枯草芽孢杆菌DP-3及其应用转让专利
申请号 : CN202210965011.8
文献号 : CN115651859B
文献日 : 2023-05-23
发明人 : 魏雪团 , 赵紫悦 , 张岱源 , 韩震颖 , 韩宗辰 , 袁江雅
申请人 : 好氧探索(武汉)生物科技有限公司
摘要 :
本发明公开了一株枯草芽孢杆菌DP‑3及其应用，该菌株的保藏编号为CCTCC NO：M 2022934，经枯草芽孢杆菌DP‑3发酵所得豆粕中蛋白含量、可溶性蛋白含量、NSI溶解度显著提升，大豆球蛋白、β‑伴球蛋白以及低聚糖等抗营养物质明显降解，该菌株既可高效发酵豆粕，又可拮抗金黄色葡萄球菌等有害细菌，降解呕吐毒素等霉菌毒素。
权利要求 :
1.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）DP‑3，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO：M
2022934。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌DP‑3在豆粕发酵中的应用。
3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌DP‑3在抑制金黄色葡萄球菌中的应用，所述的应用非疾病的治疗方法。
4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌DP‑3在降解呕吐毒素中的应用，所述的应用非疾病的治疗方法。
5.一种制备发酵豆粕的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1所述枯草芽孢杆菌DP‑3以豆粕为底物进行发酵。
说明书 :
枯草芽孢杆菌DP‑3及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌DP‑3及其应用。
背景技术
[0002] 豆粕是大豆提取大豆油后的副产物，其蛋白质含量高，氨基酸组成平衡，在玉米‑豆粕型基础日粮中约提供70％的蛋白质，是畜牧养殖业中最常用的植物性饲料蛋白原料。但豆粕中存在的抗原蛋白、植酸、胰蛋白酶抑制因子、植物凝集素和低聚糖等抗营养因子，可破坏动物的肠道结构，降低营养物质在动物肠道内的消化吸收和利用，限制了其在幼龄动物的应用(参考文献：Yang A,Zuo L,Cheng Y,Wu Z,Li X,Tong P,Chen H.Degradation of major allergens and allergenicity reduction of soybean meal through solid‑state fermentation with microorganisms. Food Funct.2018,9(3):1899‑1909.)。
[0003] 目前，通过微生物发酵技术处理豆粕，是提高豆粕品质的主要方法之一。微生物发酵能改变豆粕物质组成，提高豆粕蛋白质含量，增加低分子肽含量，降低豆粕中抗营养因子的含量，同时可产生一些益生功能的小肽和微生物代谢产物，能够有效提高豆粕品质和营养价值(参考文献：Catalán N,Villasante A,Wacyk J, Ramírez C,Romero J.Fermented Soybean Meal Increases Lactic Acid Bacteria in Gut Microbiota of Atlantic Salmon(Salmo salar).Probiotics Antimicrob Proteins. 2018,10(3):566‑576；Wang C,Shi C,Su W,Jin M,Xu B,Hao L,Zhang Y,Lu Z, Wang F,Wang Y,Du H.Dynamics of the Physicochemical Characteristics,Microbiota, and Metabolic Functions of Soybean Meal and Corn Mixed Substrates during Two‑Stage Solid‑State Fermentation.mSystems.2020,5(1):e00501‑19.)。在动物上的试验结果表明，发酵豆粕可通过提升肠道绒毛高度和降低隐窝深度，提高动物机体和肠道免疫能力，提高营养物质的消化率等方面来提高动物的生产性能(参考文献：Soumeh EA,Mohebodini H,Toghyani M,Shabani A,Ashayerizadeh A,Jazi V.Synergistic effects of fermented soybean meal and mannan‑oligosaccharide on growth performance,digestive functions,and hepatic gene expression in broiler chickens.Poult Sci.2019,98(12):6797‑6807.)。
[0004] 抗生素滥用及饲料原料霉菌毒素对健康和环境造成严重威胁，我国饲料行业已全面禁抗，且霉菌毒素污染问题日益受到重视。具有抑菌功能的益生菌产品作为抗生素替代品受到饲料行业的关注，对维持动物肠道健康和菌群平衡至关重要。同时，具有霉菌毒素降解功能的益生菌产品也备受关注。若获得既可以提升豆粕营养品质，又具有抑菌活性和霉菌毒素降解活性的益生菌，将具有重大的意义。然而，目前尚未见这类益生菌的报道。
发明内容
[0005] 为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一株既可以高效发酵豆粕，又具有抑菌活性和霉菌毒素降解活性的枯草芽孢杆菌。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] 本发明先从豆豉样品中分离具有芽孢杆菌菌落形态特征的菌株，再采用平板打孔法对蛋白酶、α‑淀粉酶活性高的菌株进行初筛，将筛选到的菌株通过豆粕发酵实验、抑菌圈实验和霉菌毒素降解实验进行复筛，获得一株既可高效发酵豆粕，又可降解霉菌毒素，拮抗金黄色葡萄球菌等病原菌的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DP‑3，该菌株于2022年06月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022934。
[0008] 枯草芽孢杆菌DP‑3在豆粕发酵中的应用：将枯草芽孢杆菌DP‑3接种至豆粕底物，发酵结束后将发酵豆粕样品烘干粉碎，经测定发酵所得豆粕中粗蛋白含量达到55％，可溶7
性蛋白含量达到33％，NSI溶解度达到60％，活菌数为1.22×10 cfu/g，枯草芽孢杆菌DP‑3对豆粕中大豆球蛋白、β‑伴球蛋白等抗营养物质以及低聚糖(水苏糖、棉子糖)具有明显的降解作用。
性蛋白含量达到33％，NSI溶解度达到60％，活菌数为1.22×10 cfu/g，枯草芽孢杆菌DP‑3对豆粕中大豆球蛋白、β‑伴球蛋白等抗营养物质以及低聚糖(水苏糖、棉子糖)具有明显的降解作用。
[0009] 枯草芽孢杆菌DP‑3在抑制金黄色葡萄球菌及降解呕吐毒素中的应用：通过抑菌圈实验证实枯草芽孢杆菌DP‑3对金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用，且对呕吐毒素降解效果较好，降解率达59％。
[0010] 与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
[0011] (1)该菌株具有多种能力：既可高效发酵豆粕，提高豆粕营养品质，同时又可降解霉菌毒素，拮抗金黄色葡萄球菌等病原菌，该菌株具有多种功能。
[0012] (2)本发明的枯草芽孢杆菌DP‑3能够显著提高发酵豆粕中的营养物质含量，改善豆粕营养价值，经枯草芽孢杆菌DP‑3发酵所得豆粕中蛋白含量、可溶性蛋白含量、NSI溶解度显著提升，对大豆球蛋白、β‑伴球蛋白以及低聚糖等抗营养物质具有明显的降解作用。
[0013] (3)本发明制备的发酵豆粕兼具营养物质和益生菌的效果，既具有极高的营养价值，又对动物病原细菌和真菌的抑制效果优异，并对呕吐毒素具有高效的降解效果。
附图说明
[0014] 图1：枯草芽孢杆菌DP‑3显微形态图。
[0015] 图2：枯草芽孢杆菌DP‑3菌落形态图。
[0016] 图3：基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树。
[0017] 图4：SDS‑PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果图。
[0018] 图5：TLC薄层色谱图。
具体实施方式
[0019] 通过以下实施例对本发明进行详细说明，但所有实施例并不对本发明造成任何限制。
[0020] 实施例1：菌株筛选
[0021] 取豆豉样品1g，加入装有9mL无菌水的灭菌试管中，用棉塞封口，振荡2 min，于水‑5 ‑6浴锅中80℃加热15min，静置冷却后，吸取上清液0.1mL稀释10 、 10 ，分别取0.1mL稀释涂布在LB平板上，37℃培养24h，挑取具有芽孢杆菌菌落形态特征的菌株，划线进行分离纯化。
将分离菌株接种于50mL液体LB中， 37℃培养24h后离心取上清，采用平板打孔法对蛋白酶、α‑淀粉酶活性高的菌株进行初筛。其中，蛋白酶筛选平板制备方法：脱脂奶粉1.5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母粉5g/L；α‑淀粉酶筛选平板制备方法：蛋白胨10g/L，氯化钠
10g/L，酵母粉5g/L，可溶性淀粉2g/L，可溶性淀粉先加热溶解，再灭菌， 37℃倒置培养24h后，加入碘液显色。
将分离菌株接种于50mL液体LB中， 37℃培养24h后离心取上清，采用平板打孔法对蛋白酶、α‑淀粉酶活性高的菌株进行初筛。其中，蛋白酶筛选平板制备方法：脱脂奶粉1.5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母粉5g/L；α‑淀粉酶筛选平板制备方法：蛋白胨10g/L，氯化钠
10g/L，酵母粉5g/L，可溶性淀粉2g/L，可溶性淀粉先加热溶解，再灭菌， 37℃倒置培养24h后，加入碘液显色。
[0022] 对初筛得到的菌株，通过豆粕发酵实验、抑菌圈和霉菌毒素降解实验分析。其中豆粕发酵实验方法为：调整豆粕原料含水量为50％，90℃，灭菌1h，将菌株按5％的接种量接种于灭菌豆粕中，混匀，于37℃发酵20h，发酵结束后于54℃烘24h，得到发酵豆粕样品，粉碎，按照《GB/T 6432‑1944饲料中粗蛋白检测方法》检测粗蛋白含量；抑菌效果测试实验按照如8
下方法进行：LB培养基作为种子液，37℃摇床培养12h，使菌悬液浓度在10 CFU/mL，将金黄色葡萄球菌稀释涂布于平板上制备指示菌平板，打孔器打孔，将菌悬液滴入孔中，培养48h 后测定其抑菌圈直径大小；呕吐毒素降解能力分析按如下方法进行：称取8g麸皮和12g水，
8
121℃灭菌后加入最适浓度在10 CFU/mL的1.5mL芽孢杆菌菌液，于37℃培养48h，以无菌水作为空白对照，测定芽孢杆菌降解呕吐毒素效果的方法采用上海臻科生物科技有限公司的呕吐毒素检测试剂盒完成。结果发现菌株 DP‑3对豆粕发酵能力最强，发酵后豆粕蛋白含量达53％，对金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用，且呕吐毒素降解效果较好，降解率达
59％，DP‑3为目标菌株。
下方法进行：LB培养基作为种子液，37℃摇床培养12h，使菌悬液浓度在10 CFU/mL，将金黄色葡萄球菌稀释涂布于平板上制备指示菌平板，打孔器打孔，将菌悬液滴入孔中，培养48h 后测定其抑菌圈直径大小；呕吐毒素降解能力分析按如下方法进行：称取8g麸皮和12g水，
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121℃灭菌后加入最适浓度在10 CFU/mL的1.5mL芽孢杆菌菌液，于37℃培养48h，以无菌水作为空白对照，测定芽孢杆菌降解呕吐毒素效果的方法采用上海臻科生物科技有限公司的呕吐毒素检测试剂盒完成。结果发现菌株 DP‑3对豆粕发酵能力最强，发酵后豆粕蛋白含量达53％，对金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用，且呕吐毒素降解效果较好，降解率达
59％，DP‑3为目标菌株。
[0023] 实施例2：菌株鉴定
[0024] 如图1所示，菌株DP‑3的菌体直杆状，革兰氏染色阳性，芽孢近似圆形，偏端生。如图2所示，在LB固体培养基上菌落圆形，边缘不齐，菌苔表面无光泽，不透明，最适生长温度30‑37℃，适宜pH6.8‑7.2。
[0025] 菌株DP‑3的16S rRNA基因片段经PCR扩增、纯化回收，由擎科创新生物科技有限公司完成DNA测序工作。将测得的序列用NCBI的Blastn程序进行序列相似性分析，从Genbank数据库和核糖体数据库选取相近种属的代表性菌株的16S rRNA基因序列，通过MEGA 6.0软件进行系统发育分析，用邻接法 (Neighbor Joining)构建基于16S rRNA基因序列的系统发育树，用于检验自举支持率(Bootstrap)的重复抽样次数为1000次。纯化后的产物测序委托北京擎科生物技术公司测序，测序所得豆粕发酵用枯草芽孢杆菌DP‑3的16S rRNA基因序列有1483个碱基，同源性分析结果显示菌株DP3的16S rRNA基因序列与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)高度相似，且通过MEGA 6.0软件构建系统发育树，系统进化树如附图3所示，显示菌株DP‑3属于枯草芽孢杆菌。结合形态学特点和16S rRNA基因序列分析，该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，命名为枯草芽孢杆菌DP‑3，该菌株于保存于中国典型培养物保藏中心(保藏中心地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编：
430072)，其保藏编号CCTCC NO：M 2022934。
430072)，其保藏编号CCTCC NO：M 2022934。
[0026] 实施例3：豆粕固体发酵
[0027] 1、采用枯草芽孢杆菌DP‑3(保藏编号为CCTCC NO：M 2022934)作为生产菌株；
[0028] 2、上述DP‑3菌株接种在LB液体培养基(含蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L、pH 7.2)上37℃培养12h，至无菌的20％甘油管中，‑70℃冷冻保藏；
[0029] 3、制备种子液：
[0030] (1)将上述冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基(含蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L、琼脂粉15g/L、pH 7.2)平板上，37℃培养12h，使其活化；
[0031] (2)将上述活化的种子转接到LB液体种子培养基中，37℃，180rpm培养 8‑14h；
[0032] 4、豆粕底物制备：
[0033] 豆粕底物加入等体积的自来水，含水量控制在50％，90℃蒸煮灭菌60min；
[0034] 5、发酵培养：
[0035] 按照5％(v/w)的接种量，将枯草芽孢杆菌DP‑3加入豆粕底物中混匀，37℃静止培养20h。由表1可知，经枯草芽孢杆菌DP‑3发酵所得的豆粕产品呈现米黄色，无异味，手握质感软糯、粘手、无颗粒感、蓬松。由此证明，经枯草芽孢杆菌菌株DP‑3发酵所得发酵豆粕感官品质良好。
[0036] 表1经枯草芽孢杆菌DP‑3发酵所得产品感官评价结果
[0037]
[0038] 实施例4：发酵豆粕品质分析
[0039] 发酵结束于54℃烘24h，得到发酵豆粕样品，粉碎，进行后续测定，对发酵所用原料豆粕(即未经任何处理的豆粕)及经DP‑3发酵所得产品发酵豆粕进行品质评价。粗蛋白含量按照《GB/T 6432‑1944饲料中粗蛋白检测方法》进行检测；挥发性盐基氮按照《GB/T 32141‑2015饲料中挥发性盐基氮的测定》进行检测；可溶性蛋白绝对含量的检测方法为：称取2g研磨后的样品，加入80mL的水置于 250mL锥形瓶中，摇床摇1h后10000r/min离心10min取上清，用凯氏定氮法测蛋白含量。小心移取上清液3.00mL，放入消化管中，按测定粗蛋白质含量的方法测定蛋白含量，同时测定同一试样的总粗蛋白质含量。氮溶解指数 (Nitrogen soluble index，NSI)以测得的可溶性蛋白含量和粗蛋白含量为基础计算获得。发酵后，豆粕中粗蛋白含量达到55％，提升了9％；可溶性蛋白含量达到33％，提升了24％，发酵后NSI溶解度达到60％。
[0040] 表2发酵豆粕分析检测结果
[0041]
[0042] 活菌数按照《GB 4789.2‑2016食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测7
定》进行检测，发酵完成54℃烘28h，活菌数为1.22×10cfu/g，表明终产品含有高浓度芽孢杆菌益生菌。
定》进行检测，发酵完成54℃烘28h，活菌数为1.22×10cfu/g，表明终产品含有高浓度芽孢杆菌益生菌。
[0043] KOH溶解度：称取1.5g研磨后的发酵豆粕样品，精确到0.1mg，置于250 mL烧杯中，加入75mL氢氧化钾。在磁力搅拌器上搅拌20min，离心10min。小心移取上清液3.00mL，放入消化管中，按测定粗蛋白质含量的方法测定蛋白含量，为CP1，同时测定同一试样的总粗蛋白质含量，为CP2。 经测定，发酵20h的豆粕样品KOH溶解度为82％。
[0044] 其中，SDS‑PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳具体为：蛋白提取：称取样品0.2g加入5mL 8M Urea溶液里(质量体积比)，超声波振荡器中进行30min的超声波萃取，随后8000rpm离心10min，40μL上清+10μL 5×loading buffer，混匀后煮沸15min，即可点样，点样30μg蛋白含量。取各样品溶液10μL分别加入凝胶槽中，浓缩胶电压设置为80V，分离胶电压设置为100V，电泳结束后，用考马斯亮蓝染色液染色30min，随后转入脱色液中浸泡过夜，更换脱色液直至凝胶背景色为初始白色，观察电泳结果图上蛋白质条带分布。如图4所示，与生豆粕相比，经DP‑3发酵所得发酵豆粕在53‑76KD间的蛋白条带很浅，在22‑38KD 之间蛋白条带有不同程度的变浅。由此证明，DP‑3对豆粕中大豆球蛋白、β‑伴球蛋白等抗营养物质的降解效果较好。与生豆粕相比，经DP‑3发酵所得发酵豆粕在20KD以下的蛋白条带加深。由此证明，经枯草芽孢杆菌DP‑3发酵豆粕中蛋白分子量减小，能够提高营养物质的消化利用率。
[0045] 低聚糖定量测定参考国标(GBT22491‑2008大豆低聚糖)进行，发酵前生豆粕低聚糖(棉子糖和水苏糖)总量为11.81g/100g，发酵后低聚糖降低至0.58g/100 g，由此可知，发酵后极大降低了低聚糖的含量，基本消除了抗营养因子对豆粕消化吸收的影响。进一步通过TLC薄层色谱进行验证：首先制备标准品溶液，分别准确称取0.02g棉子糖、水苏糖标准品，以80％乙醇溶解，分别定容至10mL 容量瓶，并稀释到刻度备用，并配置混合标品溶液。样品溶液制备：称取粉碎样品2.0000g于250mL碘量瓶，用无水乙醚脱脂，挥去乙醚；加80％乙醇溶液 20ml，充分混匀，37℃、180rpm震荡水浴浸提2h以上取出，3000rpm离心5 min，保留上清液，吸取10mL浓缩，定容为2mL，待测。展开剂：正丁醇：异丙醇：水：醋酸(体积比)＝7：
5：2：1，显色剂：2g二苯胺+2mL苯胺+10mL 85％磷酸和100mL丙酮混合溶液，避光储存。TLC薄层色谱图如图5所示，可以判断生豆粕粉中含有较高的水苏糖和棉子糖，经DP‑3发酵后，水苏糖和棉子糖含量显著降低。
5：2：1，显色剂：2g二苯胺+2mL苯胺+10mL 85％磷酸和100mL丙酮混合溶液，避光储存。TLC薄层色谱图如图5所示，可以判断生豆粕粉中含有较高的水苏糖和棉子糖，经DP‑3发酵后，水苏糖和棉子糖含量显著降低。