一种高固含量纤维素发酵乙醇的方法

摘要

本发明属于生物质领域，公开了一种高固含量纤维素发酵乙醇的方法，包括将NaOH强化乙醇预处理得到的木质纤维素A和AlCl3强化乙醇预处理木质纤维素B混合，加水混合得混合纤维素液；之后加入营养盐、灭菌、糖化发酵，发酵过程中补充混合纤维素，补料完成后混合纤维素与水的质量比为(30～45)：100。本发明利用不同强化处理的纤维素进行混合发酵，在底物的固体含量较高的环境下，发酵初期和发酵中期采用不同的补料配比能明显提升乙醇产量；使用一定含水量的预处理木质纤维素，一方面降低了烘干原料的能耗，另一方面可保持纤维原有形态，可以显著提高乙醇浓度，且可以更早达到发酵终点，节约了发酵时间。

权利要求

1.一种高固含量纤维素发酵乙醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)预处理：将NaOH强化乙醇预处理得到的木质纤维素A和AlCl3强化乙醇预处理木质纤维素B按(2：8)～(4：6)的比例混合得到混合纤维素，所述混合纤维素的含水率为25～60%，按绝干混合纤维素：水=(7～10)：100的质量比混合，得混合纤维素液；

2)灭菌处理：向步骤1)的混合纤维素液中加入营养盐，灭菌得到灭菌液；

3)糖化发酵：向灭菌液中加入纤维素酶和酵母活化液，然后进行同步糖化发酵，所述同步糖化发酵的总时间为24～200 h；

4)补料处理：开始发酵后的6～24h内，向发酵罐内分批或持续补充灭菌后的混合纤维素，补料完成后，绝干计的混合纤维素与水的质量比为(30～45)：100，木质纤维素A和木质纤维素B的终混合比为(5：5)～(6.5：3.5) ，补料通过分批进行，在开始发酵5～7 h后，进行第一次补料，第一次补料时，木质纤维素A和木质纤维素B的比为(4：6)～(6：4)；在开始发酵

11～13h后，进行第二次补料；在开始发酵后22～24 h后，进行最后一次补料。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述木质纤维素的原料选自杨木、桉木、蔗渣、玉米秸秆、小麦秸秆、玉米芯中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中灭菌温度为110～130℃，灭菌时间10～30min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中的发酵过程的温度为30～

38℃，pH为4～6，转速为100～200rpm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中的纤维素酶的加入量为10～20FPU/g，酵母活化液的加入量为40～60mL/L去离子水。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，补料完成后，混合纤维素A和B的总比值为

6:4。

说明书

一种高固含量纤维素发酵乙醇的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物质转化与利用技术领域，更具体地，涉及一种高固含量纤维素发酵乙醇的方法。

背景技术

[0002] 我国作为农业大国，生物质资源相当丰富。然而大部分农林废弃物采用就地焚烧或掩埋的方式处理，不仅浪费资源，还会污染生态环境。农林废弃物中纤维素和半纤维素是重要的可利用成分，将其通过发酵技术转化成乙醇，可以在处理农林废弃物的同时生产生物质能源，是一种具有经济效益的处理方式。

[0003] 在发酵生产中想要获得较高的乙醇产量可以通过提高其底物固体浓度来实现。在传统乙醇发酵中，固体含量在20%～24%范围内，而高浓度乙醇发酵中固体含量则大于30[1]% ，高固体浓度可以有效提高设备利用率、降低生产成本、降低生产过程中的能耗。然而，由于高固体浓度发酵过程中传热传质性能差、木质素与酶的非生产性结合和较低的水浓度[2] [3]
等问题 ，当固体含量大于15%时，乙醇产量会下降 。同时反应过程中产生的甘油、乙酸、乳酸等副产物的浓度也会随着固体含量的增加而增加，这些副产物对发酵的微生物产生一[4]
定的抑制作用 。

[0004] 高底物负荷发酵需要大量的生物质，在高固酶解发酵过程中，固相基质主要以多孔介质结构存在于反应器内。大量研究证明，多孔结构特性是影响木质纤维素酶解的重要[5]原因，直接影响酶与纤维素底物的可及性 。其中，干燥步骤由于水分的流失和加热会引起[6]
孔径的收缩 。水会影响酶解发酵的进行，与生物质紧密结合的水通常被称为束缚水，其自由度和动力学受到限制，在底物负荷较高的条件下，水与生物结合更为紧密，会降低基质传[7]
递和反应效率 。

[0005] 因此，有必要开发一种能有效提升高固体浓度下的发酵乙醇效率的方法。

[0006] 参考文献：

[0007] [1].惠继星,胡斌,宁艳春,陈希海,岳军,王硕,屈海峰,胡世洋,范锐.高浓度乙醇发酵技术研究进展[J].化工科技,2021,29(03):85‑88.

[0008] [2].Kim Y, Kreke T, Ko J K, et al. Hydrolysis‐determining substrate characteristics in liquidhot water pretreated hardwood[J]. Biotechnology and bioengineering, 2015,112(4): 677‑687.

[0009] [3].Jin W, Chen L, Hu M, et al. Tween‑80 is effective for enhancing steam‑exploded biomassenzymatic saccharification and ethanol production by specifically lessening cellulase absorption with lignin in common reed[J]. Applied Energy, 2016,175:82‑90.

[0010] [4].Liu Z, Qin L, Zhu J, et al. Simultaneous saccharification and fermentation of steam‑explodedcorn stover at high glucan loading and high temperature[J]. Biotechnology forBiofuels, 2014,7(1):167.

[0011] [5].张玉针. 生物质多孔颗粒特性及其高固酶解发酵过程的研究[D].中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所),2017.

[0012] [6].Feng L, Xu Y, Xiao Y, et al. Effects of pre‑drying treatments combined with explosion puffingdrying on the physicochemical properties, antioxidant activities and flavor characteristics of apples[J]. Food Chemistry, 2021, 338: 128015.

[0013] [7].Roberts K M, Lavenson D M, Tozzi E J, et al. The effects of water interactions in cellulose suspensions on mass transfer and saccharificationefficiency at high solids loadings[J]. Cellulose, 2011, 18(3): 759‑773。

发明内容

[0014] 本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种高固含量纤维素发酵乙醇的方法。

[0015] 本发明所采取的技术方案是：

[0016] 一种高固含量纤维素发酵乙醇的方法，包括如下步骤：

[0017] 1)预处理：将NaOH强化乙醇预处理得到的木质纤维素A和AlCl3强化乙醇预处理木质纤维素B按(2：8)～(6：4)的比例混合，按绝干混合纤维素：水=(7～10)：100的质量比混合，得混合纤维素液；

[0018] 2)灭菌处理：向步骤1)的混合纤维素液中加入营养盐，灭菌得到灭菌液；

[0019] 3)糖化发酵：向灭菌液中加入纤维素酶和酵母活化液，然后进行同步糖化发酵；

[0020] 4)补料处理：开始发酵后的6～24h内，向发酵罐内分批或持续补充灭菌后的混合纤维素，补料完成后，绝干计的混合纤维素与水的质量比为(30～45)：100，木质纤维素A和木质纤维素B的终混合比为(5：5)～(6.5：3.5)。

[0021] 在一些方法的实例中，所述混合纤维素的含水率为0～60%。

[0022] 在一些方法的实例中，所述同步糖化发酵的总时间为24～200 h。

[0023] 在一些方法的实例中，补料通过分批进行，在开始发酵5～7 h后，进行第一次补料；在开始发酵11～13h后，进行第二次补料；在开始发酵后22～24 h后，进行最后一次补料。

[0024] 在一些方法的实例中，第一次补料时，木质纤维素A和木质纤维素B的比为(4：6)～(6：4)。

[0025] 在一些方法的实例中，补料完成后，混合纤维素A和B的总比值为6:4。

[0026] 在一些方法的实例中，所述的步骤3中的发酵过程的温度为30～38℃，pH为4～6，时间为0～200h，转速为100～200rpm。

[0027] 在一些方法的实例中，所述的步骤3中的纤维素酶的加入量为10～20FPU/g，酵母活化液的加入量为40～60mL/L去离子水。

[0028] 在一些方法的实例中，所述的步骤2中灭菌温度为110～130℃，灭菌时间10～30min。

[0029] 在一些方法的实例中，所述木质纤维素的原料选自杨木、桉木、蔗渣、玉米秸秆、小麦秸秆、玉米芯中的至少一种。

[0030] 在一些方法的实例中，木质纤维素A的制备方法包括将木质纤维原料按绝干质量体积比为1g：10mL加入60%（v/v）的乙醇水溶液，再加入10%NaOH，在195℃下反应30min，分离得到。

[0031] 在一些方法的实例中，木质纤维素B的制备方法包括将木质纤维原料按绝干质量体积比为1g：10mL加入60%（v/v）的乙醇水溶液，再加入0.025mol/L的AlCl3，在200℃下反应10min，分离得到。

[0032] 本发明的有益效果是：

[0033] 本发明利用NaOH强化乙醇预处理杨木和AlCl3强化乙醇预处理杨木进行混合发酵，在底物的固体含量较高的环境下，发酵初期和发酵中期采用不同的补料配比能明显提升乙醇产量。

[0034] 本发明的一些实例，使用一定含水量的预处理木质纤维素，一方面降低了烘干原料的能耗，另一方面可保持纤维原有形态，可以显著提高乙醇浓度，且可以更早达到发酵终点，节约了发酵时间。

具体实施方式

[0035] 一种高固含量纤维素发酵乙醇的方法，包括如下步骤：

[0036] 1)预处理：将NaOH强化乙醇预处理得到的木质纤维素A和AlCl3强化乙醇预处理木质纤维素B按(2：8)～(6：4)的比例混合，按绝干混合纤维素：水=(7～10)：100的质量比混合，得混合纤维素液；

[0037] 2)灭菌处理：向步骤1)的混合纤维素液中加入营养盐，灭菌得到灭菌液；

[0038] 3)糖化发酵：向灭菌液中加入纤维素酶和酵母活化液，然后进行同步糖化发酵；

[0039] 4)补料处理：开始发酵后的6～24h内，向发酵罐内分批或持续补充灭菌后的混合纤维素，补料完成后，绝干计的混合纤维素与水的质量比为(30～45)：100，木质纤维素A和木质纤维素B的终混合比为(5：5)～(6.5：3.5)。

[0040] 营养盐为常用的营养盐，用于保证酵母增殖的需要。

[0041] 在一些方法的实例中，所述混合纤维素的含水率为0～60%。

[0042] 在一些方法的实例中，所述同步糖化发酵的总时间为24～200 h。具体的发酵时间可以根据具体的发酵结果进行相应的调整。

[0043] 可以根据发酵物的粘度确定补料的时机。在一些方法的实例中，补料通过分批进行，在开始发酵5～7 h后，进行第一次补料；在开始发酵11～13h后，进行第二次补料；在开始发酵后22～24 h后，进行最后一次补料。各次补料的量可以相同或不同。

[0044] 在一些方法的实例中，第一次补料时，木质纤维素A和木质纤维素B的比为(4：6)～(6：4)。实验数据表明这样可以更好地促进发酵。

[0045] 在一些方法的实例中，补料完成后，混合纤维素A和B的总比值为6:4。实验数据表明，这一混合比下，可以缩短总的发酵时间，同时获得更高的乙醇浓度。

[0046] 在一些方法的实例中，所述的步骤3中的发酵过程的温度为30～38℃，pH为4～6，时间为0～200h，转速为100～200rpm。

[0047] 在一些方法的实例中，所述的步骤3中的纤维素酶的加入量为10～20FPU/g，酵母活化液的加入量为40～60mL/L去离子水。

[0048] 在一些方法的实例中，所述的步骤2中灭菌温度为110～130℃，灭菌时间10～30min。

[0049] 在一些方法的实例中，所述木质纤维素的原料选自杨木、桉木、蔗渣、玉米秸秆、小麦秸秆、玉米芯中的至少一种。

[0050] 在一些方法的实例中，木质纤维素A的制备方法包括将木质纤维原料按绝干质量体积比为1g：10mL加入60%（v/v）的乙醇水溶液，再加入10%NaOH，在195℃下反应30min，分离得到。当然，也可以使用其他接近的条件得到木质纤维素A。

[0051] 在一些方法的实例中，木质纤维素B的制备方法包括将木质纤维原料按绝干质量体积比为1g：10mL加入60%（v/v）的乙醇水溶液，再加入0.025mol/L的AlCl3，在200℃下反应10min，分离得到。当然，也可以使用其他接近的条件得到木质纤维素B。

[0052] 下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现不同方案。

[0053] 方便比较起见，所用杨木原料经风干、粉碎处理，其组分含量为纤维素43.05%，半纤维素13.90%，木素23.65%。

[0054] 酵母活化液制备：：称取1g葡萄糖、1g蛋白胨、0.5g酵母提取物溶于50mL去离子水中，接入3.3g酿酒酵母，在150 rpm摇床上34℃活化60min。

[0055] 实施例1一种通过不同补料配比提升在高固体浓度下的发酵效率的方法[0056] S1. 向杨木原料中按绝干质量体积比为1g：10mL加入60%（v/v）的乙醇水溶液，再加入10%NaOH，在195℃下反应30min，分离得到NaOH强化乙醇预处理杨木；

[0057] S2. 向杨木原料中按绝干质量体积比为1g：10mL加入60%（v/v）的乙醇水溶液，再加入0.025mol/L的AlCl3，在200℃下反应10min，分离得到AlCl3强化乙醇预处理杨木；

[0058] S3. 将6h至24h所要用到的两种预处理杨木用55℃烘箱烘至绝干，得到含水率为0%的烘料；

[0059] S4. 将NaOH预处理杨木和AlCl3预处理杨木按5:5的比例混合，向混合的预处理杨木加水得到预处理杨木‑水混合料，杨木的绝干质量与水的质量比为8:100；

[0060] S5. 向步骤S4预处理杨木‑水混合料中加入营养盐、调节pH至4.8、121℃下灭菌20min得到灭菌杨木混合料；

[0061] S6. 向灭菌杨木混合料中加入对应32%底物浓度的15 FPU/g纤维素酶、50ml/L去离子水的酵母活化液，在34℃，转速为130rpm/min下进行同步糖化发酵；

[0062] S7. 步骤S6开始发酵后，6h、12h和24h分别加入质量为水的8%的绝干预处理木质纤维混合料，发酵6h后其粘度降至56 mPa·S，补充和S4相同配比的灭菌混合预处理杨木烘料，12h和24h依次补充剩余灭菌混合预处理杨木烘料的二分之一。

[0063] 实施例2一种通过混合发酵提升乙醇效率的方法

[0064] 同实施例1的方法，区别在于，0h和6h时补充的NaOH强化乙醇预处理杨木与AlCl3强化乙醇预处理杨木的混合比例为4:6，发酵6h后其粘度降至48 mPa·S。

[0065] 实施例3一种通过混合发酵提升乙醇效率的方法

[0066] 同实施例1的方法，区别在于，0h和6h时补充的NaOH强化乙醇预处理杨木与AlCl3强化乙醇预处理杨木的混合比例为2:8，发酵6h后其粘度降至40 mPa·S。

[0067] 对比例1

[0068] 同实施例1的方法，区别在于，0h和6h时补充的NaOH强化乙醇预处理杨木与AlCl3强化乙醇预处理杨木的混合比例为6:4，发酵6h后其粘度依然高达60 mPa·S。

[0069] 实验测定

[0070] 对实施例1‑3和对比例1发酵6至144h时的发酵液采用高效液相色谱法测定发酵液中乙醇浓度，具体结果如表1所示：

[0071] 表1 不同处理组发酵6至144h时发酵液中乙醇浓度（g/L）

[0072]  实施例1 实施例2 实施例3 对比例1
6h 24.17 26.50 27.29 23.12
12h 33.10 35.66 36.08 32.57
24h 44.76 46.85 48.02 45.44
48h 55.75 58.26 60.88 54.75
72h 58.25 59.69 63.34 56.80
96h 56.77 60.39 64.08 57.13
120h 57.19 58.63 63.22 54.43
144h 55.90 58.39 62.95 56.51

[0073] 从表1的结果可以看出，在底物浓度（32%）和总配比（6:4）一致的情况下，采用不同的补料配比乙醇浓度有明显的提升，0h和6h按照2:8的配比发酵时的乙醇最大浓度达到64.08g/L(实施例3)，与0h和6h按照6:4配比补料时最大乙醇浓度为57.13g/L（对比例1），浓度提升了12.16%。可见，按照本发明的方法可有效提升杨木高浓发酵乙醇产率。

[0074] 实施例4

[0075] S1. 向杨木原料中按绝干质量体积比为1g：10mL加入60%（v/v）的乙醇水溶液，再加入10%NaOH，在195℃下反应30min，分离得到NaOH强化乙醇预处理杨木；

[0076] S2. 向杨木原料中按绝干质量体积比为1g：10mL加入60%（v/v）的乙醇水溶液，再加入0.025mol/L的AlCl3，在200℃下反应10min，分离得到AlCl3强化乙醇预处理杨木；

[0077] S3.将6h至24h所要用到的两种预处理杨木用55℃烘箱烘干水分，获得50%含水量的烘料。

[0078] S4.将NaOH预处理杨木和AlCl3预处理杨木按2:8比例混合，向混合的预处理杨木加水得到预处理杨木‑水混合料，杨木的绝干质量与水的质量比为8:100；

[0079] S5.向步骤S3预处理杨木‑水混合料中加入营养盐、调节pH至4.8、121℃下灭菌20min得到灭菌杨木混合料；

[0080] S6. 向灭菌杨木混合料中加入对应32%底物浓度的15FPU/g纤维素酶、50ml/L去离子水的酵母活化液，在34℃，转速为130rpm/min下进行同步糖化发酵。

[0081] S7. 步骤S6开始发酵后，6h、12h和24h按照剩余混合杨木总量的三分之一补充烘料。其中，6h补充和S4步骤相同配比的灭菌混合烘料，12h和24h依次补充剩余灭菌混合烘料的二分之一。

[0082] 实施例5：一种通过提升含水率来提升高浓乙醇发酵效率的方法

[0083] 同实施例4的方法，区别在于，步骤S3中获得的烘料含水率为25%。

[0084] 实施例6：一种通过提升含水率来提升高浓乙醇发酵效率的方法

[0085] 同实施例4的方法，区别在于，总底物浓度为38%，步骤S6中向灭菌杨木混合料中加入对应38%底物浓度的15FPU/g纤维素酶。

[0086] 实施例7：一种通过提升含水率来提升高浓乙醇发酵效率的方法

[0087] 同实施例4的方法，区别在于，总底物浓度为44%，步骤S6中向灭菌杨木混合料中加入对应44%底物浓度的15FPU/g纤维素酶。

[0088] 实施例8：

[0089] 同实施例4的方法，区别在于，步骤S3中获得的烘料含水率为0%。

[0090] 不同条件下的发酵对比

[0091] 对实施例4～实施例8发酵6至192h时的发酵液采用高效液相色谱法测定发酵液中乙醇浓度，具体结果如表2所示：

[0092] 表2 不同处理组发酵6至192h时发酵液中乙醇浓度（g/L）

[0093]   实施例4 实施例5 实施例6 实施例7 实施例86h 31.94 27.37 27.77 20.24 27.29
12h 46.45 37.69 42.88 33.03 36.08
24h 54.01 47.43 58.89 58.66 48.02
48h 63.91 60.31 67.45 70.41 60.88
72h 69.74 63.02 77.73 79.20 63.34
96h 71.83 63.13 80.68 81.57 64.08
120h 74.85 66.54 80.86 82.13 63.22
144h 73.62 67.56 81.80 84.60 62.95
168h 74.94 69.22 81.76 86.60 62.48
192h 74.57 68.07 80.72 83.41 61.67

[0094] 从表2的结果可以看出，提升烘料含水率后的分批补料同步糖化发酵获得的乙醇浓度有明显提升，0%含水率烘料下乙醇最大浓度为64.08g/L（实施例8），而采用25%含水率烘料最大乙醇浓度到达69.22g/L，浓度提升了8.02%，采用50%含水率烘料乙醇最大浓度到达74.94g/L，浓度提升了16.95%。在50%含水率基础上，将底物浓度提升，38%底物浓度下乙醇最大浓度为81.80g/L，44%底物浓度下乙醇最大浓度达到86.60g/L。可见，按照本发明的方法可有效提升杨木高浓乙醇发酵效率。

[0095] 以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。