一种核壳型噬菌体粉剂及其制备方法和应用

摘要

本发明公开一种核壳型噬菌体粉剂，所述核壳型噬菌体粉剂从内到外依次为核层、壳层和包被层，其中，所述核层为吸附纳米颗粒的噬菌体粉剂颗粒，所述纳米颗粒为硅、硅的氧化物或碳纳米管，所述壳层由海藻酸钠、果胶、卡拉胶、羧甲基纤维素、聚乙烯吡络烷酮中的任意一种或者多种的混合物组成，所述包被层由壳聚糖或海藻糖中的任意一种或两者的混合物组成。本发明的复合噬菌体粉剂有效抵御动物消化道中的胃酸和消化酶的破坏，保证噬菌体靶向动物肠道病原菌，提高有效性并延长作用时间；其中的噬菌体能在动物肠道环境中有效释放，可以有效消灭肠道致病菌及多重耐药菌。

权利要求

1.一种核壳型复合噬菌体粉剂，其特征在于，所述核壳型噬菌体粉剂从内到外依次为核层、壳层和包被层，其中，所述核层为吸附纳米二氧化硅的噬菌体粉剂颗粒，所述壳层由海藻酸钠和羧甲基纤维素的混合物组成；所述包被层为壳聚糖；

所述核壳型噬复合菌体粉剂通过如下方法制备得到：

（1）噬菌体颗粒的制备：噬菌体经扩增培养后，离心获得粗噬菌体裂解液，然后经膜分离过滤，再经过灭菌的水系滤膜过滤，得到对应的噬菌体颗粒，性能检测后备用；

（2）核层的制备：将步骤（1）所得的噬菌体颗粒与纳米二氧化硅在高速下搅拌，完成噬菌体核模板组装，得到噬菌体核模板；

（3）壳层的制备：将步骤（2）得到的噬菌体核模板放置于壳层溶液中，搅拌均匀，将此混合溶液与CaCl2溶液混合，磁力搅拌分散，然后再加入Na2HPO4溶液，继续搅拌反应，整个反应过程避光下进行，得到核壳结构的噬菌体纳米粒悬浮液；

（4）包被层制备：将步骤（3）制得的噬菌体纳米粒悬浮液在磁力搅拌的作用下加入季铵化的包被溶液中，滴加完毕继续搅拌，最后得到抗逆性的噬菌体混合物，低温喷雾干燥后即得核壳型复合噬菌体粉剂。

2.根据权利要求1所述的核壳型复合噬菌体粉剂，其特征在于，步骤（1）中，所述噬菌体

6 9

包括至少一种裂解性噬菌体，总效价为10 10PFU/g。

~

3.根据权利要求2所述的核壳型复合噬菌体粉剂，其特征在于，所述裂解性噬菌体包含大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、肺炎克雷伯噬菌体中的任意一种或几种的组合。

4.根据权利要求1所述的核壳型复合噬菌体粉剂，其特征在于，所述核壳型复合噬菌体粉剂的粒径为8.1±0.9 μm，其中，核层、壳层和包衣层的厚度比例为1‑2:1‑2:1‑2。

5.根据权利要求1所述的核壳型复合噬菌体粉剂，其特征在于，低温喷雾干燥的参数为：蠕动速度 10 20 rpm，温度设为110 120°C，进风口温度22°C，出风口温度65°C。

~ ~

6.根据权利要求1所述的核壳型复合噬菌体粉剂，其特征在于，噬菌体颗粒与纳米二氧化硅按照质量与体积比为 (1 3) g:(1 3) mL的配比混合。

~ ~

7.根据权利要求1所述的核壳型复合噬菌体粉剂，其特征在于，所述壳层溶液为质量浓度为1 5wt%海藻酸钠和羧甲基纤维素的混合物，噬菌体核模板与壳层溶液的质量体积比为~(1 3) g:(1 3) mL。

~ ~

8.根据权利要求1所述的核壳型复合噬菌体粉剂，其特征在于，CaCl2溶液的浓度为20~

50 mM，Na2HPO4溶液的浓度为100~200 mM，噬菌体核模板壳层溶液：CaCl2溶液：Na2HPO4溶液的体积比范围为2 3:1 2:1 2。

~ ~ ~

9.权利要求1‑8任一项所述的核壳型复合噬菌体粉剂在制备用于防治动物肠道致病菌的饲料添加剂的应用。

说明书

一种核壳型噬菌体粉剂及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物药物制剂领域，具体涉及一种抗逆性复合噬菌体粉剂及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 随着抗生素的广泛应用甚至滥用，耐药菌株(包括多耐药菌株)频现，抗生素治疗效果受到严峻的挑战。而且，2020年7月1日起，我国全面禁止在饲料端添加促生长类抗生素，养殖端“限抗、减抗”，全球的最终目标，“2027年实现畜禽类绝对的无抗养殖”，因此，开发新型抗菌产品成为迫在眉睫的社会需求。

[0003] 噬菌体是一种“吃”细菌的纳米级微生物，细菌的天敌，在自然界广泛存在，其不仅是耐药菌，也是多重耐药菌的克星。与抗生素相比，噬菌体的杀菌速度快、专一性强、不影响动物肠道正常菌群以及其抗菌效果不受细菌耐药性的限制等优势，是最有潜力的抗生素替代品。但是噬菌体作为一种具有生物活性的微生物，在运输和储藏过程中对“冷链”依赖极高，目前尚无常温储存技术。而且，口服噬菌体在动物体内消化时易被胃酸、蛋白酶破坏，极易随体液和粪便排出体外，难以发挥有效肠道抗菌及调节肠道微生态的功能，因此，保护和稳定噬菌体便成为临床应用亟待解决的问题，而噬菌体纳米包封技术则是目前最有希望的解决途径。

[0004] 一般噬菌体包被研究是以海藻酸钠‑壳聚糖(大小为780mm)、甲基丙烯酸盐或海藻酸钙(尺寸900μm)为载体材料，但这几种制备方法的包封率低，制备的噬菌体微球为微米级或者毫米级，既不能维持噬菌体活性，也难以满足噬菌体口服给药体系的靶向递送和缓释作用的要求。天然纳米材料广泛存在于自然界中，储存丰富，价格低廉，作为人体中重要的生命物质，可以协助生命体实现许多复杂的生理功能，具有良好的生物兼容性和生物可降解性、良好的耐热稳定性和耐盐性、天然无毒、安全可靠。以纳米材料(碳纳米、果胶、卡拉胶、壳聚糖等)为载体，对益生菌、酵母和疫苗的微生物固定化技术有包埋率高、稳定性好、耐冲击能力强等优点，广泛应用于疫苗及医药行业，但罕见噬菌体的固定化及其应用研究。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种核壳型噬菌体粉剂及其制备方法和应用，通过核壳结构稳定噬菌体空间结构，将噬菌体有效保护起来，减少噬菌体在储存和运输过程中的效价损失，能在常温下长时间保存，实验证明该噬菌体粉剂在常温下保存，在3个月后噬菌体活性仍然保持在85％以上。

[0006] 本发明的另一目的在于，提供一种核壳型噬菌体粉剂，动物口服噬菌体时，有效抵御动物消化道中的胃酸和消化酶的破坏，保证噬菌体靶向动物肠道，延长噬菌体肠道滞留时间，提高稳定性和裂解活性，可以有效抑制大肠杆菌，沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌等致病菌的增殖，可代替饲料中的抗生素添加剂，用于清除畜禽肠道内有害菌。

[0007] 本发明还有一个目的在于，提高噬菌体耐热性能，为噬菌体作为饲料添加剂用于饲料制粒提供关键技术支撑。

[0008] 为实现上述目的，本发明提供了一种核壳型噬菌体粉剂，所述核壳型噬菌体粉剂从内到外依次为核层、壳层和包被层，其中，所述核层为吸附纳米颗粒的噬菌体粉剂颗粒，所述纳米颗粒为硅、硅的氧化物或碳纳米管，优选地，所述纳米颗粒为纳米二氧化硅，所述壳层由海藻酸钠、果胶、卡拉胶、羧甲基纤维素、聚乙烯吡络烷酮中的任意一种或者多种的混合物组成，所述包被层由壳聚糖或海藻糖中的任意一种或两者的混合物组成。

[0009] 其中，噬菌体粉剂包括至少一种裂解性噬菌体，总效价为106‑109PFU/g。

[0010] 所述噬菌体颗粒包含大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、肺炎克雷伯噬菌体中的任意一种或几种的组合。

[0011] 具体地，本发明的噬菌体粉剂包括至少一种裂解型噬菌体，包括但不限于如肠炎沙门氏菌噬菌体CCTCC M 10226、CCTCC M 2014429，鸡白痢沙门氏菌噬菌体CCTCC M 2011042、鼠伤寒沙门氏菌噬菌体CCTCC M 2014433、德尔卑沙门氏菌噬菌体CCTCC M 
2014431、伦敦沙门氏菌噬菌体CCTCC M 2014432、大肠杆菌噬菌体CCTCC M217190、肺炎克雷伯氏菌CCTCC NO:M2015760。上述噬菌体是杀菌效果较好的优选噬菌体，在实际应用中，根据不同养殖场的致病菌情况，选用对应的复配噬菌体使用，发挥高效杀菌效果。

[0012] 其中，所述核壳型噬菌体粉剂的粒径为8.1±0.9μm，其中，核层、壳层和包衣层的厚度比例为1‑2:1‑2:1‑2。

[0013] 本发明进一步提出了上述核壳型复合噬菌体粉剂的制备方法，包括如下步骤：

[0014] (1)噬菌体颗粒的制备：对于每一种裂解性噬菌体，经扩增培养后，离心获得粗噬菌体裂解液，然后膜分离过滤，优选地，经过100～150kDa切向流超滤系统分离，再经过灭菌的水系滤膜过滤，优选地，经0.22μm的灭菌的水系滤膜过滤，得到对应的噬菌体颗粒，进行性能检测，即测定噬菌体效价及有无污染后备用；

[0015] (2)核层的制备：将步骤(1)所得的噬菌体颗粒与纳米二氧化硅在高速下搅拌，优选地，搅拌速率为1000～1400rpm/min，完成噬菌体核模板组装，得到噬菌体核模板；

[0016] (3)壳层的制备：将步骤(2)得到的噬菌体核模板放置于壳层溶液中，搅拌均匀，将此混合溶液与CaCl2溶液混合，磁力搅拌分散，然后再加入Na2HPO4溶液，继续搅拌反应，整个反应过程避光下进行，得到核壳结构的噬菌体纳米粒悬浮液；优选地，将步骤(2)得到的100～300mL噬菌体核模板放置于壳层溶液中，搅拌均匀，将此混合溶液与200～400mL 20～50mM CaCl2溶液混合，磁力搅拌分散，优选地，搅拌速率为800～1200rpm，然后再加入200～
400mL 100～200mM Na2HPO4溶液，继续搅拌反应10～24h，整个反应过程避光下进行，得到核壳结构的噬菌体纳米粒悬浮液；

[0017] (4)包被层制备：将步骤(3)制得的噬菌体纳米粒悬浮液在磁力搅拌的作用下加入季铵化的包被溶液中，滴加完毕继续搅拌，最后得到抗逆性的噬菌体混合物，低温喷雾干燥后即得核壳型噬菌体粉剂。

[0018] 优选地，将步骤(3)制得的600～2000mL噬菌体纳米粒悬浮液在800～1200rpm磁力搅拌的作用下加入到600～2000mL 2～4mg/mL的季铵化的包被溶液中，滴加速率为5～10mL/min，滴加完毕继续搅拌30～60min，最后得到抗逆性的噬菌体混合物，低温喷雾干燥后即得核壳型噬菌体粉剂。

[0019] 具体地，低温喷雾干燥的参数为：蠕动速度10～20rpm，温度设为110～120℃，进风口温度22℃，出风口温度65℃。

[0020] 噬菌体颗粒与纳米二氧化硅按照体积与质量比(1～3)g:(1～3)mL的配比混合。

[0021] 所述壳层溶液为质量浓度为1～2wt％的海藻酸钠、果胶、卡拉胶、羧甲基纤维素、聚乙烯吡络烷酮的任意一种或者两种或多种混合物，噬菌体核模板与壳层溶液的质量体积比为(1～3)g:(1～3)mL。

[0022] CaCl2溶液的浓度为20～50mM，Na2HPO4溶液的浓度为100～200mM，噬菌体核模板：壳层溶液：CaCl2溶液：Na2HPO4溶液的体积用量比范围为2～3:1～2:1～2。

[0023] 本发明进一步提出了上述核壳型复合噬菌体粉剂在作为饲料添加剂用于防治动物肠道致病菌中的应用。

[0024] 利用本发明制备的核壳型噬菌体粉剂的，在常温下储存期3个月且噬菌体活性保持在85％以上，且耐85℃高温且噬菌体活性保持在90％以上、耐0.3％胆盐且噬菌体活性损失7％以内、耐pH2.0胃酸1h且噬菌体活性60％以上。

[0025] 有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

[0026] (1)本发明所述的复合噬菌体粉剂中的载体材料均天然、安全无毒，生物相容性好，保护噬菌体活性；

[0027] (2)本发明所述的复合噬菌体粉剂通过核壳结构稳定噬菌体空间结构，将噬菌体有效保护起来，减少噬菌体在储存和运输过程中的效价损失；

[0028] (3)本发明所述的复合噬菌体粉剂有效抵御动物消化道中的胃酸和消化酶的破坏，保证噬菌体靶向动物肠道病原菌，提高有效性并延长作用时间；

[0029] (4)本发明所述的复合噬菌体粉剂中的噬菌体能在动物肠道环境中有效释放；

[0030] (5)本发明所述的复合噬菌体粉剂可以有效消灭肠道致病菌及多重耐药菌。

附图说明

[0031] 图1为噬菌体复合粉剂产品图；

[0032] 图2为粉剂中噬菌体的稳定性测试结果图；

[0033] 图3为噬菌体粉剂在模拟胆盐中的活性结果图。

具体实施方式

[0034] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

[0035] 下述实施例中SM缓冲液的配制方法为：NaCl 5.8g，MgSO4·7H2O 2g，1mol/L的Tris·HCl 50mL(pH＝7.0)，5mL 2％gelatin，加入ddH2O补足至1000mL。

[0036] 模拟胃液的配制方法为：称取2.0g NaCl、3.2g胃蛋白酶，量取7mL浓盐酸，双蒸水定容于1000mL，pH约为1.2。

[0037] 模拟肠液的配制方法为：将6.8g KH2PO4溶于250mL双蒸水，振荡，完全溶解后加190mL 0.2mol/L NaOH和400mL的双蒸水。加胰蛋白酶10.0g，混匀，用0.2mol/L NaOH调pH到
7.5±0.1，双蒸水定容于1000mL。

[0038] 0.3％胆盐的配制方法为：取0.3g胆盐，加入到100mL PBS(pH6.8)。

[0039] 本发明所用的裂解性噬菌体具体信息如下：

[0040] 大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_C1，由ZL201710540832.6公开，保藏号为CTCC NO:M2017190；

[0041] 沙门氏菌噬菌体PSA‑6，由ZL201010508259.9公开，保藏号为CCTCC NO:M2010226；

[0042] 鸡白痢沙门氏菌噬菌体PSPu‑4‑116，由ZL201110053518.8公开，保藏号为CCTCC NO:M2011042；

[0043] 肠炎沙门氏菌噬菌体JN54KDE，由ZL201410717164.6公开，保藏号为CCTCC NO:M2014429；

[0044] 鼠伤寒沙门氏菌噬菌体JX178，由ZL201410717164.6公开，保藏号为CCTCC NO:M2014433；

[0045] 德尔卑沙门氏菌噬菌体JX067‑2，由ZL201410717164.6公开，保藏号为CCTCC NO:M2014431；

[0046] 伦敦沙门氏菌噬菌体JSD9，由ZL201410717164.6公开，保藏号为CCTCC NO:M2014432。

[0047] 肺炎克雷伯氏菌vB_KpnM_he1,由ZL201611072115公开，保藏号为CCTCC NO:M2015760；

[0048] 这些裂解性噬菌体均在中国典型培养物保藏中心保藏。上述噬菌体的选择可以根据具体致病菌进行合理选择。

[0049] 实施例1抗逆性噬菌体粉剂的制备方法。

[0050] (1)无毒裂解性噬菌体溶液制备：利用液体培养基用5L发酵罐扩增裂解性噬菌体CTCC No:M 2010226和CTCC No:M 2014429，将宿主菌ATCC13076和SM‑54‑KDE分别转接至含3L灭菌LB培养基的发酵罐中培养4‑6h，达到对数生长期时，以MOI(复染指数)为0.01的比例
9
分别加入噬菌体溶液PSA‑6和JN54KDE(效价为10 PFU/mL)，37℃培养6h，直到溶液变澄清，
12 000rpm，4℃离心10min，收集上清液，即为粗噬菌体裂解液；然后，经过100‑150kDa切向流超滤系统，以SM溶液置换，过滤去除细菌碎片和细菌代谢物以及培养基，最后经过灭菌
0.22μm水系滤膜过滤，得到精纯噬菌体颗粒；

[0051] (2)复合噬菌体颗粒制备：在无菌条件下，将制备的多种无毒的裂解性噬菌体颗粒按照等体积比例混合均匀，过滤除菌后得到复合噬菌体颗粒，然后进行性能检测，检测效价并确认无污染后备用；

[0052] (3)核层：称取30g纳米二氧化硅，在匀速机械搅拌下，按照1:3(M/V＝g/mL)的比例均匀的喷涂步骤(2)所得复合噬菌体颗粒，得到噬菌体核模板组装；

[0053] (4)壳层：将此噬菌体核模板与50mL 2％羧甲基纤维素和海藻酸钠溶液中，不断搅拌1h，将此混合溶液用单通道注射泵以30m/h的速率滴加入终浓度为0.02mol/LCaCl2溶液中，然后以相同的速率加入200mL 0.15mol/L的Na2HPO4溶液，继续搅拌20h，整个反应过程避光下进行，待溶液温度降至室温后，在10000r/min离心10min，沉淀水洗3次，然后用30mL去离子水在超声粉剂碎机中再分散，得到核壳结构的噬菌体纳米粒悬浮液，将上述制得的噬菌体悬浊液在磁力搅拌的作用下逐滴加入到2mg/mL的600mL季铵化壳聚糖溶液中，滴加完毕继续搅拌30min；

[0054] (5)干燥：采用低温喷雾干燥，蠕动速度10rpm，温度设为110℃，进风口温度22℃，出风口温度65℃，得到抗逆性噬菌体复合粉剂；

[0055] (6)效价测定：取2g抗逆性噬菌体粉剂粉剂剂溶解于模拟肠液中，37℃ 180rpm震荡6h，在4℃ 10000r/min离心10min，取上清测定噬菌体效价。

[0056] 结果如图1所示，通过上述方法制备获得白色噬菌体粉剂，颗粒分布均匀、外观细8
腻，其每克粉剂中噬菌体效价为1×10 PFU/g。通过蔡司氦离子显微镜(Orion NanoFab)测定噬菌体粉末的粒径，首先将噬菌体粉末均匀放在样品短管的碳管上，去除多余部分，然后+
对微粒进行不同角度横截面铣削切割，此过程使用Ne 束、10kV加速电压、约为20pA的离子+
电流，最后，横截面成像使用He 束、33kV加速电压、0.20pA的电流。在铣削和成像过程中都使用泛光枪电荷补偿。经测定，粉剂颗粒粒径为8.1±0.9μm。

[0057] 实施例2噬菌体粉剂的制备

[0058] 将1000mL 109PFU/mL噬菌体PSA‑6与30g纳米SiO2高速下充分搅拌1h，使其分散均匀，制备噬菌体核模板。将此噬菌体核模板与100mL 2％羧甲基纤维素和海藻酸钠溶液，不断搅拌1h，将此混合溶液用射单通道注泵以30m/h的速率滴加入终浓度为0.05mol/L CaCl2溶液中，然后以相同的速率加入200mL 0.30mol/L的Na2HPO4溶液，继续搅拌20h，将上述制得的噬菌体悬浊液在磁力搅拌的作用下逐滴加入到2mg/mL的600mL季铵化壳聚糖溶液中，滴加完毕继续搅拌30min。采用低温喷雾干燥，参数设计为：蠕动速度20rpm，温度设为115℃，进风口温度22℃，出风口温度65℃，经过喷雾干燥得到抗逆性噬菌体复合粉剂。

[0059] 实施例3噬菌体粉剂的制备

[0060] 将1000mL 109PFU/mL噬菌体PSA‑6与30g纳米SiO2充分搅拌1h，使其分散均匀，制备噬菌体核模板。将此噬菌体核模板与100mL 2％羧甲基纤维素、海藻酸钠和聚乙烯吡络烷酮溶液，不断搅拌1h，将此混合溶液用射单通道注泵以30m/h的速率滴加入终浓度为0.05mol/L CaCl2溶液中，然后以相同的速率加入200mL 0.30mol/L的Na2HPO4溶液，继续搅拌20h，将上述制得的噬菌体悬浊液在磁力搅拌的作用下逐滴加入到2mg/mL的600mL季铵化壳聚糖溶液中，滴加完毕继续搅拌30min。采用低温喷雾干燥，蠕动速度20rpm，温度设为115℃，进风口温度22℃，出风口温度65℃，经过喷雾干燥得到抗逆性噬菌体复合粉剂。

[0061] 采用实施例1制备的抗逆性噬菌体复合粉剂进行以下性能测定。

[0062] 实施例4：制备的抗逆性噬菌体复合粉剂的保存稳定性测定。

[0063] 将制备好的三个不同批次的抗逆性噬菌体复合粉剂分装于无菌离心管中，置于4℃或常温保存，每月抽取适量样本，检测粉剂中的噬菌体存活率。

[0064] 结果如图2所示，噬菌体复合粉剂4℃和常温中保存3个月，效价从1×108PFU/g分7 7
别下降到8.8×10PFU/g和8.6×10PFU/g，但是噬菌体活性仍然保持在85％以上。

[0065] 实施例5：制备的抗逆性噬菌体复合粉剂在模拟胃液和模拟肠液中的抗逆性和稳定性测定。

[0066] 将上述抗逆性噬菌体复合粉剂2.0g，分别在40mL不同pH值(2.0,2.5,3.0)的模拟胃液中，37℃，180r/min振荡1h后，10000rpm离心5min，弃掉模拟胃液并将样品转移至40mL模拟肠液中重悬振荡，使噬菌体复合粉剂全部释放，然后检测模拟肠液中噬菌体效价，并以同等效价的游离噬菌体做对照。

[0067] 表1噬菌体复合粉剂与游离噬菌体在模拟胃液和模拟肠液中的存活率(％)[0068]

[0069] 结果如表1所示，本发明提供的噬菌体复合粉剂对噬菌体活性进行了保护，即使在模拟胃酸中处理长达1h，噬菌体的存活率仍在60％以上，与游离噬菌体组相比，显著提高了噬菌体的抗逆性。

[0070] 实施例6：制备的抗逆性噬菌体复合粉剂耐胆盐的稳定性测定。

[0071] 取2.0g上述抗逆性噬菌体复合粉剂或者同效价的游离噬菌体置于40mL模拟胆盐浓度为0.3％(w/v)的PBS(pH 6.8)缓冲液中，37℃，180r/min振荡2h后弃掉模拟胆盐，并将样品于40mL模拟肠液中振荡，使噬菌体复合粉剂全部释放，然后检测模拟胆盐和模拟肠液中噬菌体效价，计算损失的噬菌体效价，并以游离噬菌体做对照。

[0072] 结果如图3所示，噬菌体复合粉剂和游离噬菌体中噬菌体效价从1×108PFU/g分别7 7
下降到9.24×10PFU/g和8.15×10PFU/g，噬菌体活性损失7％以内。

[0073] 实施例7：制备的抗逆性噬菌体复合粉剂作为饲料添加剂在肉鸡体内胃肠道停留时间测定。

[0074] 将1日龄AA肉鸡，随机分为2组，噬菌体复合粉剂组(EBp)和游离噬菌体(对应复合粉剂中相同效价的多种噬菌体的混合)灌胃组(Bp)，每组30只。实验前禁食12h，自由饮水。8
每只鸡口服噬菌体复合粉剂2g或灌胃噬菌体悬液1mL，剂量均为1×10 PFU/只。给噬菌体后
24h、48h、72h、96h和120h，收集粪便，并从每组中随机取5只鸡处死，解剖后取出肠道，收集内容物，用10倍缓冲液重悬，漩涡振荡器混匀后，检测样品中的噬菌体。

[0075] 表2噬菌体复合粉剂与游离噬菌体在胃肠道留存时间

[0076]

[0077] 结果如表2所示，与游离噬菌体相比，噬菌体复合粉剂在肉鸡胃肠道内停留时间延长，小肠和大肠内的停留时间以及排出时间均延长1d，如此可以给噬菌体提供更多防御致病菌的时间和机会。

[0078] 实施例8：制备的抗逆性复合噬菌体粉剂在肉鸡体内抗沙门氏菌感染测定。

[0079] 将90只1日龄AA肉鸡，随机分为3组，无噬菌体对照组(Con)、噬菌体复合粉剂治疗组(EBp)、游离噬菌体组(NBp)，每组30只。实验前禁食12h，自由饮水。在0h每只鸡口服攻毒8
肠炎沙门氏菌0.5mL 2×10 CFU，攻毒后，噬菌体复合粉剂治疗组(EBp)立即口服2g制备的
8
噬菌体复合粉剂，噬菌体剂量为1×10PFU/只，游离噬菌体组(NBp)立即灌服1mL游离噬菌
8
体，剂量为1×10PFU/只，对照组灌服1mLSM溶液。攻毒后观察并测定粪样中攻毒沙门氏菌的数量。

[0080] 结果显示：使用噬菌体复合粉剂和游离噬菌体治疗后，可在24h内恢复雏鸡的状态；而且，噬菌体复合粉剂治疗组(EBp)减轻鸡只腹泻症状，粪样中沙门噬菌体的数量低于对照组和游离噬菌体组(NBp)，表明该噬菌体复合粉剂可以作为饲料添加剂用于防治动物肠道致病菌。

[0081] 本发明提供了一种核壳型复合噬菌体粉剂的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。