作为CDK选择性抑制剂的新型哒嗪酮化合物转让专利
申请号 : CN202211680953.8
文献号 : CN115650968B
文献日 : 2023-03-21
发明人 : 任峰 , 丁晓 , 王亚洲 , 孟繁烨 , 刘金鑫 , 曹中莹
申请人 : 英矽智能科技(上海)有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种式(I)的化合物:或其药学上可接受的盐,其中:环A是含有0、1或2个选自O或N的杂原子的5‑或6‑元单环;
环A与环B相稠合形成稠环;
1
R选自氢或C1‑6烷基;
2
R选自氢或卤素;
3
R选自氢或=O;
4 a b a b
R选自氢、C1‑6烷基或‑NRR,其中R和R各自独立地选自氢或C1‑6烷基;
1
当 代表双键时,X选自C;
1
当 代表单键时,X选自CH或N;
2 3 4
X、X和X各自独立地选自CH或N。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐,其中,环A与环B相稠合形成选自以下的稠环:或 。
3.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐,其中,结构单元选自 或 。
4.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐,其中,所述化合物具有式(Ia)所示的结构:。
5.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐,其中,所述化合物具有式(Ib)所示的结构:。
1
6.根据权利要求1‑5中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐,其中,R 选自氢或C1‑3烷基;
2
R选自氢、F、Cl、Br或I;
3
R选自氢或=O;
4 a b a b
R选自氢、C1‑3烷基或‑NRR,其中R和R各自独立地选自氢或C1‑3烷基。
7.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐,其中,所述化合物选自以下结构之一:、 、
,和 。
8.一种药物组合物,其中,包括权利要求1‑7中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐,和药学上可接受的辅料。
9.根据权利要求1‑7中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备CDK2/4抑制剂中的用途,其中所述CDK2/4抑制剂用于治疗癌症。
10.根据权利要求9所述的用途,其中,所述癌症选自由以下组成的组:乳腺癌、脑癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、肝癌、淋巴瘤黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌。
说明书 :
作为CDK选择性抑制剂的新型哒嗪酮化合物
技术领域
物组合物,以及此类化合物或其药学上可接受的盐在治疗过度增殖性疾病例如癌症中的用
途。
背景技术
胞周期调节的关键激酶,其活性依赖于细胞周期蛋白的结合和激活,在调节细胞周期和基
因转录中起关键作用(Malumbres,M.(2014),“Cyclin‑dependent kinases.” Genome Biol
15(6):122)。最初因其在调节细胞周期中的作用而被发现。根据CDK功能的不同,可以将其
主要分为两大类。一类CDK参与细胞周期调控,主要包括CDK1、CDK2、CDK4、CDK6等;另一大类
CDK参与转录调节,主要包括CDK7、CDK8、CDK9、CDK10、CDK11等。
胞周期控制起着至关重要的作用,可以阻断细胞的周期,控制细胞的增殖,从而达到抗肿瘤
的目的。CDK靶向小分子抑制剂类药物具有很高的开发价值,发展空间大,对于在该领域内
探索新的抗肿瘤药物具有重大的意义。
必要继续研发低毒高效的CDK抑制剂,尤其是针对特定CDK具有较高选择性的CDK选择性抑
制剂。
发明内容
烷基或‑NRR,其中R和R各自独立地选自氢或C1‑3烷基,其余变量如本发明所定义。
接受的盐。
化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或辅料的药物组合物,容器和任选的
指示治疗的包装插页或标签。
具体实施方式
盖所有可选方案、修改和等同方案,它们可以包括在由权利要求限定的本发明的范围内。本
领域技术人员将认识到许多与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料,它们可用
于本发明的实践。本发明决不限于所描述的方法和材料。如果一个或更多个并入的文献和
类似材料与本公开不同或相矛盾,包括但不限于定义的术语、术语用法、描述的技术等,以
本公开为准。
的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。
常如其中所述定义。此外,有机化学的一般原理以及特定官能部分和反应性描述于Organic
Chemistry,Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito,1999;Smith和
March,March’s Advanced Organic Chemistry,第5版,John Wiley & Sons,Inc.,New
York,2001;Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers,Inc.,
New York,1989;Carruthers,Some Modem Methods of Organic Synthesis,第3版,
Cambridge University Press,Cambridge,1987。
外,仅当此类组合产生稳定的化合物时,才允许使用取代基和/或变量的组合。
基含有1至6个碳原子,例如1至5个碳原子、1至4个碳原子、1至3个碳原子或1至2个碳原子。
烷基的非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基和异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基、
新戊基等。
原子。在某些实施方案中,单环可以含有3至6个成环原子,例如3个、4个、5个或6个成环原
子。在某些实施方案中,作为成环原子,可以是碳原子,也可以是杂原子。在某些实施方案
中,单环结构可进一步被取代基团取代。
或非芳香性的。除非另有说明,否则稠环可以含有8至14个成环原子。在某些实施方案中,稠
环可以含有8至10个成环原子,例如8个成环原子、9个成环原子或10个成环原子。在某些实
施方案中,作为成环原子,可以是碳原子,也可以是杂原子。在某些实施方案中,稠环结构可
进一步被取代基团取代。稠环的非限制性实例包括
义并且是指共价附接至母基团或如果合适,稠合至母基团的化学部分。可以理解,给定原子
的取代受化合价的限制。应理解取代基可以被进一步取代。
取代基(即,其中该部分未被取代)的化合物。
互变异构体、立体异构体、外消旋混合物、位置异构体、前药、溶剂化形式、不同晶型或多晶
型物以及活性代谢物等。
受的盐可以包括与无机碱或酸和有机碱或酸形成的盐。在本发明的化合物含有一个或更多
个酸性或碱性基团的情况下,本发明还包括它们相应的药学上可接受的盐。因此,含有酸性
基团(例如羧基基团)的本发明的化合物可以盐形式存在,并且可以根据本发明使用,例如,
碱金属盐、碱土金属盐、铝盐或铵盐。此类盐的更多非限制性实例包括锂盐、钠盐、钾盐、钙
盐、镁盐、钡盐或与氨或有机胺(例如乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、哌啶、N‑甲基谷氨
酰胺或氨基酸)的盐。例如,通过使具有酸性基团的化合物与合适的碱(例如氢氧化锂、氢氧
化钠、丙醇钠、氢氧化钾、乙醇钾、氢氧化镁、氢氧化钙或氢氧化钡)反应,这些盐是容易获得
的。本发明的化合物的其他碱盐包括但不限于铜(I)、铜(II)、铁(II)、铁(III)、锰(II)和锌
盐。本发明的化合物含有一个或更多个碱性基团,例如可以质子化的基团,可以以盐的形式
存在,并且可以根据本发明以它们与无机酸或有机酸的加成盐的形式使用。合适的酸的实
例包括氯化氢、溴化氢、碘化氢、磷酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、磺基乙
酸、三氟乙酸、草酸、乙酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、碳酸、甲酸、丙酸、新戊酸、二乙基
乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富马酸、丙二酸、马来酸、苹果酸、帕莫酸、扁桃酸、氨基磺酸、
苯丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、异烟酸、柠檬酸、己二酸、牛磺胆酸、戊二酸、硬脂酸、谷氨酸或天
冬氨酸,以及本领域技术人员已知的其他酸。所形成的盐尤其是盐酸盐、氯化物、氢溴酸盐、
溴化物、碘化物、硫酸盐、磷酸盐、甲基磺酸盐(甲磺酸盐)、甲苯磺酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、
甲酸盐、乙酸盐、磺基乙酸盐、三氟甲磺酸盐、草酸盐、丙二酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、酒石
酸盐、苹果酸盐、帕莫酸盐、扁桃酸盐、富马酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、戊二酸盐、硬脂酸盐、天
冬氨酸盐或谷氨酸盐。此外,由本发明的化合物形成的盐的化学计量可以是1的整数倍或非
整数倍。
乙酯和二戊酯;C10‑18烷基卤化物,例如癸基、十二烷基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基的氯化
物、溴化物和碘化物;以及芳基C1‑4烷基卤化物,例如苄基氯和苯乙基溴。
规方法获得,例如通过将它们与有机或无机酸或碱在溶剂或分散剂中接触,或通过与其他
盐的阴离子交换或阳离子交换。本发明还包括本发明的化合物的所有盐,由于低生理相容
性,它们不直接适用于药物,但可用于,例如,作为化学反应的中间体或用于制备药学上可
接受的盐。有关更合适的盐的综述,参见Stahl和Wermuth,药用盐手册:特性、选择和使用
(Wiley‑VCH,2002)。
药学上可接受的溶剂分子的分子复合物。例如,当溶剂是水时使用术语“水合物”。
或(S)构型。当至手性碳的键在本发明的结构式中被描述为直线时,或当化合物名称在没有
手性碳的(R)或(S)手性名称的情况下被描述时,应当理解,每种此类手性碳的(R)和(S)构
型以及因此每种对映异构体或非对映异构体及其混合物均包含在该式或名称中。特定立体
异构体或其混合物的产生可以在获得此类立体异构体或混合物的实例中进行鉴定,但这绝
不限制所有立体异构体及其混合物被包括在本发明的范围内。
是本发明主题的对映异构体纯形式(作为左旋和右旋对映体)、外消旋体形式和两种对映异
构体以所有比例的混合物形式。在顺式/反式异构体的情况下,本发明包括顺式形式和反式
形式以及这些形式的所有比例的混合物。如有需要,可以通过常规方法(例如通过色谱或结
晶、通过使用立体化学均一的合成起始材料或通过立体选择性合成)分离混合物来制备单
个立体异构体。任选地,可以在立体异构体分离之前进行衍生化。立体异构体混合物的分离
可以在式(I)的化合物合成期间的中间步骤中进行,或者可以在最终外消旋产物上进行。绝
对立体化学可以通过结晶产物或结晶中间体的X‑射线晶体学来确定,如有需要,用含有已
知构型的立体中心的试剂衍生这些结晶产物或结晶中间体。可选地,绝对立体化学可以通
过振动圆二色性(VCD)光谱分析来确定。
但原子质量或质量序数不同于自然界中占优势的原子质量或质量序数的化合物。此类化合
物被称为“同位素变体”。本发明旨在包括式(I)的化合物的所有药学上可接受的同位素变
2
体。适合包括在本发明的化合物中的同位素的实例包括但不限于氢的同位素,例如 H(即,
3 11 13 14 36 18 123 125 13 15
D)和H;碳,例如 C、C和 C;氯,例如 Cl;氟,例如 F;碘,例如 I和 I;氮,例如 N和 N;
15 17 18 32 35
氧,例如 O、O和 O;磷,例如 P;和硫,例如 S。式(I)的化合物的某些同位素变体,例如掺
入放射性同位素的那些,可用于药物和/或底物组织分布研究。特别地,具有仅在用较重同
2
位素替换(例如用氘(H或D)替换氢)中不同的所描绘结构的化合物可以提供某些治疗优
势,例如,由于更高的代谢稳定性、增加的体内半衰期或减少的剂量要求,因此可以在一些
特定情况下使用。式(I)的化合物的同位素变体通常可以通过本领域技术人员已知的常规
技术或通过与所附实施例中描述的那些类似的方法以及使用适当的同位素标记试剂代替
先前采用的非标记试剂合成进行制备。
水解切割,特别是由酯酶或肽酶促进的水解切割,其被转化成具有期望活性的式(I)的化合
物。此类衍生物被称为“前药”。有关前药使用的更多信息可见于,例如,T. Higuchi和W.
Stella,“Pro‑drugs as Novel Delivery Systems”,Vol. 14,ACS Symposium Series,和
E. B. Roche(Ed.),“Bioreversible Carriers in Drug Design”,Pergamon Press,1987,
American Pharmaceutical Association。还可以参考Nature Reviews/Drug Discovery,
2008,7,355,和Current Opinion in Drug Discovery and Development,2007,10,550。
Elsevier,1985,以及Y. M. Choi‑Sledeski和C. G. Wermuth,“Designing Prodrugs and
Bioprecursors”,Practice of Medicinal Chemistry,第4版,Chapter 28,657‑696,
Elsevier,2015中所述的“前部分”。因此,根据本发明的前药可以包括但不限于(a)式(I)的
化合物中羧酸的酯或酰胺衍生物,如果有;(b)式(I)的化合物中氨基的酰胺、亚胺、氨基甲
酸酯或胺衍生物;(c)式(I)的化合物中羰基的肟或亚胺衍生物,如果有;或(d)可以在式(I)
的化合物中代谢氧化成羧酸的甲基、伯醇或醛基,如果有。
平抑制活性优异,相对于同源性较高的CDK1/9表现出了较好的选择性,脱靶引起的安全性
风险小。
癌和前列腺癌等,特别是结直肠癌、卵巢癌和乳腺癌。
的,本发明的化合物本身或其药学上可接受的盐将被简称为本发明的化合物。
施用。
如,疾病、病症或病状,或其一种或更多种体征或症状)的发作或抑制其进展。在某些实施方
案中,可以在疾病或病状的一种或更多种体征或症状已经发展或已经观察到之后施用治
疗。在其他实施方案中,可以在没有疾病或病状的体征或症状的情况下进行治疗。例如,可
以在症状发作之前对易感个体进行治疗(例如,根据症状史和/或根据遗传或其他易感性因
素)。在症状消退后也可以继续治疗,例如延迟或预防复发。如本文所用,术语“疾病”、“病
症”、“病状”和“病理状况”可互换使用。
医疗状况;病状的严重程度;施用途径;和所用特定化合物的活性。因此,剂量方案可以有很
大的不同。例如,本发明的化合物的剂量水平可以是每天约0.001至约100 mg/kg(即mg/kg
体重)。在某些实施方案中,以单次或分次施用的本发明的化合物的总日剂量可以为约
0.001至约10 mg/kg。本发明的化合物的施用可以在一天内重复多次的情况并不少见。
包括可接受用于兽医用途以及人药物用途的载体或辅料。如本文所用的药学上可接受的载
体或辅料包括一种和多于一种此类载体或辅料。使用的具体载体或辅料将取决于应用本发
明的化合物的方式和目的。合适的载体和辅料是本领域技术人员所熟知,并详述于,例如,
Ansel,Howard C等人,Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery
Systems. Philadelphia:Lippincott,Williams & Wilkins,2004;Gennaro,Alfonso R.等
人,Remington:The Science and Practice of Pharmacy. Philadelphia:Lippincott,
Williams & Wilkins,2000;和Rowe,Raymond C. Handbook of Pharmaceutical
Excipients. Chicago,Pharmaceutical Press,2005。还可以包括缓冲剂、稳定剂、表面活
性剂、润湿剂、润滑剂、乳化剂、混悬剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、助流剂、加工助剂、着色
剂、甜味剂、加香剂、调味剂、稀释剂和其他已知的添加剂中的一种或更多种,以提供药物
(即本文提供的化合物或药物组合物)的精致外观表现或有助于生产药物产品(即药物)。
栓剂等。形式取决于预期施用的方式和治疗应用。
述。例如,在Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing
Co.,Easton,Pennsylvania,1975;Liberman等人,编辑,Pharmaceutical Dosage Forms,
Marcel Decker,New York,N.Y.,1980;和Kibbe等人,编辑,Handbook of Pharmaceutical
Excipients,第3版,American Pharmaceutical Association,Washington,1999中讨论了
药物产品的制剂。
其药学上可接受的盐的药物组合物,容器和任选的指示治疗的包装插页或标签。
提供的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。
中,受试者是温血动物。在某些实施方案中,温血动物是哺乳动物。在某些实施方案中,温血
动物是人。
腺癌。
案中,单一疗法将涉及向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的一种本发明的化合物或
其药学上可接受的盐。
《综合有机化学》,Elsevier;Richard Larock,《综合有机转化:官能团制备指南》,John
Wiley and Sons;和《有机合成方法纲要》,I‑XII卷,Wiley‑Interscience。
员显而易见的是,无论材料是对映体富集的还是外消旋的,所有合成转化均可以以类似的
方式进行。此外,期望的光学活性材料的解析可以使用公知的方法,例如本文和化学文献中
描述的那些方法,在程序中的任何期望点进行。
基团》,第4版,John Wiley and Sons中所述的那些保护基团。使用本领域熟知的方法在方
便的后续阶段任选地去除保护基团。
未更详细提及的变体。此外,根据本文所述的反应方案和实施例,制备本发明的化合物的其
他方法对于本领域技术人员将是显而易见的。除非另有说明,否则所有变量均如上定义。一
般而言,化学程序中,所有试剂和起始材料均可购自商业供应商或可由本领域技术人员容
易地制备。
基亚砜;Hepes代表4‑(2‑羟乙基)‑1‑哌嗪乙磺酸;DTT代表二硫苏糖醇;ATP代表腺嘌呤核苷
三磷酸;DYRK代表双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶。
反应结束后,减压蒸除溶剂,残余物通过柱层析分离后得到式(1‑2)所示化合物(700 mg,
1
2.4 mmol)。H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.60(s,1H),5.99(dd,J = 10.6,1.9 Hz,1H),4.20 ‑
4.05(m,1H),3.73(td,J = 11.4,2.4 Hz,1H),2.22 ‑ 2.10(m,1H),2.05(s,1H),1.78 ‑
1.60(m,4H)。
mmol),碳酸钾(688.4 mg,5.0 mmol)和Pd(dppf)Cl(2 182.2 mg,0.25 mmol)。90℃下反应3
小时。反应结束后,减压蒸除溶剂,残余物通过柱层析分离后得到式(1‑4)所示化合物。
+
LCMS:408.1 [M+H]。
1.96 mmol),Ruphos(137.3 mg,0.29 mmol)和Pd2(dba)(3 89.81 mg,0.098 mmol)。90℃下反
应6小时。反应结束后,减压蒸除溶剂,残余物通过柱层析分离后得到式(1‑6)所示化合物。
+
LCMS:562.5 [M+H]。
+ 1
分离后得到式(1)所示化合物。LCMS:478.0 [M+H] ;H NMR(400 MHz,DMSO‑d6)δ 12.12(s,
1H),8.87(s,1H),7.49(d,J = 8.6 Hz,2H),7.35(s,1H),7.23 ‑ 6.93(m,4H),4.33 ‑ 4.21
(m,2H),4.15(p,J = 6.6 Hz,1H),3.35 ‑ 3.25(m,2H),3.24 ‑ 3.06(m,2H),2.61 ‑ 2.51
(m,3H),2.50(s,3H),1.95 ‑ 1.60(m,4H),1.17(d,J = 6.5 Hz,6H)。
原料,同法制得式(2)所示化合物。LCMS:479.3 [M+H] ;H NMR(400 MHz,DMSO‑d6)δ 12.31
(s,1H),9.36(s,1H),8.31(s,1H),8.09(s,1H),7.75(s,1H),7.61(s,2H),7.18 ‑ 7.07(m,
1H),4.29 ‑ 4.21(m,2H),4.15 ‑ 4.06(m,1H),3.29 ‑ 3.25(m,2H),2.92 ‑ 2.84(m,2H),
2.45 ‑ 2.39(m,1H),2.21(s,3H),1.99(t,J = 10.4 Hz,2H),1.77 ‑ 1.59(m,4H),1.16(d,
J = 6.5 Hz,6H)。
物(500 mg,2.46 mmol)。80℃下反应12小时。反应结束后,向反应体系中加入20毫升水进行
稀释。使用30毫升乙酸乙酯对所得混合物进行萃取,重复三次。将合并后的有机相溶液依次
使用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠进行干燥,过滤除去硫酸钠,减压蒸除溶剂,残余物通过
+
制备柱层析分离后得到式(3‑3)所示化合物。LCMS:251.0 [M+H]。
作三次。随后在15 psi压力的氢气氛围和室温下反应4小时。反应结束后,通过硅藻土过滤
除去体系中的Pd/C,减压蒸除溶剂,不必经过进一步纯化,即可获得式(3‑4)所示化合物。
+
LCMS:221.2 [M+H]。
原料,同法制得式(3)所示化合物。LCMS:508.3 [M+H] ;H NMR(400 MHz,DMSO‑d6)δ 12.20
(s,1H),9.13(s,1H),8.30(s,1H),7.93(d,J = 2.8 Hz,1H),7.66(s,1H),7.65 ‑ 7.57(m,
1H),7.39(dd,J = 9.2,3.0 Hz,1H),7.14 ‑ 7.03(m,1H),4.33 ‑ 4.19(m,2H),4.18 ‑
4.04(m,1H),3.62 ‑ 3.54(m,2H),2.68 ‑ 2.58(m,2H),2.36 ‑ 2.29(m,1H),2.20(s,6H),
2.19 ‑ 2.10(m,2H),1.90 ‑ 1.76(m,2H),1.55 ‑ 1.41(m,2H),1.16(d,J = 6.6 Hz,6H)。
(2.3 mL,39.8 mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(11.24 g,53.041 mmol)。40℃下反应过夜。反
应结束后,减压蒸除溶剂,残余物通过柱层析分离后得到式(4‑3)所示化合物。LCMS:141.2
+
[M+H]。
g,0.57 mmol)和Pd2(dba)(3 0.26 g,0.285 mmol)。在氮气氛围和100℃下反应3小时。反应结
束后,减压蒸除溶剂,残余物通过柱层析分离后得到式(4‑4)所示化合物。LCMS:263.0 [M+
+
H]。
合物。LCMS:235.2 [M+H]。
原料,同法制得式(4)所示化合物。H NMR(400 MHz,DMSO‑d6)δ 12.36(s,1H),9.55(s,1H),
8.15 ‑ 8.13(m,1H),7.74(s,1H),7.71 ‑ 7.67(m,1H),7.63(dd,J = 8.9,2.6 Hz,1H),
7.14(s,1H),7.11(dd,J = 11.9,1.8 Hz,1H),4.30 ‑ 4.22(m,2H),4.12(p,J = 6.7 Hz,
1H),3.68 ‑ 3.57(m,2H),3.29 ‑ 3.26(m,2H),2.70 ‑ 2.59(m,2H),2.40(s,6H),2.34 ‑
2.32(m,1H),2.21 ‑ 2.10(m,1H),1.93 ‑ 1.77(m,1H),1.17(d,J = 6.6 Hz,6H)。
后,向体系中加入式(5‑1)所示化合物(1.5 g,7.6 mmol)。0℃下反应3小时后,向体系中加
入30毫升冰水进行淬灭。使用50毫升二氯甲烷对该体系进行萃取,重复三次。合并后的有机
相经50毫升饱和食盐水洗涤和无水硫酸钠干燥后,过滤,减压蒸除溶剂,残余物通过柱层析
+
分离后得到式(5‑2)所示化合物。LCMS:253.1[M+H]。
酸钾(302.4 mg,3.08 mmol)溶于10毫升二氧六环。随后,向该体系中加入Pd(dppf)Cl2
(150.3 mg,0.205 mmol)。90℃和氮气氛围下反应12小时后,经过硅藻土过滤,减压蒸除溶
+
剂,残余物通过柱层析分离后得到式(5‑3)所示化合物。LCMS:301.1 [M+H]。
氧六环和1.5毫升水的混合溶剂中。在90℃和氮气氛围下反应12小时后,向体系中加入20毫
升水和40毫升乙酸乙酯,然后进行分液,有机相经20毫升饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干
燥,过滤,减压蒸除溶剂,残余物通过柱层析分离后得到式(5‑4)所示化合物。LCMS:387.1
+
[M+H]。
原料,同法制得式(5)所示化合物。LCMS:458.2 [M+H] ;H NMR(400 MHz,DMSO‑d6)δ 12.48
(s,1H),9.45(s,1H),8.69(d,J = 7.4 Hz,2H),8.11(s,1H),7.99(s,1H),7.89(s,1H),7.63
(s,2H),7.20(dd,J = 7.3,1.9 Hz,1H),2.94(d,J = 11.2 Hz,2H),2.48 ‑ 2.40(m,1H),
2.27(s,3H),2.16 ‑ 2.00(m,2H),1.83 ‑ 1.59(m,4H),1.44(s,9H)。
(50 mM Hepes,10 mM MgCl2,0.01% Brij,2 mM DTT),准备2×的激酶溶液,转移2 μL的激
酶溶液到384反应板中。使用离心机在1000 rpm离心1分钟,25℃孵育10分钟。用激酶反应缓
冲液准备2×的底物(H1:0.1 mg/ml)和ATP(50 μM)的混合液,向反应板中加入2 μL的底物
和ATP的混合液用来开始反应,使用离心机在1000 rpm离心1分钟。使用封板膜封住反应板,
25℃孵育60分钟。向反应板的每个孔中加入4 μL室温孵育的ADP‑Glo试剂(Promega,Cat:
V9103),1000 rpm离心1分钟,25℃孵育40分钟。向反应板的每个孔中加入8 μL室温孵育的
检测试剂(Promega,Cat:V9103),1000 rpm离心1分钟,25℃孵育40分钟。使用BMG读取化学
发光(luminescence)信号。
(50 mM Hepes,10 mM MgCl2,0.01% Brij,2 mM DTT),准备2×的激酶溶液,转移2 μL的激
酶溶液到384反应板中。使用离心机在1000 rpm离心1分钟,25℃孵育10分钟。用激酶反应缓
冲液准备2×的底物(H1:0.1 mg/ml)和ATP(20 μM)的混合液,向反应板中加入2 μL的底物
和ATP的混合液用来开始反应,使用离心机在1000 rpm离心1分钟。使用封板膜封住反应板,
25℃孵育60分钟。向反应板的每个孔中加入4 μL室温孵育的ADP‑Glo试剂(Promega,Cat:
V9103),1000 rpm离心1分钟,25℃孵育40分钟。向反应板的每个孔中加入8 μL室温孵育的
检测试剂(Promega,Cat:V9103),1000 rpm离心1分钟,25℃孵育40分钟。使用BMG读取化学
发光(luminescence)信号。
(50 mM Hepes,10 mM MgCl2,0.01% Brij,2 mM DTT),准备2×的激酶溶液,转移2 μL的激
酶溶液到384反应板中。使用离心机在1000 rpm离心1分钟,25℃孵育10分钟。用激酶反应缓
冲液准备2×的底物(DYRK:0.1 mg/ml)和ATP(100 μM)的混合液,向反应板中加入2 μL的底
物和ATP的混合液用来开始反应,使用离心机在1000 rpm离心1分钟。使用封板膜封住反应
板,25℃孵育60分钟。向反应板的每个孔中加入4 μL室温孵育的ADP‑Glo试剂(Promega,
Cat:V9103),1000 rpm离心1分钟,25℃孵育40分钟。向反应板的每个孔中加入8 μL室温孵
育的检测试剂(Promega,Cat:V9103),1000 rpm离心1分钟,25℃孵育40分钟。使用BMG读取
化学发光(luminescence)信号。
(50mM Hepes,10mM MgCl2,0.01% Brij,2mM DTT),准备2×的激酶溶液,转移2 μL的激酶溶
液到384反应板中。使用离心机在1000 rpm离心1分钟,25℃孵育10分钟。用激酶反应缓冲液
准备2×的底物(CDK:0.1 mg/ml)和ATP(20 μM)的混合液,向反应板中加入2 μL的底物和
ATP的混合液用来开始反应,使用离心机在1000 rpm离心1分钟。使用封板膜封住反应板,25
℃孵育60分钟。向反应板的每个孔中加入4 μL室温孵育的ADP‑Glo试剂(Promega,Cat:
V9103),1000 rpm离心1分钟,25℃孵育40分钟。向反应板的每个孔中加入8 μL室温孵育的
检测试剂(Promega,Cat:V9103),1000 rpm离心1分钟,25℃孵育40分钟。使用BMG读取化学
发光(luminescence)信号。
程。因此,所有合适的修改和等同物均可以被认为落入由所附权利要求限定的本发明的范
围内。