一种无内生菌污染的兰花种苗的培育方法

摘要

本发明提供了一种无内生菌污染的兰花种苗的培育方法，为切取大小为0.5mm的兰花试管苗茎尖进行培养，通过茎尖培养诱导出中间繁殖体，再对中间繁殖体进行增殖和分化就可以获得无内生菌污染的兰花种苗。本发明通过切取适当大小茎尖培养彻底去除兰花中的污染内生菌，可以让兰花组培快繁在适宜培养条件和培养基中进行，减少了抗生素等对兰花组培快繁的影响，进一步提高了兰花种苗质量和效益。

权利要求

1.一种兰花种苗的培育方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.以生长健壮的兰花试管苗为材料，无菌下切取0.5mm大小的茎尖，在诱导培养基上培养，获得中间繁殖体；

S2.对中间繁殖体进行增殖培养，当每个茎尖繁殖出10个以上中间繁殖体时进行分化培养，获得兰花种苗；

提取兰花种苗DNA，用内生菌检测引物进行PCR扩增反应，扩增产物经电泳检测，无扩增条带的种苗即为脱菌成功的兰花种苗；

所述内生菌检测引物包括上游引物和下游引物，其序列分别为上游引物：5’‑GGAAAGATTTTTTGGTTGGGG‑3’，下游引物：5’‑CCTTTGAGTTTTAGCCTTGCG‑3’；

所述兰花为‘小凤兰’。

2.根据权利要求1所述培育方法，其特征在于，步骤S1诱导培养基为MS+1.0～2.0 mg/L 

6‑BA+ 0.1～0.5 mg/L NAA+5.0～20.0%（w/w）椰子汁+30.0 g/L白砂糖+7.0～8.0 g/L卡拉胶+0.2～1.0 g/L AC，pH 5.6～6.0；所述培养为24～26℃黑暗下培养2～3个月。

3.根据权利要求1所述培育方法，其特征在于，步骤S2增殖培养的培养基为MS+0.5～

2.0 mg/L 6‑BA+0.2～0.5 mg/L NAA+30.0 g/L白砂糖+7.0 g/L卡拉胶+0.3～0.5 g/L AC，pH 5.6～6.0；所述增殖培养为24～26℃黑暗或每日光照11～13 h，光照强度600～1000 lux下培养，40～60 d继代1次。

4.根据权利要求1所述培育方法，其特征在于，步骤S2分化培养的培养基为MS+1.0～

2.0 mg/L 6‑BA+0.1～0.2 mg/L NAA+30.0 g/L白砂糖+7.0 g/L卡拉胶+0.00～0.05 g/L AC，pH 5.6～6.0；所述分化培养为24～26℃、每日光照11～13 h，光照强度1000～2000 lux下培养40～60 d。

5.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述检测内生菌的PCR扩增反应体系如下：Mix 12.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，ddH2O 10.0 μL，模板DNA 1.0 μL，共

25.0 μL；扩增程序：90℃ 5 min；94℃ 30 s，54.4℃ 30 s，72℃ 2 min 30 s，34个循环；72℃ 10min；4℃ ∞。

说明书

一种无内生菌污染的兰花种苗的培育方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物种苗生产技术领域。更具体地，涉及一种无内生菌污染的兰花种苗的培育方法。

背景技术

[0002] 兰花(Cymbidium)是兰科兰属植物，是一类具有重要观赏价值、经济价值、文化价值和生态价值的世界名花。世界上已发现的兰属植物约68种，其中在我国发现49种，占全世界的72.1％。兰花在我国具有悠久的栽培历史和丰富的文化内涵，素有“花中君子”之称，兰花也深受世界各国人们的喜爱，即可作为高档切花，也可作为高档盆花。随着人们生活水平和文化素质的提高，兰花开始走进寻常百姓家，受到越来越多消费者的喜爱，具有广阔的市场前景。

[0003] 内生菌污染是指由于内生菌存在于植物体内，一般表面消毒方法难以彻底清除，随外植体材料进入培养过程引起的污染。内生菌污染在观赏植物种苗工厂化生产中经常出现，一般发生在接种5d后，或在继代培养中出现，初期在培养基中形成“丝状物”或“晕状物”，不易被肉眼察觉，背光条件下检查较易被发现，经多次继代培养后，菌量累积，才在培养基中表现出来(Kritzi9ger et al.，1997；周俊辉等，2003；汤雪燕等，2014；Srivastava et al.,2021)。迄今，已在47种(属)植物的组培快繁中发现内生菌污染，并从中分离鉴定出约51种内生菌。已有研究结果表明内生菌污染对植物组培快繁各环节产生不利影响，降低组培快繁效率和效益。因此研究内生菌污染的防控技术，对进一步提高植物种苗工厂化生产效率和效益，以及我国种苗产业竞争力具有重要意义。

[0004] 植物组培快繁中内生菌污染的防控措施主要有减少外植体含菌量、改变培养基成分或pH值、往培养基中添加抗生素以及培养脱菌苗等(周权男等，2012；周俊辉等，2003；温璐华和武瑞娜，2020)。在上述方法中，培养脱菌苗是控制内生菌污染的根本方法，陈传红等(2019)以赣南脐橙丛生芽的茎尖分生组织为外植体，枳壳无菌实生幼苗作为砧木，采用热处理结合茎尖培养脱菌的方法，成功培养脱菌苗，脱菌率可达93.2％(陈传红,古晓斌,应家轩,等.赣南脐橙无菌苗生产的组培脱菌与微芽嫁接快繁技术[J].北方园艺,2019(18):26‑31.)。

[0005] 由于兰花种苗工厂化生产中内生菌污染经常发生，内生菌污染严重时显著降低组培快繁效益和效率。如何对兰花脱菌，目前没有报道。并且现有防控内生菌污染技术主要是为了减少内生菌对培养材料的影响，难以彻底消除内生菌污染，有些防控措施还会对兰花中间繁殖体的增殖分化和试管苗生产发生不利影响。因此开发脱除兰花内生菌技术，彻底解决内生菌污染问题，对提高兰花种苗产业竞争力，打好种业翻身仗具有重要意义。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的缺陷和不足，提供一种无内生菌污染的兰花种苗的培育方法。

[0007] 本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

[0008] 一种无内生菌污染的兰花种苗的培育方法，包括如下步骤：

[0009] S1.茎尖培养：以生长健壮的兰花试管苗为材料，无菌下切取0.5mm大小的茎尖，在诱导培养基上培养，获得中间繁殖体；

[0010] S2.中间繁殖体增殖和分化：对中间繁殖体进行增殖培养，当每个茎尖繁殖出10个以上中间繁殖体时进行分化培养，获得兰花种苗。

[0011] 本发明通过切取适当大小的兰花茎尖进行培养，从而彻底去除兰花中特定的污染内生菌，可以让兰花组培快繁在适宜培养条件和培养基中进行，减少了抗生素等对兰花组培快繁的影响。

[0012] 优选地，还包括对步骤S2获得的兰花种苗进行有无内生菌污染验证。所述验证方法可以为对兰花种苗组织进行中的内生菌进行分离和培养，也可以兰花种苗总DNA为模板，利用内生菌的检测引物进行PCR检测。

[0013] 进一步优选地，所述验证为提取兰花种苗DNA，用内生菌检测引物进行PCR扩增反应，扩增产物经电泳检测，从而判断是否有无内生菌污染。具体为采用CTAB法提取试管苗总DNA，根据内生菌16S rDNA序列进行特异性引物设计，利用特异性引物对试管苗总DNA进行PCR扩增，扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测脱菌效果。

[0014] 本发明对特定兰花内生菌的去除主要在于通过切取适当大小茎尖进行培养去除内生菌；而中间繁殖体的诱导、增殖、分化，这三个步骤对去除内生菌没有影响，但对能否生产出脱菌苗有影响。

[0015] 优选地，步骤S1诱导培养基为MS+1.0～2.0mg/L 6‑BA+0.1～0.5mg/L NAA+5.0～20.0％(w/w)椰子汁+30.0g/L白砂糖+7.0～8.0g/L卡拉胶+0.2～1.0g/L AC，pH 5.6～6.0；
所述培养为24～26℃黑暗下培养2～3个月。

[0016] 进一优选地，所述茎尖培养为选择株高为8cm左右且生长健壮的兰花试管苗，在超净工作台上解剖镜下无菌培养皿中用无菌常温手术刀和解剖针去除叶片剥去鞘叶和叶片，切取0.5mm大小的茎尖进行诱导培养。

[0017] 优选地，步骤S2增殖培养的培养基为MS+0.5～2.0mg/L 6‑BA+0.2～0.5mg/L NAA+30.0g/L白砂糖+7.0g/L卡拉胶+0.3～0.5g/L AC，pH 5.6～6.0；所述增殖培养为24～26℃黑暗或每日光照11～13h，光照强度600～1000lux下培养，40～60d继代1次。

[0018] 进一步优选地，所述增殖培养为将步骤S1的中间繁殖体控制在1cm以内或大块类原球茎切成0.5cm×0.5cm大小，接种到增殖培养基中，每瓶接8～15条(块)。

[0019] 优选地，步骤S2分化培养的培养基为MS+1.0～2.0mg/L 6‑BA+0.1～0.2mg/L NAA+30.0g/L白砂糖+7.0g/L卡拉胶+0.00～0.05g/L AC，pH 5.6～6.0；所述分化培养为24～26℃、每日光照11～13h，光照强度1000～2000lux下培养40～60d。

[0020] 进一步优选地，所述分化培养为将未去顶长度为0.8～1.0cm的根状茎或切成大小为0.5cm×0.5cm的类原球茎接种到分化培养基中，每瓶接8～12条(块)，在25℃左右、每日光照11～13h，光照强度1000～2000lux下培养40～60d；将株高3.0～5.0cm的苗接种到生根壮苗培养基中，在相同条件下培养40～60d。

[0021] 优选地，所述生根壮苗培养基配方为MS+0.1～0.2mg/L 6‑BA+0.5～1.0mg/L NAA+30.0g/L白砂糖+7.0g/L卡拉胶+0.3～0.5g/L AC，pH 5.6～6.0。

[0022] 优选地，所述兰花为‘小凤兰’。

[0023] 优选地，所述内生菌为内生细菌XF‑NSJ。

[0024] 优选地，所述检测内生细菌XF‑NSJ的特异性引物包括上游引物和下游引物，其序列分别为上游引物：5’‑GGAAAGATTTTTTGGTTGGGG‑3’，下游引物：5’‑CCTTTGAGTTTTAGCCTTGCG‑3’。

[0025] 进一步优选地，所述检测内生细菌XF‑NSJ的PCR扩增反应体系如下：Mix 12.0μL，上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，ddH2O 10.0μL，模板DNA 1.0μL，共25.0μL；扩增程序：90℃5mi9；94℃30s，54.4℃30s，72℃2mi9 30s，34个循环；72℃10mi9；4℃∞。

[0026] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0027] 本发明通过切取适当大小的兰花茎尖进行培养，可彻底去除兰花中的污染内生菌，可让兰花组培快繁在适宜培养条件和培养基中进行，获得无内生菌污染的兰花种苗，从而消除内生菌污染对兰花组培快繁的影响，提高组培快繁的效率和效益，同时避免了抗生素等对兰花组培快繁的影响，进一步提高种苗质量和效益。

附图说明

[0028] 图1为茎尖大小对‘小凤兰’中间繁殖体诱导的影响。其中A为不同大小的茎尖及茎尖诱导形成的根状茎，B为不同大小茎尖的根状茎诱导率。

[0029] 图2为茎尖大小对‘小凤兰’根状茎增殖、分化和生根壮苗的影响。其中A为不同大小茎尖的增殖根状茎数，B为不同大小茎尖分化的幼苗数，C为不同大小茎尖生产的试管苗数，D为不同大小茎尖增殖的根状茎和分化的苗。

[0030] 图3为不同大小茎尖培养的‘小凤兰’试管苗脱菌效果检测。其中，M：DL2000Marker，1：0.5mm茎尖培养试管苗，2：1.0mm茎尖培养试管苗，3：2.0mm茎尖培养试管苗，4：3.0mm茎尖培养试管苗，5：阳性对照：受内生菌污染的‘小凤兰’组培苗，6：阴性空白对照。

具体实施方式

[0031] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0032] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

[0033] 以下实施例以‘小凤兰’兰花品种为例，来进一步说明本发明，所述‘小凤兰’是以‘大凤’杂交兰为母本，‘企剑白墨’墨兰为父本杂交育成的兰花新品种，株形似‘企剑白墨’，易组织培养快速繁殖和分株繁殖。单枝平均着花9朵，花径7.4cm，花橙色，有香气。温室栽培1月下旬始花，花期35～45d。

[0034] 细菌XF‑NSJ为是发明人自行分离出的兰花污染内生菌，为短小杆菌属(Curtobacterium)的一种，其16S rDNA序列如下：

[0035] AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCGTTGGAAACGACGTCTAATACTGGATATGACCGCCGATCGCATGGTCTGGTGGTGGAAAGATTTTTTGGTTGGGGATGGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTAGTAGGGAAGAAGCGTAAGTGACGGTACCTGCAGAAAAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGCTGTGAAATCCCGAGGCTCAACCTCGGGCTTGCAGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGCGGTAGGGGAGATTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGATCTCTGGGCCGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGCGCTAGATGTAGGGACCTTTCCACGGTTTCTGTGTCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGGCCAGAGATGGTTGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTATGTTGCCAGCGCGTTATGGCGGGGACTCATAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCGATACCGTAAGGTGGAGCGAATCCCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGAGGTCTGCAACTCGACCTCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGAAGGAGCCGTCGAAGGTGGGATCGGTGATTAGGACTAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCT。

[0036] 实施例1一种无内生细菌XF‑NSJ污染的兰花种苗的培育方法

[0037] S1.茎尖培养：以生长健壮的‘小凤兰’试管苗为材料，无菌下切取茎尖，在诱导培养基上培养，获得根状茎(中间繁殖体)；具体为：

[0038] S11.试管苗选择和茎尖分离：选择株高为8cm左右且生长健壮的‘小凤兰’试管苗，在超净工作台上解剖镜下无菌培养皿中用无菌常温手术刀和解剖针去除叶片剥去鞘叶和叶片，分别切取0.5、1.0、2.0和3.0mm茎尖(图1A上图)；

[0039] S12.根状茎诱导：将茎尖快速接入诱导培养基MS+2.0mg/L 6‑BA+0.5mg/LNAA+7.0g/L卡拉胶+30.0g/L白砂糖+0.5g/L AC+10.0％(w/w)椰子汁，pH 5.8，在温度25℃左右黑暗下培养90d，诱导出的根状茎见图1A下图。统计根状茎诱导率发现，不同大小的茎尖根状茎诱导率不同，茎尖越大，根状茎诱导率越高(图1B)。

[0040] S2.根状茎增殖和分化生产试管苗：对根状茎进行增殖培养，当每个茎尖繁殖出10条1.0cm左右根状茎时即可进行分化培养，获得试管苗；具体为：

[0041] S21.根状茎增殖：将根状茎切成0.8～1.0cm接种到增殖培养基MS+1.5mg/L6‑BA+0.2mg/L NAA+30.0g/L白砂糖+7.0g/L卡拉胶+0.5g/L AC，pH 5.8，每瓶接8～10条，在2421℃、光照强度为800～1000lux的条件下增殖培养，45d继代1次，继代培养形成的根状茎见图
2D上；

[0042] S22.根状茎分化生产试管苗：将未去顶长度为0.8～1.0cm的根状茎接种到分化培养基MS+1.5mg/L 6‑BA+0.2mg/L NAA+30.0g/L白砂糖+7.0g/L卡拉胶+0.02g/L AC，pH 5.8，每瓶接8～10条，在2421℃、每日光照11～13h，光照强度1000～1500lux下培养45d左右，分化形成的苗见图2D中；将3.0～5.0cm左右的苗接到生根壮苗培养基MS+0.1mg/L 6‑BA+0.5mg/L NAA+7.0g/L卡拉胶+30.0g/L白砂糖+0.5g/L AC，pH 5.8，在相同条件下培养45d左右，生产的试管苗见图2D中下。

[0043] 另外不同大小茎尖的增殖根状茎数，不同大小茎尖分化的幼苗数及不同大小茎尖生产的试管苗数如图2A‑C所示，可见，不同大小茎尖的增殖根状茎数、分化的幼苗数及生产的试管苗均不同，茎尖越大，殖根状茎数、分化的幼苗数及生产的试管苗越多，但是茎尖越大，意味着内生菌污染风险越大。

[0044] S3.去除污染内生菌效果鉴定：采用CTAB法提取‘小风兰’试管苗总DNA，根据‘小凤兰’污染内生细菌XF‑NSJ的16S rDNA序列进行特异性引物设计，利用特异性引物进行DNA的PCR扩增，扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测脱菌效果，获得无污染内生菌试管苗；具体为：

[0045] S31.试管苗DNA提取：取单株试管苗约200.0mg，液氮研磨成粉末，然后用CTAB法提取总DNA。

[0046] S32.引物设计和合成：根据污染内生细菌XF‑NSJ的16S rDNA序列采用Primer 5.0软件进行特异性引物的设计，具体设计的引物如下：

[0047] 上游引物：5’‑GGAAAGATTTTTTGGTTGGGG‑3’，

[0048] 下游引物：5’‑CCTTTGAGTTTTAGCCTTGCG‑3’；

[0049] 将上述引物送到广州擎科生物公司合成后用于PCR扩增。

[0050] S33.PCR扩增：以‘小风兰’茎尖培养的试管苗DNA为模版，采用污染内生细菌XF‑NSJ的16S rDNA特异性引物进行PCR扩增。扩增反应体系(25.0μL)：Mix 12.0μL，上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，ddH2O 10.0μL，模板DNA 1.0μL。扩增程序：90℃5mi9；94℃30s，54.4℃30s，72℃2mi9 30s，34个循环；72℃10mi9；4℃∞。

[0051] S34.电泳检测：取10.0μL PCR反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳(150V，30mi9)，以DL2000 DNA Marker为分子量对照，在UVP凝胶成像系统中观察结果并拍照，如扩增出污染内生菌特异条带则判定脱菌失败，如无特异条带则表明脱菌成功。

[0052] 结果如图3和表1所示，采用0.5mm‘小风兰’试管苗茎尖培养生产出的试管苗脱除污染内生细菌XF‑NSJ的效果为100.0％，因此选择切取0.5mm大小的兰花茎尖进行培养，可彻底去除兰花中的污染内生菌。

[0053] 表1不同大小茎尖培养的‘小凤兰’试管苗脱菌成功率

[0054]

[0055] 实施例2一种无内生细菌XF‑NSJ污染的兰花种苗的培育方法

[0056] 与实施例1基本相同，不同之处在于，各培养基配方不同。具体地，诱导培养基为MS+1.0mg/L 6‑BA+0.1mg/L NAA+8.0g/L卡拉胶+30.0g/L白砂糖+0.2g/L AC+5.0％(w/w)椰子汁，pH 5.6。

[0057] 增殖培养基为MS+0.5mg/L 6‑BA+0.5mg/L NAA+30.0g/L白砂糖+7.0g/L卡拉胶+0.3g/L AC，pH 5.6。

[0058] 分化培养基为MS+1.0mg/L 6‑BA+0.1mg/L NAA+30.0g/L白砂糖+7.0g/L卡拉胶+0.00g/L AC，pH 5.6。

[0059] 生根壮苗培养基MS+0.2mg/L 6‑BA+1.0mg/L NAA+7.0g/L卡拉胶+30.0g/L白砂糖+0.3g/L AC，pH 5.6。

[0060] 实施例3一种无内生细菌XF‑NSJ污染的兰花种苗的培育方法

[0061] 与实施例1基本相同，不同之处在于，各培养基配方不同。具体地，诱导培养基为MS+1.5mg/L 6‑BA+0.3mg/L NAA+7.5g/L卡拉胶+30.0g/L白砂糖+1.0g/L AC+20.0％(w/w)椰子汁，pH 6.0。

[0062] 增殖培养基为MS+2.0mg/L 6‑BA+0.35mg/L NAA+30.0g/L白砂糖+7.0g/L卡拉胶+0.4g/L AC，pH 6.0。

[0063] 分化培养基为MS+2.0mg/L 6‑BA+0.15mg/L NAA+30.0g/L白砂糖+7.0g/L卡拉胶+0.05g/L AC，pH 6.0。

[0064] 生根壮苗培养基MS+0.15mg/L 6‑BA+0.75mg/L NAA+7.0g/L卡拉胶+30.0g/L白砂糖+0.4g/L AC，pH 6.0。

[0065] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。