参芪扶正注射液与NMN的组合物在制备抗肿瘤药物上的应用

摘要

本发明涉及一种抗肿瘤药物，具体涉及参芪扶正注射液与NMN的组合物在制备抗肿瘤药物上的应用。本发明将参芪扶正注射液和NMN混合，并在此基础上添加甜菊糖苷进行联合使用；将参芪扶正注射液的免疫细胞功能改善作用和ATP为细胞增殖提供能量的作用结合，从而直接提高TIL细胞的增殖效果和肿瘤杀伤效果。

权利要求

1.参芪扶正注射液与NMN的组合物在制备抗肿瘤药物上的应用，所述组合物中还包括甜菊糖苷；

所述参芪扶正注射液、所述NMN的溶液和所述甜菊糖苷的溶液的重量比为1：2 2.5：3~ ~

3.5，所述参芪扶正注射液的浓度为20 25μg/ml，所述NMN的溶液的浓度为50 70μg/ml，所述~ ~甜菊糖苷的溶液浓度为80 90μg/ml。

~

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述参芪扶正注射液、所述NMN的溶液和所述甜菊糖苷的溶液的重量比为1:2：3，所述参芪扶正注射液的浓度为20μg/ml，所述NMN的溶液浓度为50μg/ml，所述甜菊糖苷的溶液的浓度为80μg/ml。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述参芪扶正注射液中总皂苷的含量不低于0.36mg/ml。

说明书

参芪扶正注射液与NMN的组合物在制备抗肿瘤药物上的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种提高TIL细胞活性的药物，具体涉及参芪扶正注射液与NMN的组合物在制备抗肿瘤药物上的应用。

背景技术

[0002] 细胞免疫治疗是一种被动免疫治疗，是肿瘤生物治疗的重要方式之一。通过体外培养、活化人体免疫细胞，使得免疫细胞的数目增多，靶向杀伤能力增强。将免疫细胞再回输入患者体内，以直接杀伤或激发机体免疫反应杀灭血液及组织中日的病原体、癌细胞等，从而达到治疗的目的。细胞免疫治疗对已无法进行手术治疗、不适用于放疗或经多周期化疗后仍出现严重的骨髓抑制、化疗耐药或不能耐受等情况的晚期恶性肿瘤患者疗效确切、相对安全，并能有效改善和提高患者的生存质量，延长生存期。

[0003] 采用肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor‑infiltratinglymphocyte，TIL)过继性T细胞疗法(Adoptive T cell therapy，ACT)是近年来备受关注的另一种免疫治疗方式。TIL是从肿瘤组织中分离出的浸润淋巴细胞。TIL‑ACT 首先将肿瘤内部和周边的T细胞从处于免疫抑制状态的肿瘤微环境转移到体外，经过激活后恢复肿瘤杀伤活性，然后有足够数量的T细胞回输体内，让这些具有识别肿瘤细胞特异性的TIL主导细胞免疫反应，最后直接杀伤或者抑制肿瘤细胞来达到肿瘤免疫治疗的效果。然而，由于在细胞免疫治疗过程中需要的细胞数量巨大，研究如何快速大量获取TIL细胞，对肿瘤的治疗具有重要的意义。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种提高TIL细胞的增殖效果和肿瘤杀伤效果的抗肿瘤药物，具体为参芪扶正注射液与NMN的组合物在制备抗肿瘤药物上的应用。

[0005] 参芪扶正注射液（商品名“丽珠”）是以扶正补益药黄芪、党参为主要原料，经提取、分离有效成分而配制成的中药静脉制剂，是一种临床常用的肿瘤辅助治疗药物。研究发现，参芪扶正注射液通过改善免疫细胞功能、诱导肿瘤细胞凋亡、促进骨髓造血干细胞DNA损伤修复、调节耐药蛋白的表达和调控相关信号通路等机制发挥抗肿瘤治疗作用。β‑烟酰胺单核苷酸（NMN）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的前体，其功能通过NAD+体现。NAD+又叫辅酶Ⅰ，全称烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，存在每一个细胞中，参与上千项反应。NAD+是维持细胞功能和能量代谢所必需的物质。研究发现NMN具有多种功能作用，例如抗衰老、促进心脑健康等。

[0006] 本发明通过参芪扶正注射液、NMN和甜菊糖苷联用，将参芪扶正注射液的免疫细胞功能改善作用和ATP为细胞增殖提供能量的作用结合，从而直接提高TIL细胞的增殖效果和肿瘤杀伤效果。从而达到显著的抗肿瘤效果。甜菊糖苷的添加可进一步协同辅助肿瘤杀伤效果。

[0007] 为了进一步提高TIL细胞的增殖和肿瘤杀伤效果，本发明研究发现采用特定比例特定浓度的参芪扶正注射液、NMN的溶液和甜菊糖苷的溶液，才能获得理想的抗肿瘤效果。其中，所述溶液中采用的溶剂为本领域通用的溶剂。

[0008] 其中，参芪扶正注射液和NMN的溶液的重量比为1:1 6。~

[0009] 优选的，参芪扶正注射液与NMN的溶液的重量比为1:2 3，尤其是1:2 2.5。~ ~

[0010] 优选在参芪扶正注射液与NMN的溶液的重量比为1:2 3时，所述参芪扶正注射液的~浓度为20 25μg/ml，NMN的溶液浓度为50 70μg/ml。
~ ~

[0011] 优选的，参芪扶正注射液、NMN的溶液和甜菊糖苷的溶液的重量比为1:1 6：1 6；参~ ~芪扶正注射液的浓度为10 40μg/ml，NMN的溶液浓度为12.5 200μg/ml，甜菊糖苷的溶液的~ ~
浓度为70 90μg/ml。
~

[0012] 其中，当参芪扶正注射液、NMN的溶液和甜菊糖苷的溶液的重量比为1：2 2.5：3~ ~3.5时，参芪扶正注射液的浓度为20 25μg/ml，NMN的溶液浓度为50 70μg/ml，甜菊糖苷的溶~ ~
液浓度为80 90μg/ml，能达到非常理想的肿瘤杀伤效果。
~

[0013] 尤其是，参芪扶正注射液、NMN的溶液和甜菊糖苷的溶液的重量比为1:2：3，所述参芪扶正注射液的浓度为20μg/ml，NMN的溶液浓度为50μg/ml，甜菊糖苷的溶液的浓度为80μg/ml时，肿瘤的杀伤率能达到最大值。

[0014] 优选，参芪扶正注射液中总皂苷的含量不低于0.36mg/ml。

[0015] 本发明具体到一种抗肿瘤药物，包括重量比为1：2 2.5：3 3.5的参芪扶正注射液、~ ~NMN的溶液和甜菊糖苷的溶液；其中，参芪扶正注射液的浓度为20 25μg/ml，NMN的溶液浓度~
为50 70μg/ml，甜菊糖苷的溶液浓度为80 90μg/ml。
~ ~

[0016] 优选的，所述抗肿瘤药物，包括重量比为1:2：3的参芪扶正注射液、NMN的溶液和甜菊糖苷的溶液；其中，参芪扶正注射液的浓度为20μg/ml，NMN的溶液浓度为50μg/ml，甜菊糖苷的溶液的浓度为80μg/ml。

附图说明

[0017] 图1为实施例1和实施例7中关键细胞因子的表达量对比图；

[0018] 图2为流式细胞术测定实施例1和实施例7的免疫表型对比图。

具体实施方式

[0019] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0020] 如下实施例中所采用的试剂来源如下：

[0021] 参芪扶正注射液购自丽珠集团利民制药厂。采用紫外‑分光光度法测得参芪扶正注射液中总皂苷的含量为0.36mg/ml。

[0022] NMN购自sigma公司；采用培养基将NMN粉末配置成浓度为1 mM的母液，经0.22um微孔滤膜过滤后，备用。

[0023] 非小细胞肺癌患者外周血和组织取自北京大学人民医院。

[0024] 实施例1

[0025] 本实施例提供一种抗肿瘤药物，按重量份计，由如下组分组成：

[0026] 1份浓度为20μg/ml的参芪扶正注射液、2份浓度为50μg/ml NMN的溶液、3份浓度为80μg/ml的甜菊糖苷的溶液。

[0027] 实施例2

[0028] 本实施例提供一种抗肿瘤药物，与实施例1的区别仅在于，NMN的溶液替换为4份。

[0029] 实施例3

[0030] 本实施例提供一种抗肿瘤药物，与实施例1的区别仅在于，NMN的溶液替换为6份。

[0031] 实施例4

[0032] 本实施例提供一种抗肿瘤药物，按重量份计，由如下组分组成：

[0033] 1份浓度为10μg/ml的参芪扶正注射液、2份浓度为12.5μg/ml NMN的溶液、3份浓度为80μg/ml的甜菊糖苷的溶液。

[0034] 实施例5

[0035] 本实施例提供一种抗肿瘤药物，按重量份计，由如下组分组成：

[0036] 1份浓度为40μg/ml的参芪扶正注射液、4份浓度为200μg/ml NMN的溶液、3份浓度为90μg/ml的甜菊糖苷的溶液。

[0037] 实施例6

[0038] 本实施例提供一种抗肿瘤药物，按重量份计，由如下组分组成：

[0039] 1份浓度为20μg/ml的参芪扶正注射液、3份浓度为60μg/ml NMN的溶液、6份浓度为85μg/ml的甜菊糖苷。

[0040] 实施例7

[0041] 本实施例提供一种抗肿瘤药物，按重量份计，由如下组分组成：

[0042] 1份浓度为25μg/ml的参芪扶正注射液、2.5份浓度为70μg/ml NMN的溶液、3.5份浓度为90μg/ml的甜菊糖苷的溶液。

[0043] 实施例8

[0044] 本实施例提供一种抗肿瘤药物，按重量份计，由如下组分组成：

[0045] 1份浓度为35μg/ml的参芪扶正注射液、4份浓度为100μg/ml NMN的溶液、2份浓度为90μg/ml的甜菊糖苷的溶液。

[0046] 实施例9

[0047] 本实施例提供一种抗肿瘤药物，按重量份计，由如下组分组成：

[0048] 1份浓度为30μg/ml的参芪扶正注射液、5份浓度为30μg/ml NMN的溶液、3份浓度为70μg/ml的甜菊糖苷的溶液。

[0049] 试验例1

[0050] 取肿瘤组织，用无菌生理盐水清洗，去除血管、包膜及其它坏死组织，剪碎至0.1‑3
0.2 mm 的小块，转至离心管中，加入5‑10 mL的组织消化酶。37℃消化1‑2 h后，600g离心
8min，弃上清。下层单细胞悬液用含1000 ‑3000 iu/ml IL‑2的X‑VIVO‑15培养液配置为
6
0.5‑1×10个/ml的细胞悬液，接种于24孔板中，置CO2培养箱中培养，设置培养条件为37℃，
5%CO2。取培养15‑20天处于对数生长期的TIL细胞，调整细胞密度培养于6孔板中，加入含
3000‑6000 IU/ml IL‑2、滋养细胞（由250Gy X‑ray照射PBMC 10‑30min制得，按TIL：PBMC=
1:50‑1:200加入）和含有不同浓度的药物组合物（实施例1 9提供的药物组合物）的X‑VIVO‑~
TM
15或AIM‑V® Medium CTS 培养液，置CO2培养箱中培养13 d，平行操作6份。D13采用细胞计数法计算细胞数目。取一定量的TIL细胞与非小细胞肺癌。

[0051] 将实施例1 9提供组合物的细胞数和细胞杀伤率归一化后所得综合评分为考察指~标，具体如下表1所示，实施例1 9对细胞增殖和肿瘤杀伤的影响对比。
~

[0052] 表1 试验测定结果

[0053]   细胞数*108 肿瘤细胞杀伤率% 归一化后得分实施例1 2.62 90.25 85.99
实施例2 3.13 68.62 81.01
实施例3 3.34 62.78 80.66
实施例4 1.62 53.65 51.98
实施例5 0.78 56.75 42.15
实施例6 3.64 74.43 91.24
实施例7 3.5 79.6 92.18
实施例8 3.24 71.11 83.90
实施例9 3.4 63.29 81.77

[0054] 可见，当芪扶正注射液、NMN的溶液、甜菊糖苷的溶液重量比为1:2:3，浓度分别为20、50和80μg/ml（实施例1）；比例为1：3：6，浓度分别为20、60和85μg/ml（实施例6）；比例为
1：2.5：3.5，浓度分别为25、70和90μg/ml（实施例7）时，细胞数目和肿瘤杀伤率的综合水平达到前3位。然而，培养过程中实施6的6份样品中有3份染菌，推测可能与甜菊糖苷的量较大有关，因此，后续试验排除实施例6。实施例7的细胞增殖高于实施例1，但肿瘤杀伤率低于实施例1。

[0055] 试验例2

[0056] 关键细胞因子mRNA表达：

[0057] 取培养13天的含有实施例1和实施例7的培养液培养细胞（同试验例1），以及阴性对照Jurkat细胞，按照RNeasy Micro Kit试剂盒说明提取总RNA，用核酸/蛋白定量仪对RNA定量。按照M‑MLV RTase cDNA Synthesis Kit试剂盒说明逆转录得cDNA。采用荧光定量PCR法测定不同分组中细胞毒性关键细胞因子颗粒酶A（GZMA）、颗粒酶B（GZMB）和穿孔素（PFP）的表达水平。

[0058] qPCR结果显示，与jurkat组相比，实施例7的GZMA水平显著升高，GZMB和PFP水平虽然升高，但不具有显著性。实施例1组GZMA、GZMB和PFP水平均显著高于jurkat组。与实施例7，相比，实施例1的GZMA、GZMB和PFP水平均显著升高，与试验例1中肿瘤杀伤作用的结果一致。如图1所示，关键细胞因子的表达量(*，**和#，##分别代表与Jurkat组，与空白对照组相比)。

[0059] 试验例3  肿瘤干性测定

[0060] 取培养13天的含有实施例1和实施例7培养液培养的TIL细胞，采用流式细胞数分析TIL细胞CD39、CD69的免疫表型。

[0061] 结果表明实施例1中CD39‑CD69‑的比例显著高于CD39+CD69+,实施例7中CD39‑CD69‑+ +和CD39 CD69 无显著性差异。通过文献Stem‑like CD8 T cells mediate response of ‑ ‑
adoptive cell immunotherapy against human cancer可知，CD39CD69可增强T细胞干性，增强肿瘤患者治愈效果，因此优选实施例1。如图2所示，流式细胞术测定实施例1（B和D）和实施例7（A和C）的免疫表型。

[0062] 虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。