一种特立帕肽含有的杂质的检测方法

摘要

本发明公开了一种特立帕肽含有的杂质的检测方法，属于生物医学检测技术领域。本发明解决了现有特立帕肽检测标准在检测过程中容易使特立帕肽氧化，使检测的氧化杂质水平高于真实值，且对部分插入肽杂质和同分异构杂质无检测能力的问题。本发明以阴离子活性剂十二烷基硫酸钠为流动相，其带有的负电荷可与多肽表面正电荷结合，增强了流动相对多肽的洗脱能力，增强了杂质和特立帕肽的分离能力，可准确检测出特立帕肽中插入肽和异亮氨酸的同分异构杂质的含量。同时，本发明在流动相中还加入抗氧剂苯酚，保证了检测过程中特立帕肽不被氧化，确保氧化杂质检测的准确度。

权利要求

1.一种特立帕肽有关物质的检测方法，其特征在于，采用液相色谱法对特立帕肽进行分析，其中流动相A由0.05mol/L钠盐溶液与乙腈按照体积比为90:10混合而成，流动相B由

0.05mol/L钠盐溶液与乙腈按照体积比为50:500混合而成；

所述的钠盐溶液制备过程为：28.8g十二烷基硫酸钠和0.05g苯酚溶于1800ml水中，使用浓度为85%磷酸溶液调节pH至2.3，定容至2000mL；

所述的色谱检测条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为ZORBAX 

300SB‑C18；

梯度洗脱条件为：0min，流动相A为100%，流动相B为0%；5min，流动相A为69%，流动相B为

31%；47min，流动相A为60%，流动相B为40%；57min，流动相A为40%，流动相B为60%；62min，流动相A为0%，流动相B为100%；67min，流动相A为100%，流动相B为0%；75min，流动相A为100%，流动相B为0%；

检测波长为214nm；流速为1.0ml/min；柱温为40°C；进样体积20μl；

18 8 8 18

杂质为[Met (O)]特立帕肽、[Met (O)]特立帕肽、[Met (O)，Met (O)]特立帕、[rhPTH1

(1‑30)]特立帕肽、Val‑Arg‑rhPTH（1‑34）特立帕肽和[des+Ser]特立帕肽；

杂质来自于存储过程中的降解物和/或氧化物、合成过程中副产物。

2.根据权利要求1所述的特立帕肽有关物质的检测方法，其特征在于，色谱柱为ZORBAX 

300SB‑C18色谱柱，150×4.6mm，3.5μm，300Å。

3.根据权利要求1所述的特立帕肽有关物质的检测方法，其特征在于，系统适用性溶液制备过程为：将特立帕肽对照品及多种杂质加入到流动相A中，制成每1mL溶液中含有0.8mg特立帕肽，且含4μg各杂质的系统适用性溶液。

说明书

一种特立帕肽含有的杂质的检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种特立帕肽含有的杂质的检测方法，属于生物医学检测技术领域。

背景技术

[0002] 特立帕肽化学名为L‑丝氨酰‑L‑缬氨酰‑L‑丝氨酰‑L‑α‑谷氨酰‑L‑异亮氨酰‑L‑谷氨酰胺酰‑L‑亮氨酰‑L‑甲硫氨酰‑L‑组氨酰‑L‑天冬酰胺酰‑L‑亮氨酰‑甘氨酰‑L‑赖氨酰‑L‑组氨酰‑L‑亮氨酰‑L‑天冬酰胺酰‑L‑丝氨酰‑L‑甲硫氨酰‑L‑α‑谷氨酰‑L‑精氨酰‑L‑缬氨酰‑L‑α‑谷氨酰‑L‑色氨酰‑L‑亮氨酰‑L‑精氨酰‑L‑赖氨酰‑L‑赖氨酰‑L‑亮氨酰‑L‑谷氨酰胺酰‑L‑α‑天冬氨酰‑L‑缬氨酰‑L‑组氨酰‑L‑天冬酰胺酰‑L‑苯丙氨酸，为白色或类白色粉末，分子式为C181H291N55O51S2，分子量为4117.8。本品适用于有骨折高发风险的绝经后妇女骨质疏松症的治疗，可显著降低绝经后妇女椎骨和非椎骨骨折风险，但对降低髋骨骨折风险的效果尚未证实；国外应用治疗骨损伤；骨质疏松症；男性骨质疏松症；绝经后骨质疏松。

[0003] 特立帕肽为人甲状旁腺激素类似物，具有与天然甲状旁腺激素（PTH）N端34个氨基酸序列相同的结构，它可以与PTH‑1受体结合，发挥PTH对骨骼与肾脏的生理作用，同时不存在C端肽对骨代谢的不利影响。研究表明该药可以有效增加成骨细胞数量和活性，从而促进新骨生产成，增加骨密度，降低骨折风险，并可与其他治疗骨质疏松症药物联合应用增强疗效。

[0004] 特立帕肽的含有的有关物质杂质通常由起始物料中引入的杂质，化学合成反应的副产物及存储过程中的降解物组成。这些有关物质会降低分子状态特立帕肽的占比，从而不仅会降低药效，还会增大药物的副作用，给患者带来安全隐患。因此对特立帕肽中有关物质的检测及控制成为药物制备过程不可忽视的方面。

[0005] 特立帕肽是由保护氨基酸经固相合成制备所得的肽类化合物，其结构含有2分子甲硫氨酸，甲硫氨酸易氧化，故特立帕肽易产生3种氧化杂质；特立帕肽结构中含有亮氨酸和异亮氨酸，两者为同分异构体，其起始物料中互为杂质，形成了特立帕肽的同分异构杂质；起始物料与合成过程中可产生消旋氨基酸的杂质肽；特立帕肽有34个氨基酸组成，合成过程中易形成插入肽和缺失肽。

[0006] 现有检测方法中USP40、EP 9.0、JS20160050均收录了特立帕肽有关物质检测方法，JS20160050、JS20100009收录了特立帕肽注射液的有关物质检测方法，其中3个标准的原料检测方法相同，2个制剂的检测方法一致。但是上述检测标准在检测过程中容易使特立帕肽氧化，使检测的氧化杂质水平高于真实值，且对部分插入肽杂质和同分异构杂质无检测能力。

发明内容

[0007] 本发明为了解决现有技术存在的上述问题，提供一种特立帕肽含有的杂质的检测方法。

[0008] 本发明的技术方案：

[0009] 本发明的目的是提供一种特立帕肽含有的杂质的检测方法，该按方法为采用液相色谱法对特立帕肽进行分析，其中流动相A由0.05mol/L钠盐溶液与乙腈按照体积比为90:10混合而成，流动相B由0.05mol/L钠盐溶液与乙腈按照体积比为50:500混合而成；钠盐溶液制备过程为：28.8g十二烷基硫酸钠和0.05g苯酚溶于1800ml水中，使用浓度为85%磷酸溶液调节pH至2.3，定容至2000mL。

[0010] 进一步限定，色谱柱为ZORBAX 300SB‑C18色谱柱，150×4.6mm，3.5μm，300Å。

[0011] 进一步限定，检测波长为214nm。

[0012] 进一步限定，流速为1.0ml/min。

[0013] 进一步限定，柱温为40°C。

[0014] 进一步限定，进样体积20μl。

[0015] 进一步限定，梯度洗脱条件为：0min，流动相A为100%，流动相B为0%；5min，流动相A为69%，流动相B为31%；47min，流动相A为60%，流动相B为40%；57min，流动相A为40%，流动相B为60%；62min，流动相A为0%，流动相B为100%；67min，流动相A为100%，流动相B为0%；75min，流动相A为100%，流动相B为0%。

[0016] 进一步限定，系统适用性溶液制备过程为：将特立帕肽对照品及多种杂质加入到流动相A中，制成每1mL溶液中含有0.8mg特立帕肽，且含4μg各杂质的系统适用性溶液。

[0017] 更进一步限定，杂质为[Met18(O)]特立帕肽、[Met8(O)]特立帕肽、[Met8(O)，Met181
(O)]特立帕、[rhPTH(1‑30)]特立帕肽、 Val‑Arg‑rhPTH（1‑34）特立帕肽和[des+Ser]特立帕肽。

[0018] 进一步限定，杂质来自于存储过程中的降解物和/或氧化物、合成过程中副产物。

[0019] 与现有技术相比本申请具有以下有益效果：

[0020] （1）本发明利用多肽为两性化合物，其分子表面同时带有正负电荷的特性，以阴离子活性剂十二烷基硫酸钠为流动相，其带有的负电荷可与多肽表面正电荷结合，增强了流动相对多肽的洗脱能力，使不同特立帕肽杂质和特立帕肽因所带电荷数不同，而导致流动相洗脱的时间出现差异，从而增强了杂质和特立帕肽的分离能力，尤其是插入肽杂质，由于其极性与特立帕肽相近，采用常规流动相体系在反相色谱条件下难于分离，但在本申请中采用阴离子表面活性剂为流动相明显提高其余特立帕肽的分离效果，能准确检测出特立帕肽中插入肽和异亮氨酸的同分异构杂质的含量，可以有效控制产品中有关物质的含量，填补了现有检测方法对插入肽和同分异构杂质无法检测的不足。

[0021] （2）本发明还在流动相中加入抗氧剂苯酚，保证了检测过程中特立帕肽不被氧化，确保氧化杂质检测的准确度。

[0022] （3）本发明合理调控高效液相色谱检测过程中色谱柱的选择、流动相的选择，以及洗脱方式、系统适用性等的限定，有效将特立帕肽与氧化杂质、消旋体杂质、同分异构杂质、插入肽杂质、缺失肽杂质、水解杂质进行有效分离，保证了特立帕肽有关物质检测结果的准确性。

[0023] （4）本发明提供的方法仅需按要求配制对照品溶液、供试样品溶液，然后分别过同一个色谱柱，即能通过出峰时间、峰面积等计算得出有关物质的含量，检测方法简单、操作性强。

附图说明

[0024] 图1为原料方法检测特立帕肽的色谱图；

[0025] 图2为制剂方法检测特立帕肽的色谱图；

[0026] 图3为实施例1获得有关物质混合检测图谱；

[0027] 图4为实施例1供试样品溶液的HPLC图谱；

[0028] 图5为实施例1对照品溶液的HPLC图谱；

[0029] 图6为实施例1系统适用性溶液的HPLC图谱；

[0030] 图7为对比例1含苯酚的流动相A的HPLC图谱；

[0031] 图8为对比例1不含苯酚的流动相A的HPLC图谱；

[0032] 图9为实施例2系统适用性溶液的HPLC图谱；

[0033] 图10为实施例2供试样品溶液的HPLC图谱前部分；

[0034] 图11为实施例2供试样品溶液的HPLC图谱后部分；

[0035] 图12为图10的局部放大图；

[0036] 图13为对比例2流动相的HPLC图谱；

[0037] 图14为对比例3流动相的HPLC图谱。

具体实施方式

[0038] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0039] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。

[0040] 具体实施方式1：

[0041] （1）合成特立帕肽含有的典型有关物质如下表1所示：

[0042] 表1

[0043]

[0044] 现有的原料方法和制剂方法对特立帕肽含有的有关物质检测结果如图1和图2所示，具体的如下表2和3所示，其中表2为制剂方法有关物质谱检测结果，表3为原料方法有关物质检测结果。

[0045] 表2

[0046]

[0047] 表3

[0048]

[0049] 由上表1 3可知，现有原料和制剂方法均无法检测的杂质为：杂质5、杂质7、杂质9、~杂质16、杂质19和杂质22，因此USP40、EP 9.0、JS20160050、JS20100009的有关物质方法对插入肽（杂质5、杂质7、杂质9、杂质22）和亮氨酸同分异构杂质（杂质16、杂质19）不具备检测能力。

[0050] 实施例1：

[0051] （1）制备钠盐溶液：

[0052] 28.8g十二烷基硫酸钠和0.05g苯酚溶于1800ml水中，使用浓度为85%磷酸溶液调节pH至2.3，定容至2000mL，获得钠盐溶液。

[0053] （2）供试样品溶液的制备：

[0054] 将特立帕肽（原料药，批号：CP‑013‑20200901）加入流动相A溶解并稀释至每1ml中含有0.8mg的供试样品溶液。其中流动相A由0.2mol/L钠盐溶液与乙腈按照体积比为90:10混合而成。

[0055] 获得的供试样品溶液的HPLC图谱如图4所示。

[0056] （3）对照溶液的制备：

[0057] 将1mL的供试样品溶液置100ml量瓶中，加入流动相A稀释至刻度，摇晃均匀。

[0058] 获得的对照溶液的HPLC图谱如图5所示。

[0059] （4）系统适用性溶液的制备：

[0060] 将特立帕肽对照品及杂质1、杂质2、杂质3、杂质6、杂质17和杂质32加入到流动相A中溶解并稀释，制成每1mL溶液中含有0.8mg特立帕肽，且含4μg各杂质的系统适用性溶液。

[0061] 获得的系统适用性溶液的HPLC图谱如图6所示。

[0062] （5）色谱检测：

[0063] 检测条件：

[0064] 采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为ZORBAX 300SB‑C18，150×4.6mm，3.5μm，300Å，使用流动相A和流动相B按照下表4所示的梯度洗脱条件进行梯度洗脱，检测波长为214nm；柱温为40℃；流速为每分钟1.0ml；进样体积20μl。

[0065] 表4

[0066]

[0067] 系统适用性要求：

[0068] 系统适用性溶液色谱图中，出峰顺序依次为杂质3、杂质2（以双峰形式检出）、杂质6、杂质1（若杂质6和杂质1重合，可适当调整流动相比例）、杂质32、杂质17、特立帕肽，特立帕肽峰与杂质17峰之间的分离度应不小于1.5，理论板数按特立帕肽峰计算应不低于2000。

[0069] 测定方法：

[0070] 将对照溶液与供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，如图3所示，检测结果如下表5所示。

[0071] 表5

[0072]

[0073] 由上表5所示，本实施例成功检测出杂质5、杂质7、杂质9、杂质16、杂质19和杂质22，由于杂质5、杂质7、杂质9、杂质16、杂质19和杂质22为工艺杂质，因此当采用本实施例提供的检测方法可以实现上述杂质的检测时，在特立帕肽生产过程中是可以对上述工艺杂质在纯化工艺中进行去除的，且上述杂质也为非降解杂质，因此本实施例不对上述杂质的检测含量进行分析。

[0074] 具体的特立帕肽有关物质检测结果如下表6所示：

[0075] 表6

[0076]

[0077] 对比例1:

[0078] 本对比例与实施例1不同处为：流动相A中不含有苯酚，特立帕肽的批号为CP‑013‑20201002，其余操作过程与参数设定与实施例1相同。

[0079] 本对比例中不含苯酚的流动相A的HPLC图谱如图8所示。

[0080] 为了更好的体现苯酚的作用，本对比例还采用相同批次的特立帕肽原料药，进行流动相A含有苯酚的测试，具体的该测试与实施例1不同之处为：特立帕肽的批号为CP‑013‑20201002，其余操作过程与参数设定与实施例1相同。

[0081] 本对比例中含苯酚的流动相A的HPLC图谱如图7所示。

[0082] 关于本对比例中流动相A含苯酚和不含苯酚的有关物质检测结果对比，如下表7所示：

[0083] 表7

[0084]

[0085] 由上表7可知，流动相中加入抗氧剂苯酚，能保证检测过程中特立帕肽不被氧化，确保氧化杂质检测的准确度。

[0086] 对比例2：

[0087] 本对比例与实施例1不同处为：将流动相A中的28.8g十二烷基硫酸钠更换为56.8g无水硫酸钠，且采用特立帕肽一步纯化液替换特立帕肽原料液（特立帕肽原料液中不含有插入肽特异杂质，故采用含有该类杂质的中间体产品特立帕肽一步纯化液进行替换），其余操作过程与参数设定与实施例1相同。

[0088] 本对比例中流动相的HPLC图谱如图13所示。

[0089] 对比例3：

[0090] 本对比例与实施例1不同处为：采用特立帕肽一步纯化液替换特立帕肽原料液，其余操作过程与参数设定与实施例1相同。

[0091] 本对比例中流动相的HPLC图谱如图14所示。

[0092] 对对比例2和对比例3的检测结果进行比较，结果如下表8所示：

[0093] 表8

[0094]

[0095] 结果对比：杂质12、杂质15、杂质16保留时间一致，因此检出杂质为3个杂质的和，常规流动相杂质16与特立帕肽主峰重合，不能检出，因此采用十二烷基硫酸钠为流动相体系检出3个杂质的总和明显大于无水硫酸钠体系检出的杂质总和；采用十二烷基硫酸钠为流动相体系检出的总杂明显高于无水硫酸钠体系，且主要总杂集中在特立帕肽主峰前后，说明采用十二烷基硫酸钠为流动可以有效分离与特立帕肽极性相近的总杂，有效的改善反相色谱的杂质分离效能。

[0096] 实施例2：

[0097] 本实施例与实施例1不同处为：供试样品溶液为特立帕肽注射液原液（礼来、批号C969753H），其余操作过程与参数设定与实施例1相同。

[0098] 本实施例中系统适用性溶液的HPLC图谱如图9所示，供试样品溶液的HPLC图谱如图10、11和12所示。

[0099] 本实施例特立帕肽注射液原液的有关物质检测结果如下表9所示：

[0100] 表9

[0101]

[0102] 实施例3：

[0103] 本实施例为有关物质方法学验证，结果如下表10所示：

[0104] 表10

[0105]

[0106] 虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。