抗菌药物组合物及其应用转让专利
申请号 : CN202211364769.2
文献号 : CN115645414B
文献日 : 2023-09-15
发明人 : 游雪甫 , 庞晶 , 卢曦 , 汪燕翔 , 胡辛欣 , 聂彤颖 , 杨信怡 , 李聪然 , 王秀坤 , 李雪 , 卢芸 , 李国庆 , 张友文 , 孙琅 , 郭威 , 张芷萌
申请人 : 中国医学科学院医药生物技术研究所
摘要 :
本发明提供一种抗菌药物组合物及其应用。本发明考察了雷公藤红素对肠球菌的抗菌和抗生物膜活性，以及其辅助恢复VRE对万古霉素敏感性的能力。研究结果显示，雷公藤红素对包括VRE在内的肠球菌具有明显的抗菌和抗生物膜活性。在体外和体内，雷公藤红素的亚最小抑菌浓度恢复了万古霉素对VRE的活性。万古霉素和雷公藤红素的联用产生了协同作用，雷公藤红素有望作为新抗菌剂或万古霉素的增敏剂，为VRE的治疗提供选择方案。
权利要求 :
1.抗菌药物组合物在制备抗菌生物制品中的应用；其中，所述菌选自耐万古霉素的粪肠球菌和耐万古霉素的屎肠球菌；
所述抗菌药物组合物的活性成分为雷公藤红素和万古霉素；
雷公藤红素与万古霉素的质量比为1:16 1:2。
~
说明书 :
抗菌药物组合物及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及一种抗菌药物组合物及其应用。
背景技术
[0002] 肠球菌是主要存在于人类和动物胃肠道的共生细菌，被认为是院内感染的主要原因之一(Agudelo Higuita等，2014；Kim等，2019)。已鉴定出20多种肠球菌，其中粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和屎肠球菌(Enterococcus faecium)是临床最相关的种属，由此引起的最常见的感染是尿路感染、菌血症、心内膜炎和手术部位感染。严重肠球菌感染的死亡率高达20％‑40％(Miro等，2013年)。研究显示，过去的十多年间氨苄西林和万古霉素耐药肠球菌的院内感染呈上升趋势(Haque等，2018)。多重耐药肠球菌，尤其是万古霉素耐药肠球菌(VRE)的出现和传播，对临床治疗构成了严重威胁。世界卫生组织将耐万古霉素的屎肠球菌列入“高度优先病原体”清单(WHO，2017年)。因此，亟需开发新的具有新骨架的新型抗菌剂或发现新的策略来治疗VRE引起的感染。
[0003] 天然产物自古以来为人们提供了丰富的药物来源，吐根碱、青蒿素、鱼腥草素及小檗碱等活性化合物均是植物来源的抗感染药物先导化合物的代表。从天然产物里分离获得的单体化合物，其母核结构和活性基团是通过长期的自然选择而形成的，在筛选过程中所表现出来的生物活性具有人工合成化合物所无法比拟的优势。因此，结构多样的天然产物及其衍生物在创新药物的研究中具有极其重要的地位。
[0004] 雷公藤红素(celastrol，CEL)是雷公藤的主要生物活性成分，因其多种有前景的生物活性而受到广泛关注，包括抗癌、抗炎、减肥、心脏保护、抗菌、抗氧化、抗过敏、神经保护、抗血栓、抗骨关节炎和抗阿尔茨海默病等(Hou等，2020)。据报道，雷公藤红素对葡萄球菌具有抗浮游菌和抗生物被膜活性(Ooi等，2015年；Woo等，2017年)。目前尚未见针对雷公藤红素抗肠球菌活性的相关研究报道。
[0005]
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种新型的抗菌药物组合物及其应用。
[0007] 为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供雷公藤红素在制备抗菌药物或组合物中的应用；其中，所述菌为肠球菌及其耐药菌。
[0008] 本发明中，所述肠球菌优选粪肠球菌(E.faecalis)和屎肠球菌(E.faecium)，以及它们的耐药菌。
[0009] 进一步地，所述耐药菌可选自万古霉素耐药肠球菌(VRE)和氨苄西林耐药肠球菌，如耐万古霉素的粪肠球菌和耐万古霉素的屎肠球菌。
[0010] 第二方面，本发明提供雷公藤红素在制备FtsZ蛋白抑制剂中的应用。
[0011] 优选地，所述FtsZ蛋白源自于肠球菌及其耐药菌。
[0012] 第三方面，本发明提供一种新型的抗菌药物组合物，其活性成分为雷公藤红素和万古霉素。
[0013] 进一步地，雷公藤红素与万古霉素的质量比为1:16～1:2。
[0014] 第四方面，本发明提供所述组合物在制备抗菌生物制品中的应用；其中，所述菌为肠球菌及其耐药菌。
[0015] 进一步地，雷公藤红素和万古霉素可以不分次序先后单独给药，或雷公藤红素与万古霉素同时一并给药。
[0016] 借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
[0017] 与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
[0018] 本发明考察了雷公藤红素对肠球菌的抗菌和抗生物膜活性，以及其辅助恢复VRE对万古霉素敏感性的能力。研究结果显示，雷公藤红素对包括VRE在内的肠球菌具有明显的抗菌和抗生物膜活性。在体外和体内，雷公藤红素的亚MIC浓度(亚最小抑菌浓度)恢复了万古霉素对VRE的活性。万古霉素和雷公藤红素的联用产生了协同作用，雷公藤红素有望作为新抗菌剂或万古霉素的增敏剂，为VRE的治疗提供选择方案。
附图说明
[0019] 图1为本发明较佳实施例中不同浓度的CEL在杀菌曲线法中对肠球菌菌株的活性。A：粪肠球菌ATCC 700802(MIC＝4μg/mL)；B：粪肠球菌ATCC 51575(MIC＝2μg/mL)；C：屎肠球菌ATCC 700221(MIC＝2μg/mL)；D：屎肠球菌ATCC 51559(MIC＝2μg/mL)。
[0020] 图2为本发明较佳实施例中CEL、万古霉素和氨苄西林清除生物膜的浓度依赖性活性(n＝3,***P<0.001)。
[0021] 图3为本发明较佳实施例中亚MIC浓度的CEL和万古霉素单用和联用对VRE菌株的活性。A：粪肠球菌ATCC 700802,1/8MIC(0.5μg/ml)CEL和<1/128MIC(2μg/ml)万古霉素(CEL MIC＝4mg/mL,万古霉素的MIC＝16μg/mL)；B：屎肠球菌ATCC 700221,1/4MIC CEL(0.5μg/ml)和<1/64MIC(16μg/ml)万古霉素(CEL的MIC＝2mg/mL,万古霉素的MIC>256μg/mL)。
[0022] 图4为本发明较佳实施例中CEL和万古霉素单用和联用对大蜡螟幼虫肠球菌致死性感染的保护作用。A：粪肠球菌ATCC 700802；B：屎肠球菌ATCC 700221。每组10只幼虫。感6
染剂量为2×10CFU/只。
染剂量为2×10CFU/只。
[0023] 图5为本发明较佳实施例中粪肠球菌ATCC 700802和枯草芽孢杆菌ATCC 21332不经药物处理和经CEL处理4h后的扫描电镜照片。A1：粪肠球菌ATCC 700802，对照，放大5000倍；A2：粪肠球菌ATCC 700802，对照，放大20000倍；B1：粪肠球菌ATCC 700802，2μg/mL CEL处理，放大5000倍；B2：粪肠球菌ATCC 700802，2μg/mL CEL处理，放大20000倍；C：枯草芽孢杆菌ATCC 21332，对照；D：枯草芽孢杆菌ATCC 21332 2μg/mL CEL处理。
[0024] 图6为本发明较佳实施例中CEL和FtsZ蛋白的对接结果，包括CEL和FtsZ不同氨基酸的相互作用。
[0025] 图7为本发明较佳实施例中在不同浓度的CEL下，在FtsZ涂层芯片上获得的表面等离子共振检测结果。
[0026] 图8为本发明较佳实施例中CEL抑制粪肠球菌FtsZ的GTP酶活性的剂量‑效应曲线。每个点代表三次独立实验。
具体实施方式
[0027] 本发明旨在研究雷公藤红素对肠球菌的抗菌和抗生物膜活性，以及其辅助恢复VRE对万古霉素敏感性的能力。
[0028] 采用最小抑菌浓度(MIC)测定、生物膜清除实验和时间杀菌曲线实验，研究雷公藤红素的体外抗菌活性。采用棋盘法和杀菌曲线法测定雷公藤红素和万古霉素之间的协同作用。体内研究是在大蜡螟幼虫感染模型上进行的。通过分子对接、生物分子结合相互作用以及雷公藤红素对细菌分裂蛋白FtsZ的酶抑制作用，探讨了雷公藤红素的潜在抑菌机制。
[0029] 研究结果显示，雷公藤红素抑制所有受试粪肠球菌和屎肠球菌菌株，MIC范围为0.5～4μg/mL，在杀菌曲线分析中，雷公藤红素以浓度依赖性方式抑制细菌生长。在16μg/mL浓度下暴露24小时后，雷公藤红素可以清除50％以上的生物被膜。雷公藤红素和万古霉素联合使用对所有23株受试菌株均显示出协同作用，棋盘法实验中的分数抑制浓度指数(FICI)中位数为0.25。与单独使用任何一种药物相比，联合使用亚MIC水平的雷公藤红素和万古霉素在杀菌曲线实验中显示出协同效应，并且在大蜡螟幼虫感染模型中显示出显著的保护效果。雷公藤红素对FtsZ有较强的结合和抑制能力，Kd和IC50分别为1.75±0.06μM和
1.04±0.17μg/mL。
1.04±0.17μg/mL。
[0030] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0031] 本发明中涉及的缩写词和术语如下：
[0032] VRE：耐万古霉素肠球菌；
[0033] CEL：雷公藤红素；
[0034] MIC：最小抑制浓度；
[0035] CFU：菌落形成单位；
[0036] FICI：分数抑制浓度指数；
[0037] VSE：万古霉素敏感肠球菌；
[0038] MHA：Mueller‑Hinton琼脂；
[0039] CAMHB：阳离子调节Mueller‑Hinton肉汤；
[0040] BHI：脑心浸液；
[0041] PBS：磷酸盐缓冲盐水；
[0042] SD：标准偏差；
[0043] CLSI：美国临床和实验室标准协会；
[0044] SEM：扫描电镜；
[0045] SPR：表面等离子体共振。
[0046] 实施例1雷公藤红素抑菌研究
[0047] 1、材料和方法
[0048] 1.1菌株和生长条件
[0049] 本发明中使用的所有菌株均来自中国医学科学院病原微生物菌毒种保藏中心(CAMS‑CCPM‑A)，包括5株ATCC标准VRE菌株(2株屎肠球菌和3株粪肠球菌)，18株临床VRE菌株(17株屎肠球菌和1株粪肠球菌)，5株ATCC标准万古霉素敏感肠球菌(VSE)(2株屎肠球菌和3株粪肠球菌)，72株临床分离的VSE菌株(31株屎肠球菌和41株粪肠球菌)。菌株通常在37℃的阳离子调节Mueller‑Hinton肉汤(CAMHB)或Mueller‑Hinton琼脂(MHA)中生长。
[0050] 1.2化学品和试剂
[0051] 万古霉素、氨苄西林和雷公藤红素购自中国药品生物制品检定研究院(中国，北京)。将万古霉素、雷公藤红素和氨苄西林分别溶解在蒸馏水、二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液(pH8.0)中，作为储备溶液，浓度为10mg/mL，0.22μm过滤器过滤后储存于‑20℃。用于细菌培养和抗菌药物敏感性实验的CAMHB、MHA和脑心浸液(BHI)购自BD公司(Franklin Lakes，NJ，USA)。
[0052] CytoPhos phosphate assay Biochem试剂盒和重组粪肠球菌FtsZ蛋白(FTZ04‑B)购自Cytoskeleton(美国科罗拉多州丹佛市)。
[0053] 1.3敏感性实验
[0054] 所有菌株储存于‑80℃，试验前在MHA平板上划线接种，进行过夜培养。根据临床和实验室标准研究所(CLSI)指南(CLSI，2021)，通过肉汤微稀释法测定雷公藤红素和万古霉素的最低抑制浓度(MIC)，以氨苄西林为质控抗生素。将起始浓度为256μg/mL的化合物添加到96孔微量滴定板的孔中，并用CAMHB培养基进行连续对倍稀释。添加细菌悬液10μL，使最5
终接种量达到5×10CFU/mL，将平板在37℃下培养24小时后读取MIC。MIC被定义为抑制细菌生长的化合物的最低浓度。万古霉素MIC折点规定如下：≤4μg/mL，敏感；8‑16μg/mL，中介；≥32μg/mL，耐药。
终接种量达到5×10CFU/mL，将平板在37℃下培养24小时后读取MIC。MIC被定义为抑制细菌生长的化合物的最低浓度。万古霉素MIC折点规定如下：≤4μg/mL，敏感；8‑16μg/mL，中介；≥32μg/mL，耐药。
[0055] 1.4雷公藤红素的时间杀菌曲线
[0056] 根据CLSI(CLSI，1999)描述的方法，通过杀菌曲线实验评估雷公藤红素的杀菌活性动力学。实验在粪肠球菌ATCC 700802、ATCC 51575、粪肠球菌ATCC700221、ATCC51559上6
进行。简言之，用CAMHB将过夜培养的菌液稀释至约2×10 CFU/mL的最终浓度，等分至无菌玻璃管，每管10mL。通过向每个试管中添加一定体积的雷公藤红素储备液，获得不同浓度的雷公藤红素(1/4MIC、1/2MIC、MIC、2MIC和4MIC)，其中含有细菌但不含雷公藤红素的试管用作生长对照。在培养的0、2、4、6、8和24小时测定菌液的细菌计数。菌液进行10倍连续稀释后，取10μL样品，在MHA板上滴流，一式三份，并在37℃下孵育24小时后，进行活菌计数，并记录为log10 CFU/mL。杀菌活性定义为与起始接种量相比，菌落计数的减少≥3log10CFU/mL(清除99.9％)。检测限为2log10CFU/mL。
进行。简言之，用CAMHB将过夜培养的菌液稀释至约2×10 CFU/mL的最终浓度，等分至无菌玻璃管，每管10mL。通过向每个试管中添加一定体积的雷公藤红素储备液，获得不同浓度的雷公藤红素(1/4MIC、1/2MIC、MIC、2MIC和4MIC)，其中含有细菌但不含雷公藤红素的试管用作生长对照。在培养的0、2、4、6、8和24小时测定菌液的细菌计数。菌液进行10倍连续稀释后，取10μL样品，在MHA板上滴流，一式三份，并在37℃下孵育24小时后，进行活菌计数，并记录为log10 CFU/mL。杀菌活性定义为与起始接种量相比，菌落计数的减少≥3log10CFU/mL(清除99.9％)。检测限为2log10CFU/mL。
[0057] 1.5生物被膜清除实验
[0058] 如前所述，对研究菌株进行生物膜清除实验(Wang等，2019年)。将粪肠球菌ATCC700802接种到BHI肉汤中，并在37℃下振荡过夜。将菌液1:100稀释后，添加到经组织培养处理的96孔板中(每孔100μL)，并在37℃静置培养24小时以形成生物被膜。轻轻移除培养基，并添加100μL含有不同浓度的雷公藤红素或抗生素对照的新鲜培养基(3个生物学重复)。再培养24小时后，移除培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻冲洗生物被膜3次，并在60℃下热固定1小时。向每个孔中加入50μL 0.06％结晶紫染色5分钟，然后用蒸馏水反复洗涤去除多余的染料。通过向每个孔中添加200μL 30％乙酸，从染色的生物被膜中洗脱结晶紫，并转移到另一个96孔板上进行OD595读数。
[0059] 1.6统计分析
[0060] 采用SPSS 16.0单因素方差分析(ANOVA)确定统计显著性，P值<0.05被认为具有统计显著性。
[0061] 2、实验结果
[0062] 雷公藤红素的抗菌活性：雷公藤红素和万古霉素对52株粪肠球菌和48株屎肠球菌的MIC值见表1。23％的菌株(23/100)对万古霉素耐药，其中包括4株粪肠球菌和19株屎肠球菌。雷公藤红素对所有万古霉素敏感和耐药菌株均显示出抗菌作用，MIC范围为0.5～4μg/mL，这可能表明雷公藤红素通过不同于万古霉素的作用机制发挥抗菌活性，不易与万古霉素产生交叉耐药性。
[0063] 如图1所示，雷公藤红素对肠球菌具有浓度依赖性抗菌作用。对于所有受试菌株，在接种后24小时，在4MIC的浓度下，雷公藤红素对粪肠球菌ATCC 700802、ATCC51575、屎肠球菌ATCC 700221、ATCC 51559分别表现出杀菌效果。每个菌株的2MIC浓度下的雷公藤红素对这四个菌株表现出抑菌活性，并持续到24小时。对于MIC浓度，粪肠球菌ATCC 700802在培养24小时后仍被雷公藤红素抑制，而在其他三个菌株中观察到细菌生长。1/4和1/2MIC的雷公藤红素对所有菌株均未表现出明显的抗菌活性。
[0064] 生物被膜与难治性感染有关，如心内膜炎、骨髓炎、慢性伤口感染、导管相关感染和人工关节感染等，生物被膜也被用作研究耐药性的模型。本发明进一步评估了雷公藤红素对VRE生物被膜的影响。作为临床治疗肠球菌感染的常用抗生素，氨苄西林或万古霉素对生物被膜的清除作用不大。与之相比，在暴露24小时后，16μg/mL的雷公藤红素可以清除50％以上的粪肠球菌ATCC 700802生物被膜(图2)。
[0065] 表1雷公藤红素和万古霉素对100株肠球菌标准菌株和临床分离菌株的最低抑菌浓度
[0066]
[0067]
[0068] 实施例2雷公藤红素与万古霉素的体外协同作用
[0069] 1、实验方法
[0070] 使用微稀释棋盘法对23株VRE菌株(包括5株标准菌株和18株随机选择的临床分离株)进行雷公藤红素和万古霉素的协同作用评价(Wang等，2019年)。简言之，将菌液添加到5
含有系列稀释浓度的雷公藤红素和万古霉素的96孔板的孔中，菌量为5×10 CFU/mL。棋盘法中使用的雷公藤红素和万古霉素稀释液范围分别为0.125～8μg/mL和0.25～256μg/mL。
在37℃下培养24小时后，采用以下方程式计算分数抑制浓度指数(FICI)来分析雷公藤红素与万古霉素的联合作用，实验重复三次：
含有系列稀释浓度的雷公藤红素和万古霉素的96孔板的孔中，菌量为5×10 CFU/mL。棋盘法中使用的雷公藤红素和万古霉素稀释液范围分别为0.125～8μg/mL和0.25～256μg/mL。
在37℃下培养24小时后，采用以下方程式计算分数抑制浓度指数(FICI)来分析雷公藤红素与万古霉素的联合作用，实验重复三次：
[0071] FICI＝(药物A联合用药的MIC/药物A单独用药的MIC)+(药物B联合用药的MIC/药物B单独用药的MIC)
[0072] 当FICI为≤0.5，协同；0.5≤FICI≤4无关，当FICI＞4时为拮抗。
[0073] 对粪肠球菌ATCC 700802和屎肠球菌ATCC 700221进行杀菌曲线实验，以评估雷公藤红素和万古霉素的杀菌动力学。联合用药的时间杀菌曲线研究与单用雷公藤红素相似。每个菌株都包括无药菌液作为生长对照。雷公藤红素和万古霉素在每种药物的亚MIC浓度下进行检测。在0、2、4、6、8和24小时测定菌落计数。协同作用定义为联用组与活性较好的单用组相比，24小时活菌计数的减少≥2log10 CFU/mL，同时联用组的24小时活菌计数与初始接种量相比，计数下降≥2log10 CFU/mL。
[0074] 2、实验结果
[0075] 棋盘法实验结果如表2所示。当万古霉素与1/8‑1/4MIC(0.25‑1μg/mL)的雷公藤红素联合使用时，万古霉素对菌株的抑制浓度显著降低至其1/128‑1/4MIC(2‑16μg/mL)。根据FIC指数，雷公藤红素与万古霉素联用时，对23株肠球菌均表现出协同作用。
[0076] 雷公藤红素和万古霉素联用时杀菌曲线结果如图3所示。在亚MIC浓度下，单独使用万古霉素对细菌生长的抑制活性较差。单独使用雷公藤红素对细菌生长的抑制作用较弱，在接种后6～24小时观察到细菌的再生。在24小时内，单独使用万古霉素和雷公藤红素的CFU计数与各自菌株的生长对照水平相同。相比之下，雷公藤红素和万古霉素的组合对2株受试菌株都显示出强大的协同效应。培养24小时后，与单独使用雷公藤红素和万古霉素相比，联合使用可使活菌数显著减少3log10 CFU/mL以上。24小时后，仍能观察对所有菌株生长的抑制作用。此外，与起始接种量相比，CEL‑万古霉素联用将活菌数降低了2log10 CFU/mL。
[0077] 表2雷公藤红素与万古霉素联用对23株肠球菌的棋盘法实验结果
[0078]
[0079]
[0080] 实施例3雷公藤红素与万古霉素的体内协同作用
[0081] 1、大蜡螟幼虫感染模型的建立
[0082] 大蜡螟幼虫在室温下放置适应24小时。选择体重在270～330mg之间、大小约2cm的幼虫进行试验。将粪肠球菌ATCC 700802和屎肠球菌ATCC 700221在BHI琼脂平板上划线培养，并在BHI中过夜培养增殖。用PBS洗涤两个菌株的过夜培养物并调整至适当的密度(约28
×10 CFU/mL)，用玻璃微量注射器向幼虫的右后足注射10μL菌液。感染后1小时，通过左足给幼虫注射万古霉素、雷公藤红素或万古霉素和雷公藤红素的组合，每组10只。此外，10只幼虫注射10μL PBS作为阴性对照。幼虫在35℃培养，并在感染后持续监测96小时。当幼虫对机械刺激无反应时，判定为死亡，绘制各组的存活曲线。
×10 CFU/mL)，用玻璃微量注射器向幼虫的右后足注射10μL菌液。感染后1小时，通过左足给幼虫注射万古霉素、雷公藤红素或万古霉素和雷公藤红素的组合，每组10只。此外，10只幼虫注射10μL PBS作为阴性对照。幼虫在35℃培养，并在感染后持续监测96小时。当幼虫对机械刺激无反应时，判定为死亡，绘制各组的存活曲线。
[0083] 使用GraphPad Prism 8的Kaplan‑Meier生存分析，通过对数秩检验并结合Bonferroni校正进行生存数据的多重比较分析。
[0084] 2、结果
[0085] 考察了对于致死感染量的VRE菌株粪肠球菌ATCC 700802和屎肠球菌ATCC 6
700221，CEL‑万古霉素组合对大蜡螟幼虫表现出保护作用。2×10CFU的细菌感染幼虫后，注射10μl PBS、0.25mg/kg CEL、40mg/kg万古霉素或CEL‑万古霉素组合。所有单独用PBS、CEL或万古霉素处理的幼虫在接种VRE后48小时内死亡。单独使用CEL或万古霉素不足以提供保护，而联合用药后，感染粪肠球菌ATCC 700802的80％的幼虫和感染屎肠球菌ATCC
700221的90％的幼虫，可存活96小时以上，联合用药显著延长了存活时间(图4)。因此，CEL和万古霉素联合应用对致死性VRE感染具有有效的保护作用。
700221，CEL‑万古霉素组合对大蜡螟幼虫表现出保护作用。2×10CFU的细菌感染幼虫后，注射10μl PBS、0.25mg/kg CEL、40mg/kg万古霉素或CEL‑万古霉素组合。所有单独用PBS、CEL或万古霉素处理的幼虫在接种VRE后48小时内死亡。单独使用CEL或万古霉素不足以提供保护，而联合用药后，感染粪肠球菌ATCC 700802的80％的幼虫和感染屎肠球菌ATCC
700221的90％的幼虫，可存活96小时以上，联合用药显著延长了存活时间(图4)。因此，CEL和万古霉素联合应用对致死性VRE感染具有有效的保护作用。
[0086] 实施例4细胞作用机制研究
[0087] 1、扫描电子显微镜(SEM)
[0088] 粪肠球菌ATCC 700802和枯草芽孢杆菌ATCC 21332的过夜培养物在CAMH肉汤中1:100稀释，并在37℃培养至至对数生长期(OD600nm＝0.4)，然后将细菌在含有或不含亚MIC水平CEL的培养基中培养4h，PBS洗涤后用2.5％戊二醛固定24小时，通过乙醇梯度脱水、干燥、喷金后，通过扫描电子显微镜观察(日本日立SU8020)。
[0089] 2、对接分析
[0090] 采用Discovery Studio 4.5软件，使用FtsZ蛋白(NCBI中的ID:60893384)的3D结构(PDB编号：5MN4)进行小分子对接研究。对蛋白进行正则化处理，用于测定预测结合口袋中的重要氨基酸。在能量最小化后，使用Libdock对CEL的所有构象与所选活性腔的位点进行对接。对接化合物根据其在结合位点上的结合方式进行评分。3、表面等离子体共振(SPR)分析
[0091] 使用CM5芯片，在25℃下，在BIAcore T200生物传感器系统(美国新泽西州皮斯卡塔韦GE Healthcare Life Sciences)上进行SPR分析。在1×PBS‑P+(GE Healthcare Life Sciences)中以20μL/min的流速使不同浓度的CEL(25、12.5、6.25、3.1、1.6μM)与FtsZ进行结合，持续120s。在每次结合反应后，用60s的解离时间，使信号回到基线。使用Biacore T200评估软件(美国新泽西州皮斯卡塔韦GE Healthcare Life Sciences2.0版)计算Kd值。4、GTPase活性测定
[0092] 重组粪肠球菌FtsZ蛋白的GTP酶活性如文献所述，使用CytoPhos磷酸盐检测生物化学试剂盒(Cytoskeleton，USA)(Sun等，2017)进行测定。将粪肠球菌FtsZ蛋白(0.5μM)与溶剂(1％二甲基亚砜)或不同浓度的CEL(0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32μg/mL)在20mM Tris缓冲液(pH7.5)中在室温下孵育10min。然后加入5mM MgCl2和200mM KCl。通过加入500μM GTP开始反应，并在37℃下反应。30分钟后，通过加入140μL Cytophos试剂使反应停止，并孵育10分钟。通过使用酶标仪测量650nm处的吸光度值对无机磷酸盐进行定量(英国Bio Rad实验室有限公司)。使用GraphPad Prism 9(GraphPad Software，La Jolla，CA)中的S形浓度响应曲线，通过非线性回归确定相对IC50值。对所有实验进行了三次独立分析。
[0093] 5、实验结果
[0094] 细菌细胞形态变化通常可以为抗菌作用机制提供有价值的线索，并经常用于初步作用机制研究。通过对细菌细胞形态的扫描电镜观察，首次深入探讨了CEL抗菌作用的机制。如图5所示，与未经处理的细胞相比，用CEL处理不会引起任何可观测到的细菌表面异常。然而，在CEL处理组中，观察到细菌明显变长，呈“糖葫芦状”，这表明细菌分裂受到抑制。为了进一步证实我们的假设，我们用枯草芽孢杆菌进行细胞形态学研究。与未处理的细胞相比，添加CEL后枯草杆菌的长度显著增加。由此，我们推测CEL通过抑制细菌分裂而显示其抗菌活性。
[0095] 由于丝状温度敏感突变体Z(FtsZ)在所有细菌中的重要作用和高度保守性，已成为新型抗菌药物的一个备受关注的靶点(Schaffner Barbero等，2012)。FtsZ通过GTP依赖性的聚合成原丝纤维，并进一步自组装成细菌细胞分裂的关键细胞器——Z环，招募其他蛋白质共同驱动细菌分裂和新细胞极的形成。
[0096] 根据在扫描电镜(SEM)下的发现和FtsZ蛋白在细菌细胞分裂中的重要作用，我们提出了CEL可能通过抑制FtsZ的功能及其相关生物活性来抗菌的假说。我们预测FtsZ可能是CEL抗菌作用的靶点之一。
[0097] 本发明首次在CEL和FtsZ之间进行了分子对接。Discovery Studio 4.5软件用于分子对接。如图6所示，CEL可以很好地契合FtsZ蛋白的活性口袋，对接分数为113.1。预测出的小分子和蛋白的相互作用包括x‑羰基或x‑羧基上的氧原子与ARG143或THR133残基之间的两个氢键，以及环A和GLU139之间的一个Pi阴离子键。这些相互作用共同促进了结合，这表明FtsZ蛋白可能是CEL的直接作用靶点。
[0098] 为了进一步证实CEL和FtsZ之间的相互作用，通过SPR分析了两者之间的结合。结果表明，CEL可以剂量依赖性地与FtsZ结合，Kd值为2.454μM(图7)，表明其与FtsZ的结合能力很强。
[0099] 由于FtsZ的组装动力学被认为受其GTPase活性的调节，因此评估了CEL对粪肠球菌FtsZ GTP酶活性的抑制作用。发现CEL显著抑制粪肠球菌FtsZ蛋白的GTP酶活性，IC50值为1.04±0.17μg/mL(图8)。GTP酶抑制活性与抗菌活性相关性良好，表明该化合物通过与FtsZ结合和GTPase功能抑制机制干扰细菌生长。CEL有别于抗生素的的抗菌机制也解释了其与万古霉素的协同作用。
[0100] 综上，CEL对肠球菌(包括VRE菌株)具有抗菌和抗生物膜活性，并在体外和体内恢复万古霉素对VRE的活性。总的来说，CEL有望成为一种新的抗菌剂和抗菌佐剂，为对抗VRE提供一种新的治疗选择。
[0101] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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