与聚蔗糖、泛影葡胺共同组成多元溶解物，使得整个保存液处于一个比重与成品免疫细胞相似的微胶状态，与配置时使用的PBS同时作用来维持细胞的渗透压与pH，可以始终保持细胞处于游离的悬浮态，减少因细胞沉降造成的细胞挤压。人血白蛋白作为营养类保护剂。DMSO为渗透性保护剂，降低冰点，减小冰晶对细胞的破坏。

[0032] (2)本发明的冻存液所有成分明确，不含异种来源的血清以及蛋白，具有非常高的可控性，安全性和稳定性。本发明保存液具有与成品免疫细胞一致的比重，配合快速降温方式，使细胞在降温的过程中始终保持悬着态，避免了细胞在降温过程中沉底而导致细胞挤压受损，从而保证了即使在高密度冻存状态下仍能保持较好的细胞活性，用本发明保存的细胞密度可高达30亿/5ml，高密度冻存下细胞活性损失低于3％。

附图说明

[0033] 图1至7分别为采用本发明实施例1所得冻存液处理后的外周血单个核细胞PBMC诱导成NK细胞的照片，图1至7分别对应于扩增1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天。

[0034] 图8为NK诱导培养第14天‑流式检测图。

[0035] 图9为1‑NK1诱导培养第五天时的显微照片；

[0036] 图10为1‑NK2诱导培养第五天时的显微照片；

[0037] 图11为1‑NK3诱导培养第五天时的显微照片；

[0038] 图12为2‑NK1诱导培养第五天时的显微照片；

[0039] 图13为2‑NK2诱导培养第五天时的显微照片；

[0040] 图14为2‑NK3诱导培养第五天时的显微照片。

具体实施方式

[0041] 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明并不限于此[0042] 实施例1

[0043] 冻存液及其制备：

[0044] 冻存液的主要成分为：EDTAK3.H2O 1.2mg/ml；聚蔗糖3.7wt％；羟甲基壳聚糖2wt％；PVP K30 10mg/ml；人血白蛋白5wt％；泛影葡胺8wt％，DMSO 10v/v％，所有成分均用PBS配制。

[0045] 实施例2

[0046] 冻存液及其制备：

[0047] 冻存液的主要成分为：EDTAK3.H2O 1.0mg/ml；聚蔗糖1.5wt％；羟甲基壳聚糖1wt％；PVP K30 20mg/ml；人血白蛋白7wt％；泛影葡胺7wt％，DMSO 5v/v％，所有成分均用PBS配制。

[0048] 实施例3

[0049] 冻存液及其制备：

[0050] 冻存液的主要成分为：EDTAK3.H2O 1.3mg/ml；聚蔗糖3.5wt％；羟甲基壳聚糖1.5wt％；PVP K30 25mg/ml；人血白蛋白10wt％；泛影葡胺5wt％，DMSO 8v/v％，所有成分均用PBS配制。

[0051] 实施例4

[0052] 冻存液及其制备：

[0053] 冻存液的主要成分为：EDTAK3.H2O 1.1mg/ml；聚蔗糖2wt％；羟甲基壳聚糖1.3wt％；PVP K30 50mg/ml；人血白蛋白15wt％；泛影葡胺7.5wt％，DMSO 10v/v％，所有成分均用PBS配制。

[0054] 以下实施例涉及本发明的冻存液均为实施例1所得冻存液。

[0055] 实施例5

[0056] 验证本发明复苏方式对于高密度冻存细胞的复苏效果

[0057] 将两份不同的外周血，分别用淋巴分离液密度梯度离心获得PBMC(外周血单个核细胞)，使用友康4.0NK培养基培养细胞，培养结束后，每份样本分别用本发明冻存液冻存两8
支数量为20×10。

[0058] 以下述方式冻存：

[0059] 1.取培养好并检测合格的免疫细胞原液300g离心10分钟，去上清；

[0060] 2.细胞沉淀用缓冲溶液轻柔重悬；

[0061] 3.将细胞悬液用40um细胞筛过滤，300g离心10分钟，去上清；

[0062] 4.用定量的缓冲溶液轻柔重悬细胞，取样计数，计活率；

[0063] 5.分出所需数量的细胞悬液分装配平，300g离心10分钟，去上清；

[0064] 6.用预冷的上述冻存液将细胞轻柔重悬，使得终体积刚好为所需的冻存体积，将悬液转移到冻存容器中，整个过程动作轻柔，液体尽可能吸干净；

[0065] 7.将冻存容器直接放入‑80℃保存12小时后转存至液氮中保存。

[0066] 将两个样本分别取一支编为A组(分别标记为a1和a2)，按下述方案复苏：

[0067] 1.从液氮中取出细胞，37℃水浴中快速融化；

[0068] 2.准备两只50ml离心管，分别加入5ml完全培养基，将细胞悬液平均转移到两只50ml的离心管中，用缓冲液清洗冻存容器至少3次，并将液体一并转移到离心管中；

[0069] 3.将两支离心管分别定容至50ml,轻柔吹吸液体，使得原保存液与缓冲液充分互溶，降低整体比重，350g离心10分钟，去上清；

[0070] 4.再次加入适量缓冲液，并每支离心管加入1ml质量分数为20％的人血白蛋白，轻柔重悬细胞，每支离心管补齐50ml，混匀细胞后300g离心10分钟，去上清；

[0071] 5.将上一步细胞重悬转移至一支50ml离心管中，加入1ml质量分数为20％的人血白蛋白，轻柔重悬细胞，离心管补齐50ml，混匀细胞后300g离心10分钟，去上清；

[0072] 6.加入1ml质量分数为20％的人血白蛋白并用定量的缓冲液重悬细胞，取样计数及活率剩下两支细胞为B组(分别标记为b1和b2)：

[0073] 其余步骤一致，区别在于复苏时不加完全培养基和人血白蛋白。

[0074] 结果如下表1所示：

[0075] 表1不同冻存复苏方法复苏后的细胞数量及活性表

[0076]

[0077]

[0078] 从表1能够得出，用本发明冻存复苏方法复苏后的细胞在收获数量以及活性保持上显著高于传统复苏方式。

[0079] 实施例6

[0080] 验证本发明对PBMC的冻存效果

[0081] 以实验室常用的冻存液配方(胎牛血清：DMSO＝9:1，冻存液A)作为对照，对比本发明的冻存液(记为冻存液B)，及BI无血清冻存液(冻存液C)对于成品免疫细胞的冻存效果。

[0082] 取9份外周血，每份50ml，分别用淋巴分离液密度梯度离心获得PBMC(外周血单个核细胞)，用生理盐水洗涤2次，后用40ml生理盐水将PBMC重悬，取样用台盼蓝染色计数计活7
率。9份样本用冻存液A、冻存液B、冻存液C分别冻存三份。每份冻存规格为5.0×10 /管(1.8ml)。程序降温后，保存于液氮至少3天。

[0083] 取出冻存的PBMC在37℃水浴中快速融化，用生理盐水洗涤两次，再用40ml无血清免疫细胞培养基重悬取样，台盼蓝染色计数计活率。

[0084] 冻存数据及复苏数据见于下表2。使用冻存液A、冻存液B和冻存液C冻存的PBMC，冻存时的活率与复苏后的活率损失幅度，相互间没有显著性差异(P>0.05)，由此可见，本发明无血清冻存液B在冻存PBMC时，与市售及实验室常用冻存液都能较好地保持PBMC细胞活性，有较好的冻存效果。

[0085] 表2冻存数据及复苏数据

[0086]

[0087] 实施例7

[0088] 验证经过本发明快速冻存的PBMC细胞诱导扩增成NK细胞的生长能力[0089] 对照组(组1)：取三份外周血，每份50ml，分别用淋巴分离液密度梯度离心获得PBMC(外周血单个核细胞)，用生理盐水洗涤2次，后用40ml无血清免疫细胞培养基将PBMC重7
悬，取样用台盼蓝染色计数计活率。用(胎牛血清：DMSO＝9:1)，每份冻存规格为5.0×10 /管(1.8ml)。快速冻存(分装入冻存管后直接放入‑80℃过夜后转存于液氮中)，保存于液氮至少3天。

[0090] 取出冻存的PBMC在37℃水浴中快速融化，用生理盐水洗涤两次，再用40ml无血清免疫细胞培养基重悬取样，台盼蓝染色计数计活率。

[0091] 使用友康NK4.0细胞培养套装，按照友康提供相关试剂SOP诱导扩增PBMC,得到扩增后的NK细胞。取样计数计活率，用流式细胞仪检测(CD3‑,CD56+)细胞占比。

[0092] 实验组(组2)：另取3份外周血，每人50ml，用淋巴分离液密度梯度离心获得PBMC(外周血单个核细胞)，用生理盐水洗涤2次，后用40ml生理盐水将PBMC重悬，取样用台盼蓝染色计数计活率。用本发明冻存液按本发明冻存方法冻存，每份冻存规格为5.0×107/管(1.8ml)。快速冻存(分装入冻存管后直接放入‑80℃过夜后转存于液氮中)，保存于液氮至少3天。

[0093] 取出冻存的PBMC在37℃水浴中快速融化，按本发明复苏方法复苏，再用40ml无血清免疫细胞培养基重悬取样，台盼蓝染色计数计活率。

[0094] 使用友康NK4.0细胞培养套装，按照友康提供相关试剂SOP诱导扩增PBMC,得到扩增后的NK细胞。取样计数计活率，用流式细胞仪检测(CD3‑,CD56+)细胞占比。结果如表3所示。

[0095]

[0096] 表3不同组别的细胞活率

[0097]

[0098]

[0099] 从表3能够得出，本发明不影响PBMC的分化与增值，从图9、图10、图11、图12、图13、图14得出，本发明处理后的PBMC在生长速度上明显快于传统的冻存处理过后的PBMC。

[0100] 实施例8

[0101] 验证本发明冻存液高浓度冻存诱导培养后的免疫细胞的效果

[0102] 组A:取3份外周血，每份50ml，分别用淋巴分离液密度梯度离心获得PBMC(外周血单个核细胞)，用生理盐水洗涤2次，后用40ml无血清免疫细胞培养基将PBMC重悬，取样用台盼蓝染色计数计活率。使用友康NK4.0细胞培养套装，按照友康提供相关试剂SOP诱导扩增8
PBMC,得到足够数量的扩增后的NK细胞。取样计数计活率。分别将每份细胞按照10×10 /管
8 8
(5ml)、20×10/管(5ml)、30×10/管(5ml)用胎牛血清：DMSO＝9:1的冻存液运用本发明冻存方式冻存。于液氮至少保存3天后取出，按本发明复苏方式复苏后计数计活率。结果如表4所示。

[0103] 组B:取3份外周血，每份50ml，分别用淋巴分离液密度梯度离心获得PBMC(外周血单个核细胞)，用生理盐水洗涤2次，后用40ml无血清免疫细胞培养基将PBMC重悬，取样用台盼蓝染色计数计活率。使用友康NK4.0细胞培养套装，按照友康提供相关试剂SOP诱导扩增8
PBMC,得到足够数量的扩增后的NK细胞。取样计数计活率。分别将每份细胞按照10×10 /管
8 8
(5ml)、20×10/管(5ml)、30×10/管(5ml)用本发明冻存液及本发明冻存方法冻存。于液氮至少保存3天后取出，按本发明复苏方式复苏后计数计活率。结果如表5所示。

[0104] 组C:取3份外周血，每份50ml，分别用淋巴分离液密度梯度离心获得PBMC(外周血单个核细胞)，用生理盐水洗涤2次，后用40ml无血清免疫细胞培养基将PBMC重悬，取样用台盼蓝染色计数计活率。使用友康NK4.0细胞培养套装，按照友康提供相关试剂SOP诱导扩增8
PBMC,得到足够数量的扩增后的NK细胞。取样计数计活率。分别将每份细胞按照10×10 /管
8
(5ml)、20×10/管(5ml)、30×108/管(5ml)用BI无血清冻存液按本发明冻存方法冻存。于液氮至少保存3天后取出，按本发明复苏方式复苏后计数计活率。结果如表6所示。

[0105] 表4 组A

[0106]

[0107] 表5 组B

[0108]

[0109] 表6 组C

[0110]

[0111]

[0112] 从表4、表5、表6能够得出，冻存液A和冻存液C在冻存成品NK细胞时，在浓度为10×8
10/管(5ml)时，活率与冻存前没有明显差异，对细胞有较好的保存效果；但是在浓度为20
8 8
×10/管(5ml)、30×10/管(5ml)时，细胞数量及活率与冻存前存在极显著差异，且表现为
8 8
浓度越大，差异越大。本发明冻存液B冻存的细胞在10×10 /管(5ml)、20×10/管(5ml)、30
8
×10 /管(5ml)浓度冻存中都与冻存前没有明显差异，能较好保证成品NK细胞的活性及数量。