一种高粘附力的水溶性聚合物及其制备方法与在生物农药上的应用

摘要

本发明公开了一种高粘附力的水溶性聚合物及其制备方法与在生物农药上的应用，涉及生物防治技术领域，聚合物的结构式为：其中n＝100，1000或10000。其制备方法包括以下步骤：(1)称取丙烯酰吗啉，加入不同摩尔当量的光引发链转移剂，用溶剂充分溶解后转移至反应容器中；(2)冻融循环除去氧气，充入氮气，反应，得到不同聚合度的聚合物。高粘附力的水溶性聚合物应用于真菌生物农药上。有益效果：采用本发明中合成的光引发链转移剂，通过在254‑356nm紫外光照射下获得不同聚合度的聚合物PNAm，获得的聚合物具有良好的粘附性能。本发明中的水溶性聚合物，可以实现对于真菌的抗紫外保护及耐雨水冲刷保护。

权利要求

1.一种高粘附力的水溶性聚合物在真菌生物农药上的应用，其特征在于，将所述聚合物与球孢白僵菌孢子混合均匀；所述聚合物的结构式如下：其中n＝100，1000或10000。

2.根据权利要求1所述的高粘附力的水溶性聚合物在真菌生物农药上的应用，其特征在于，所述聚合物通过以下工艺制备：(1)称取丙烯酰吗啉，加入不同摩尔当量的光引发链转移剂，用溶剂充分溶解后转移至反应容器中；

(2)冻融循环除去氧气，充入氮气，反应，得到不同聚合度的聚合物。

3.根据权利要求2所述的高粘附力的水溶性聚合物在真菌生物农药上的应用，其特征在于，所述步骤(1)中溶剂为纯水。

4.根据权利要求2所述的高粘附力的水溶性聚合物在真菌生物农药上的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的光引发链转移剂的结构式为：

5.根据权利要求2所述的高粘附力的水溶性聚合物在真菌生物农药上的应用，其特征在于，所述步骤(1)中反应容器为安碚瓶。

6.根据权利要求2所述的高粘附力的水溶性聚合物在真菌生物农药上的应用，其特征在于，所述步骤(1)中反应溶液中丙烯酰吗啉加光引发链转移剂的固含量为45‑55％。

7.根据权利要求2所述的高粘附力的水溶性聚合物在真菌生物农药上的应用，其特征在于，所述步骤(2)中反应条件为254‑365nm紫外光照射。

8.根据权利要求2所述的高粘附力的水溶性聚合物在真菌生物农药上的应用，其特征在于，所述步骤(2)中反应时间为1‑3h。

说明书

一种高粘附力的水溶性聚合物及其制备方法与在生物农药上

的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物防治技术领域，具体涉及一种高粘附力的水溶性聚合物及其制备方法与在生物农药上的应用。

背景技术

[0002] 昆虫病原真菌是一类重要的生物农药，在世界范围内防治广泛用于农林业重要害虫的生物防治，目前真菌生物农药登记注册的产品一百多个。病原真菌防治昆虫具有环境友好、不易使害虫产生抗性、可持续控制害虫等优点，但真菌作为生物体，对外界环境的因子比较敏感，尤其是太阳中的紫外线杀伤作用会导致真菌侵染体孢子的快速失活，从而降低了防治效果。同时，真菌生物农药在田间喷洒至植物或昆虫体表时，由于粘附力弱，风及雨水的冲刷会导致真菌孢子的快速损失，有研究表明，重要昆虫病原真菌球孢白僵菌在叶片上的种群数量一周内可下降90％，因此，真菌生物农药的抗紫外与抗冲刷研究一直是真菌剂型与应用研究中的重要内容。但从目前真菌孢子的紫外保护剂的研究范围上看，多集中于无机化合物，如荧光素钠、纳米氧化锌等；而对抗冲刷研究主要体现在粉剂、乳剂、油剂等不同剂型差异上，目前尚未见高分子材料在真菌生物农药加工与防治中的应用以提升抗紫外、抗冲刷等环境抗逆性的相关研究。

[0003] 不同高分子材料和高分子农药剂型在植物病原菌的抗菌性方面已经取得了重要成果。本技术利用高分子材料的定向合成，使之具有抗紫外、粘附性强的特性，将该高分子材料和真菌生物农药结合，从而提高真菌杀虫剂产品应用的田间抗逆性及防治效果的稳定性，使得生物农药被更广泛的应用。

[0004] 公布号为CN112772679A的中国专利申请文献，公开了一种用于甘蔗真菌病害的生物农药，该生物农药包含枯草芽孢杆菌、木霉菌、甜菜碱；所述的枯草芽孢杆菌为100亿个/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂、所述木霉菌为2亿个/克木霉菌水分散粒剂；还包含叶面肥；所述的叶面肥包含N、P、K或微量元素中的一种或多种。该发明所述的生物农药用于防治甘蔗真菌病害，优选用于防治甘蔗褐斑病菌。但发明并没有提及生物农药的抗紫外能力差、粘附性较弱的问题。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题在于如何解决现有的真菌生物农药抗紫外能力差、粘附性较弱而导致的持效性差、防治效果不稳定的问题。

[0006] 本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：

[0007] 一种高粘附力的水溶性聚合物，其结构式如下：

[0008] 其中n＝100，1000或10000。

[0009] 技术路线如下：

[0010]

[0011] 有益效果：本发明制备的高分子聚合物，与真菌生物农药混合后，提高了真菌生物农药的粘附性能和抗紫外能力，并且耐雨水冲刷，具有很好的应用前景。

[0012] 本发明还提供一种制备上述高粘附力的水溶性聚合物的方法，包括以下步骤：

[0013] (1)称取丙烯酰吗啉，加入不同摩尔当量的光引发链转移剂，用溶剂充分溶解后转移至反应容器中；

[0014] (2)冻融循环除去氧气，充入氮气，反应，得到不同聚合度的聚合物。

[0015] 优选的，所述步骤(1)中溶剂为纯水。

[0016] 优选的，所述步骤(1)中的光引发链转移剂的结构式为：

[0017] 优选的，所述步骤(1)中光引发链转移剂的制备方法，包括以下步骤：称取60mL的四氢呋喃，放入150mL的圆底烧瓶内，在冰水浴的条件下缓慢加入2.64g氢化钠，然后搅拌至氢化钠完全溶解，接着加入1.5mL2‑溴丙酸和4.5mL二硫化碳于室温条件下搅拌过夜，反应结束后，加入3mL甲醇淬灭，然后旋蒸除去水和四氢呋喃，得到的产物用40mL二氯甲烷萃取两次，向水层中逐滴加入盐酸至混合溶液pH小于等于2，然后再用40mL二氯甲烷萃取三次，收集二氯甲烷层溶液，加入无水硫酸镁干燥除去水，接着旋蒸除去二氯甲烷，得到的黄色产物通过过柱子纯化(洗脱剂为甲醇:二氯甲烷

[0018] ＝1:10)，即可得到光引发链转移剂。技术路线如下：

[0019]

[0020] 优选的，所述步骤(1)中反应容器为安碚瓶。

[0021] 优选的，所述步骤(1)中反应溶液中丙烯酰吗啉(Nam)加光引发链转移剂的固含量为45‑55％

[0022] 优选的，所述步骤(1)中反应溶液中丙烯酰吗啉(Nam)加光引发链转移剂的固含量为50％。

[0023] 优选的，所述步骤(2)中反应条件为254‑365nm紫外光照射。

[0024] 优选的，所述步骤(2)中反应时间为1‑3h。

[0025] 优选的，所述步骤(2)中反应时间为2h。

[0026] 本发明还提供一种上述高粘附力的水溶性聚合物在真菌生物农药上的应用，将制备好的聚合物与球孢白僵菌孢子混合均匀。

[0027] 本发明的优点在于：

[0028] (1)本发明制备的高分子聚合物，与真菌混合后，提高了真菌生物农药的粘附性能和抗紫外能力，并且耐雨水冲刷，具有很好的应用前景。

[0029] (2)采用本发明中合成的光引发链转移剂，通过在254‑356nm紫外光照射下获得不同聚合度的聚合物，获得的聚合物具有良好的粘附性能。

[0030] (3)本发明中的水溶性聚合物，可以实现对于真菌的抗紫外以及耐雨水冲刷的保护。

附图说明

[0031] 图1为实施例1中光引发链转移剂的核磁氢谱图；

[0032] 图2为实施例1中光引发链转移剂的核磁碳谱图；

[0033] 图3为不同比例的丙烯酰吗啉制备的聚合物的GPC图；

[0034] 图4为不同比例的丙烯酰吗啉制备的聚合物的核磁氢谱图；

[0035] 图5为实施例4中玻璃片上涂有不同聚合度的水溶性聚合物的剪切强度对比图；

[0036] 图6为实施例5中添加不同聚合物对球孢白僵菌孢子萌发的影响对比图；萌发实验证明聚合物对孢子没有明显损伤；

[0037] 图7为实施例6中添加不同聚合物在254nm紫外波长下照射时间对球孢白僵菌孢子萌发的影响图；

[0038] 图8为实施例6中添加不同聚合物在302nm紫外波长下照射时间对球孢白僵菌孢子萌发的影响图；

[0039] 图9为实施例6中添加不同聚合物在365nm紫外波长下照射时间对球孢白僵菌孢子萌发的影响图；

[0040] 图10为实施例7中添加不同聚合物在不同降雨程度下叶面孢子残留情况对比图；

[0041] 图11为实施例8中模拟36mm降雨前海桐叶面扫描电镜图；

[0042] 图12为实施例8中聚合物助剂未稀释时模拟36mm降雨后海桐叶面扫描电镜图；

[0043] 图13为实施例8中聚合物助剂稀释100倍时模拟36mm降雨后海桐叶面扫描电镜图；

[0044] 图14为实施例9中球孢白僵菌与不同聚合物在模拟36mm降雨情况下大蜡螟的死亡率对比图；

[0045] 图15为实施例9中球孢白僵菌与不同聚合物在模拟36mm降雨情况下大蜡螟的侵染率对比图；

[0046] 图16为实施例9中球孢白僵菌与不同聚合物在模拟36mm降雨情况下大蜡螟的半致死时间(LC50)对比图；

[0047] 图17为本发明的反应容器安碚瓶的形状示意图。

具体实施方式

[0048] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0049] 实施例1：

[0050] 一种高粘附力的水溶性聚合物，其结构式如下：

[0051] 其中n＝100。

[0052] 制备该高粘附力的水溶性聚合物的方法，包括以下步骤：

[0053] (1)称取1129.36mg丙烯酰吗啉加入到10mL安碚瓶中，再加入155.4μL浓度为1mg/mL的光引发链转移剂，再加入1129μL纯水充分溶解后将安碚瓶密封；

[0054] 该光引发链转移剂的结构式为： 其通过以下工艺制备：称取60mL的四氢呋喃，放入150mL的圆底烧瓶内，在冰水浴的条件下缓慢加入2.64g氢化钠，然后搅拌至氢化钠完全溶解，接着加入1.5mL2‑溴丙酸和4.5mL二硫化碳于室温条件下搅拌过夜，反应结束后，加入3mL甲醇淬灭，然后旋蒸除去水和四氢呋喃，得到的产物用40mL二氯甲烷萃取两次，向水层中逐滴加入盐酸至混合溶液pH小于等于2，然后再用40mL二氯甲烷萃取三次，收集二氯甲烷层溶液，加入无水硫酸镁干燥除去水，接着旋蒸除去二氯甲烷，得到的黄色产物通过过柱子纯化(洗脱剂为甲醇:二氯甲烷＝1:10)，即可得到光引发链转移剂；图
1和图2为该光引发链转移剂的核磁氢谱和碳谱图，从图中可以看出该光引发链转移剂已成功制备；

[0055] (2)将安碚瓶中混合溶液经多次冻融循环除去氧气后，充入氮气，在365nm紫外光照射的条件下反应2h，得到聚合度为100的PNAm聚合物。

[0056] 该高粘附力的水溶性聚合物在真菌生物农药上的应用，具体为将上述制备好的聚合物与球孢白僵菌孢子混合均匀。

[0057] 实施例2：

[0058] 一种高粘附力的水溶性聚合物，其结构式如下：

[0059] 其中n＝1000。

[0060] 制备该高粘附力的水溶性聚合物的方法，包括以下步骤：

[0061] (1)称取1129.36mg丙烯酰吗啉加入到10mL安碚瓶中，再加入15.5μL浓度为1mg/mL实施例1的光引发链转移剂，再加入1129μL纯水充分溶解后将安碚瓶密封；

[0062] (2)将安碚瓶中混合溶液经多次冻融循环后，充入氮气，在365nm紫外光照射的条件下反应2h，得到聚合度为1000的PNAm聚合物。

[0063] 该高粘附力的水溶性聚合物在真菌生物农药上的应用，具体为将上述制备好的聚合物与球孢白僵菌孢子混合均匀。

[0064] 实施例3：

[0065] 一种高粘附力的水溶性聚合物，其结构式如下：

[0066] 其中n＝10000。

[0067] 制备该高粘附力的水溶性聚合物的方法，包括以下步骤：

[0068] (1)称取1129.36mg丙烯酰吗啉加入到10mL安碚瓶中，再加入1.6μL浓度为1mg/mL实施例1的光引发链转移剂，再加入1129μL纯水充分溶解后将安碚瓶密封；

[0069] (2)将安碚瓶中混合溶液经多次冻融循环除去氧气后，充入氮气，在365nm紫外光照射的条件下反应2h，得到聚合度为10000的PNAm聚合物。

[0070] 该高粘附力的水溶性聚合物在真菌生物农药上的应用，具体为将上述制备好的聚合物与球孢白僵菌孢子混合均匀。

[0071] 图3为不同比例的丙烯酰吗啉制备的聚合物的GPC图，从图中可以看出，随着丙烯酰吗啉聚合度的逐渐增大，聚合物的分子量也逐渐增大。

[0072] 图4为不同比例的丙烯酰吗啉制备的聚合物的核磁氢谱图，从图中可以看出，单体双键的消失及丙烯酰吗啉特征峰的逐渐增强证实不同聚合度的聚合物成功制备。

[0073] 实施例4：

[0074] 将实施例1‑3制备好的聚合度为100、1000、10000的聚合物各取400uL，分别均匀涂布在三个玻璃板上，干燥之后，将另一片干净的玻璃片覆盖在其表面，然后放到40度真空干燥箱内干燥处理过夜。通过力学拉伸机测试其剪切强度。结果如图4所示,可以看到随着聚合度的增大，对应的剪切强度也随之增大，说明得到的水溶胶的粘附性能更强，更有利于后续实验的应用。

[0075] 图5为实施例4中玻璃片上涂有不同聚合度的水溶性聚合物的剪切强度对比图，从图中可以看出，力学性能测试说明聚合度越高，对应的剪切强度越大。

[0076] 实施例5：

[0077] 球孢白僵菌与聚合物的相容性测定：

[0078] (1)在容量50mL的无菌锥形瓶中加入20mL体积分数为0.05％的吐温‑80溶液，将培养好的球孢白僵菌菌株孢子粉刮入锥形瓶，并用涡旋振荡器振荡15min，充分摇匀，使孢子均匀分散，使用灭菌后内置脱脂棉的注射器过滤去除菌丝，在光学显微镜下利用血球计数板计算孢子浓度，测定出孢子悬浮液的初始浓度，再利用浓度梯度稀释的方法配制出试验所需要的浓度。

[0079] (2)按上述方法配制浓度为4x107孢子/mL孢悬液，将孢悬液分别与实施例1‑3制得的聚合物按体积比1：3的比例配制，对照组为孢悬液与体积分数为0.05％吐温‑80按体积比1：3的比例配制，每组3个重复，结果取平均值。将其放入温度25℃±1的暗培养箱中，每隔1天、3天、6天、9天、31天、61天、91天取10ul点在GB平板上(GB培养基：蔗糖20g/L，蛋白胨5g/L，琼脂20g/L，水1L)，12h后每隔2h在显微镜下观察萌发情况，确定最终萌发率。

[0080] 测试结果如图6所示，3种不同聚合度的聚合物与球孢白僵菌Bb202在观测时间段内萌发率未出现大幅度下降，与对照组差异不显著，表明聚合物助剂与球孢白僵菌Bb202的相容性较好，可以进行下一步的试验。

[0081] 实施例6：

[0082] 聚合物添加对球孢白僵菌紫外保护效果的测定：

[0083] (1)在容量50mL的无菌锥形瓶中加入20mL体积分数为0.05％的吐温‑80溶液，将培养好的球孢白僵菌菌株孢子粉刮入锥形瓶，并用涡旋振荡器振荡15min，充分摇匀，使孢子均匀分散，使用灭菌后内置脱脂棉的注射器过滤去除菌丝，在光学显微镜下利用血球计数板计算孢子浓度，测定出孢子悬浮液的初始浓度，再利用浓度梯度稀释的方法配制出试验所需要的浓度。

[0084] (2)按上述方法配制浓度为4x107孢子/mL孢悬液，将孢悬液分别与实施例1‑3制得的聚合物按体积比1：3的比例配制，对照组为孢悬液与体积分数为0.05％吐温‑80按体积比1：3的比例配制，每组3个重复。将配制好的溶液取10uL点在GB平板上，待液滴干后放入波长为254nm的紫外交联仪中照射0s、1s、2s、3s、5s、8s、10s，然后将GB平板放入25℃培养箱中培养，12h后每隔2h在光学显微镜下观察萌发情况，确定最终萌发率。方法如上，在波长302nm下，照射0s、5s、10s、15s、20s、30s、40s；在波长365nm下，照射0h、0.5h、1h、2h、3h。

[0085] 测试结果如图7‑9所示，从图中可以看出，添加聚合物有显著的紫外保护效果，聚合度越高保护效果越好。

[0086] 实施例7：

[0087] 聚合物添加对球孢白僵菌耐雨水冲刷特性的测定：

[0088] (1)在容量50mL的无菌锥形瓶中加入20mL体积分数为0.05％的吐温‑80溶液，将培养好的球孢白僵菌菌株孢子粉刮入锥形瓶，并用涡旋振荡器振荡15min，充分摇匀，使孢子均匀分散，使用灭菌后内置脱脂棉的注射器过滤去除菌丝，在光学显微镜下利用血球计数板计算孢子浓度，测定出孢子悬浮液的初始浓度，再利用浓度梯度稀释的方法配制出试验所需要的各种浓度。

[0089] (2)按上述方法配制浓度为4x107孢子/mL孢悬液，将孢悬液分别与实施例1‑3制得的聚合物按体积比1：3的比例配制，对照组为孢悬液与体积分数为0.05％吐温‑80按体积比1：3的比例配制，每组3个重复，结果取平均值。将配制好的溶液取100uL均匀涂布在事先清洗干净并晾干的海桐叶上，分为降雨组和不降雨组。

[0090] 海桐叶上的孢悬液晾干后。降雨组进行10mm、24mm、36mm雨量的冲刷，叶片干后将降雨组放入含有20mL0.05％吐温‑80溶液锥形瓶中，加入转子放置于磁力搅拌器上搅拌30分钟，未降雨组放入含有50mL0.05％吐温‑80溶液锥形瓶中，加入转子放置于磁力搅拌器上搅拌30分钟。将充分震荡的溶液依次稀释10倍、100倍、1000倍，依次取稀释液体100uL涂布于1/4PDA平板(含有350mg/L硫酸链霉素、50mg/L盐酸四环素、125mg/L放线菌酮)，将其放入温度25℃和湿度70％的培养箱中暗培养，4‑5天后计算成菌落数。

[0091] 测试结果如图10所示，从图中可以看出，聚合物增强了真菌孢子的粘附性能，除了A1效果并不明显，A2、A3均表现良好的耐雨水冲刷能力。

[0092] 实施例8：

[0093] 海桐叶面扫描电镜观察：

[0094] (1)在容量50mL的无菌锥形瓶中加入20mL体积分数为0.05％的吐温‑80溶液，将培养好的球孢白僵菌菌株孢子粉刮入锥形瓶，并用涡旋振荡器振荡15min，充分摇匀，使孢子均匀分散，使用灭菌后内置脱脂棉的注射器过滤去除菌丝，在光学显微镜下利用血球计数板计算孢子浓度，测定出孢子悬浮液的初始浓度，再利用浓度梯度稀释的方法配制出试验所需要的浓度。

[0095] (2)按上述方法配制浓度为4x107孢子/mL孢悬液，将孢悬液分别与实施例1‑3制得的聚合物按1：3的比例配制，对照组为孢悬液与体积分数为0.05％吐温‑80按体积比1：3的2
比例配制。海桐叶提前清洗干净并晾干，避开主叶脉画1cm的面积，取配好的溶液10uL均匀涂于其中，表面液体干后，降雨组进行36mm的降雨，待其干后两组一起放入－20℃冰箱冷藏，之后放在冻干机内冻干，以备扫描电镜使用。电镜观察时，银胶黏铜台喷金后，置于扫描电子显微境下进行观察、拍照。

[0096] 测试结果如图11‑13所示，图中注：a‑b为降雨前不同放大倍数，c‑d为降雨后不同放大倍数，A3‑2为A3助剂稀释100倍

[0097] 从图中可以看出，不添加聚合物的海桐叶面孢子数量在降雨后大幅度减少，而添加了聚合物的海桐叶面孢子数量在降雨后损失较少，两者差异极显著。表明聚合物的粘附性能良好，能有效减少降雨带来的孢子损失。

[0098] 实施例9：

[0099] 聚合物添加对球孢白僵菌生物测定的影响：

[0100] (1)在容量50mL的无菌锥形瓶中加入20mL体积分数为0.05％的吐温‑80溶液，将培养好的球孢白僵菌菌株孢子粉刮入锥形瓶，并用涡旋振荡器振荡15min，充分摇匀，使孢子均匀分散，使用灭菌后内置脱脂棉的注射器过滤去除菌丝，在光学显微镜下利用血球计数板计算孢子浓度，测定出孢子悬浮液的初始浓度，再利用浓度梯度稀释的方法配制出试验所需要的浓度。

[0101] (2)按上述方法配制浓度为4x107孢子/mL孢悬液，将孢悬液分别与实施例1‑3制得的聚合物按体积比1：3的比例配制，对照组为孢悬液与体积分数为0.05％吐温‑80按体积比1：3的比例配制。将大蜡螟幼虫浸渍于溶液中10s后迅速取出，放在铺有灭菌滤纸的玻璃皿中，让其爬行，分为降雨组和未降雨组，待幼虫身体表面水分干后降雨组进行36mm降雨，将处理后的幼虫分别置于温度25℃±1和湿度70％的培养箱中培养，接菌后12h内湿度控制在
90％以上。每组3个重复，结果取平均值，每个处理25只大蜡螟。每隔12h观察记录大蜡螟死亡情况，计算死亡率；将死亡的大蜡螟幼虫放置于培养皿(保湿)内在25℃下保持15d，检查死亡幼虫受感染情况，计算侵染率。

[0102] 测试结果如图12所示，说明添加聚合物助剂在降雨前后均能提高大蜡螟幼虫的死亡率，显著提升杀虫速率，聚合物对提高防治效果有显著作用。

[0103] 实施例10：

[0104] 本实施例与实施例1的区别在于：步骤(2)中“反应2h”改为“反应1h”，其他步骤与实施例1相同。

[0105] 实施例11：

[0106] 本实施例与实施例1的区别在于：步骤(2)中“反应2h”改为“反应3h”，其他步骤与实施例1相同。

[0107] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。