瑞香狼毒中的没药烷型倍半萜类化合物及其应用

摘要

瑞香狼毒中的没药烷型倍半萜类化合物及其应用，属于医药技术领域，具体公开了从植物瑞香狼毒中制备的新没药烷型倍半萜类化合物及其该化合物在治疗神经炎症引起的神经退行性疾病的药物中的应用。本发明所述的化合物通过乙醇提取、乙酸乙酯萃取、经硅胶柱色谱、HP‑20柱和ODS开放柱色谱、经硅胶柱色谱、制备型高效液相分离得到。本发明的化合物及其含有该化合物的组合物具有抑制神经炎症作用，用于制备抗神经炎症药物。#imgabs0#

权利要求

1.一种瑞香狼毒中的没药烷型倍半萜类化合物或其在药学上可接受的盐，其特征在于，所述的没药烷型倍半萜类化合物为：

2.权利要求1所述的没药烷型倍半萜类化合物或其在药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述的没药烷型倍半萜类化合物的制备方法包括如下步骤：(1)取干燥的瑞香狼毒根以乙醇提取，合并提取液浓缩得浸膏，浸膏采用乙酸乙酯萃取并将所得馏分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷‑甲醇按体积比100:0–0:100进行梯度洗脱，共收集到6个馏分，标记为Fr.A–Fr.F；

(2)馏分Fr.B经HP‑20柱和ODS开放柱色谱，分别以甲醇‑水按体积比10:90–90:10进行梯度洗脱，得4个馏分Fr.B1–Fr.B4；

(3)馏分Fr.B3经硅胶柱色谱以石油醚‑二氯甲烷按体积比50:1–1:1在TLC分析的基础上得到4个亚馏分Fr.B3a–Fr.B3d；

(4)在制备型反相高效液相色谱上使用甲醇‑水的流动相来分离Fr.B3b分别得到化合物1和化合物2。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的瑞香狼毒为瑞香科(Thymelaeaceae)狼毒属(Stellera Linn.)植物瑞香狼毒(Stellerachamaejasme L.)。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，乙醇为70‑80％工业乙醇，所述提取为乙醇回流提取，提取2‑3次，每次2‑4小时。

5.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的没药烷型倍半萜类化合物、该化合物在药学上可接受的盐、药学上可接受的赋形剂或/和载体。

6.权利要求1所述的没药烷型倍半萜类化合物或其在药学上可接受的盐的应用，其特征在于，在制备治疗神经炎症引起的神经退行性疾病的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，在制备抑制LPS诱导的BV‑2细胞炎症药物中的应用。

8.一种瑞香狼毒根提取物，其特征在于，所述瑞香狼毒根提取物包含权利要求1所述的没药烷型倍半萜类化合物。

9.权利要求8所述的一种瑞香狼毒根提取物的应用，其特征在于，在制备治疗神经炎症引起的神经退行性疾病的药物中的应用。

说明书

瑞香狼毒中的没药烷型倍半萜类化合物及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及从植物瑞香狼毒中制备的的新没药烷型倍半萜类化合物和这类化合物在神经治疗神经退行性疾病方面的应用。

背景技术

[0002] 瑞香狼毒(Stellerachamaejasme L.)是瑞香科(Thymelaeaceae)狼毒属多年生草本植物。狼毒属植物在全世界共有10–12种，在我国仅有2种。其中，瑞香狼毒是该属的代表性植物，同时也是中药狼毒之正品，有泻水逐饮，破积杀虫的功效。瑞香狼毒的研究表明其含有多种化学成分，包含瑞香烷型二萜、倍半萜、黄酮、木脂素和香豆素等化合物，有抗肿瘤、抗炎、抗HIV、抗菌、杀虫、抗惊厥和免疫调节等作用。

[0003] 炎症(inflammation)：机体对于刺激的一种防御反应，表现为红、肿、热、痛和功能障碍。炎症分为两类，可以是感染引起的感染性炎症，也可以不是由于感染引起的非感染性炎症。例如对人体自身组织的攻击、发生在透明组织的炎症等等。

[0004] 神经退行性疾病(Neurodegenerative diseases)与炎症：神经退行性疾病是由于大脑和脊髓的神经元丧失而引起的一类不可逆转的神经系统疾病，特征表现为发作迟缓和选择性神经元的功能障碍。大脑中的慢性炎症环境是阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病的标志。许多证据都表明炎症在神经退行性疾病的发生中占有重要的地位。固有免疫系统是在种系发育和进化过程中形成的天然免疫防御功能。与机体另一种特异性免疫应答相比，它能对各种有害物质进行迅速的反应，以保护机体。固有免疫系统本身的激活是一把双刃剑。有害物质(如聚集形式的Aβ)长期和不可控制的刺激，启动固有免疫系统，就会产生对大脑的损害作用。

发明内容

[0005] 本发明提供2种从瑞香科(Thymelaeaceae)狼毒属(Stellera Linn.)植物瑞香狼毒(Stellerachamaejasme L.)中提取分离得到的新没药烷型倍半萜类化合物或其在药学上可接受的盐。

[0006] 所述没药烷型倍半萜类化合物为：

[0007]

[0008] 所述的在药学上可接受的盐为所述没药烷型倍半萜类化合物与酸所形成的盐；所述的酸包括盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸、乙酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果树、苯甲酸、苯磺酸。

[0009] 本发明所述的没药烷型倍半萜类化合物的制备包括如下步骤：

[0010] (1)取干燥的瑞香狼毒根以乙醇提取，合并提取液浓缩得浸膏，浸膏采用乙酸乙酯萃取并将所得馏分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷‑甲醇按体积比100:0–0:100进行梯度洗脱，共收集到6个馏分，标记为Fr.A–Fr.F；

[0011] (2)馏分Fr.B经HP‑20柱和ODS开放柱色谱，分别以甲醇‑水按体积比10:90–90:10进行梯度洗脱，得4个馏分Fr.B1–Fr.B4；

[0012] (3)馏分Fr.B3经硅胶柱色谱以石油醚‑二氯甲烷按体积比50:1–1:1在TLC分析的基础上得到4个亚馏分Fr.B3a–Fr.B3d；

[0013] (4)在制备型反相高效液相色谱上使用甲醇‑水的流动相来分离Fr.B3b分别得到化合物1和化合物2。

[0014] 其中，所述步骤(1)中所述的瑞香狼毒为瑞香科(Thymelaeaceae)狼毒属(Stellera Linn.)植物瑞香狼毒(Stellerachamaejasme L.)。

[0015] 所述步骤(1)中，乙醇为70‑80％工业乙醇，所述提取为乙醇回流提取，提取2‑3次，每次2‑4小时。

[0016] 对所述化合物1‑2进行系统结构鉴定结果如下，对应谱图如图1‑15所示：

[0017] 利用高分辨质谱，一维NMR、二维NMR及计算ECD技术对化合物1–2的结构鉴定。

[0018] Stellerasespene A(1):淡黄色油状物(甲醇)。易溶于二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇+溶剂中，5％香草醛硫酸显紫色。HRESIMS给出准分子离子峰[M+Na]m/z 273.1460(calcd for C15H22O3Na,273.1461)，同时结合1D NMR和HSQC核磁数据推测该化合物的分子式为C15H22O3，不饱和度为5。

[0019] 1H‑NMR(600MHz,DMSO‑d6)谱中，δH 7.22(1H,m,H‑2),6.99(1H,d,J＝7.3Hz,H‑4),7.16(1H,t,J＝7.5Hz,H‑5),7.21(1H,m,H‑6)推测是一组1,3‑二取代的苯环质子信号；δH 
4.21(1H,dtd,J＝7.2,3.6,1.9Hz,H‑9),3.70(1H,d,J＝3.6Hz,H‑10)推测为两个连氧碳上的质子信号；δH 2.10(1H,dd,J＝12.9,1.9Hz,H‑8β),1.92(1H,dd,J＝12.9,7.2Hz,H‑8α)推测为一组磁不等同亚甲基的质子信号；δH 2.28(3H,s,H‑15),1.53(3H,s,H‑14),1.13(3H,s,H‑12)和1.04(3H,s,H‑13)推测是四个甲基的质子信号；13C‑NMR(150MHz,DMSO‑d6)中，给出15个碳信号，其中，低场区有6个碳信号，δC 149.0(C‑1),137.1(C‑3),128.1(C‑5),127.0(C‑4),125.4(C‑2),121.9(C‑6)推测是一组苯环的碳信号；高场区δC 92.9(C‑10),84.0(C‑
7),72.1(C‑9),70.3(C‑11)推测为四个连氧碳的碳信号,δC 29.3(C‑14),27.4(C‑13),25.9(C‑12),21.7(C‑15)推测为四个甲基的碳信号。通过HSQC谱图对碳和氢的信号进行归属。

[0020] 在HMBC谱图中，H‑4(δH 6.99)与C‑2(δC 125.4)有相关，H‑5(δH 7.16)与C‑1(δC 149.4),C‑3(δC 137.1)有相关，H‑6(δH 7.21)与C‑2(δC125.4),C‑4(δC 127.0)有相关，H‑15(δH 6.99)与C‑2(δC 125.4),C‑3(δC 137.1),C‑4(δC 127.0)有相关，因此推测有一个3‑甲基苯基片段；H‑14(δH 1.53)与C‑7(δC 84.0),C‑8(δC 49.2)有相关，H‑8(δH 2.10)与C‑10(δC 
92.9)有相关，9‑OH(δH 4.94)与C‑8(δC 49.2),C‑9(δC 72.1),C‑10(δC92.9)有相关，H‑10(δH 
3.70)与C‑7(δC 84.0)有相关，H‑12(δH 1.04)/H‑13(δH 1.13)与C‑10(δC 92.9),C‑11(δC 
70.3)有相关，11‑OH(δH 4.15)与C‑11(δC 70.3),C‑12(δC 25.9),C‑13(δC 27.4)有相关，因此推测有片段B；H‑2(δH 7.22)/H‑6(δH7.21)与C‑7(δC 84.0)有相关，H‑8(δH 1.92)/H‑14(δH 
1.53)与C‑1(δC 149.4)有相关，推测片段B通过C‑1‑C‑7与片段A相连。由以上信息建立该化合物的平面结构。

[0021] 该化合物的相对构型是通过NOESY谱图确定的。H‑10(δH 3.70)与H3‑14(δH 1.53),9‑OH(δH 4.94)有相关，H‑9(δH 4.21)与H3‑12(δH 1.04),H3‑13(δH1.13)有相关，推测该化合物的相对构型为7R*,9S*,10S*。

[0022] 化合物1的绝对构型是通过计算ECD与实测ECD进行比较确定的。化合物1的实测ECD图与7R,9S,10S‑1的计算ECD图表现出较好的拟合性，因此，化合物1的绝对构型为7R,9S,10S。

[0023] 通过以上信息，确定了该化合物的结构，将其命名为Stellerasespene A。

[0024] 化合物1的1H(600MHz)与13C(150MHz)NMR数据(DMSO‑d6)

[0025]

[0026] Stellerasespene B(2):淡黄色油状物(二氯甲烷)，易溶于甲醇，二氯甲烷、乙酸+乙酯、甲醇溶剂。5％香草醛显蓝色。HRESIMS给出准分子离子峰[M+H]m/z 233.1536(calcd 
1 13
for C15H21O2,233.1536)，结合H‑NMR, C‑NMR以及HSQC谱图推测其分子式为C15H21O2，计算不饱和度为6。

[0027] 1H‑NMR(400MHz,CDCl3)中，δH 4.77(1H,t,J＝1.3Hz,H‑12a),4.75(1H,br s,H‑12b)推测为一组末端双键上的氢信号，δH 2.73(1H,dt,J＝13.2,3.1Hz,H‑9α),1.26(1H,td,J＝13.2,3.6Hz,H‑9β),2.20(1H,d,J＝18.9Hz,H‑2α),2.46(1H,d,J＝18.9Hz,H‑2β)推测为两组磁不等同亚甲基的氢信号，δH2.04(3H,s,H‑14),1.78(3H,s,H‑15),1.73(3H,s,H‑
13
13)推测为三个甲基的氢信号。C‑NMR(100MHz,CDCl3)显示15个碳信号，低场区显示出6个碳信号，包括δC 207.7(C‑10),206.3(C‑3),173.4(C‑5),148.1(C‑11),136.5(C‑4),110.1(C‑12)，推测有两个酮羰基碳信号和两组双键碳信号，其中包括一组末端双键的碳信号，高场区δC 25.4(C‑14),20.6(C‑13),8.2(C‑15)为三个甲基碳信号。通过HSQC谱将全部碳氢直接相关信号进行了全归属。

[0028] 在HMBC谱中，H2‑2(δH 2.46,2.20)与C‑1(δC 58.6),C‑3(δC 206.3),C‑5(δC 173.4)有相关，H3‑15(δH 1.78)与C‑3(δC 206.3),C‑4(δC 136.5),C‑5(δC 173.4)有相关，得到片段A。H‑6(δH2.87)与C‑8(δC 28.8)有相关，H‑8(δH1.80)与C‑1(δC 58.6)有相关，H‑9(δH 1.26)与C‑1(δC58.6),C‑8(δC 28.8)有相关，H‑12(δH 4.75)与C‑7(δC 46.1),C‑11(δC 
148.1),C‑13(δC 20.6)有相关，H3‑13(δH 1.73)与C‑7(δC 46.1),C‑11(δC 148.1),C‑12(δC 
110.1)有相关，且H‑6(δH 2.87)与C‑4(δC 136.5)的相关峰以及H2‑2(δH 2.46,2.20)与C‑9(δC 35.4)，表明片段A和B是通过C‑1‑C‑5骈合起来的。H3‑14(δH 2.04)与C‑1(δC 58.6),C‑
10(δC 207.7)有相关，H2‑2(δH 2.46,2.20)/H‑9(δH 1.26)与C‑10(δC 207.7)有相关，推测C‑
1位连有一个乙酰基。据以上相关信息建立了化合物2的平面结构，化合物2为一个倍半萜类化合物。

[0029] 由于NOESY谱中缺乏有价值的相关信号，该化合物的相对构型是通过计算核磁确定的。两种可能的立体异构体(1R*,7R*)‑2a和(1S*,7R*)‑2b在mPW1PW91/6‑311+G(d,p)//B3LYP6‑31G(d)的水平下进行量子化学计算，并用线性相关分析和DP4+分析来确定其可能2
的相对构型。由计算可知，两种立体异构体的线性回归方程对应的R 分别为0.9995和
0.9986,同时，DP4+统计分析给出(1R*,7R*)‑2a的可能性为100％，因而推测该化合物的相对构型为1R*,7R*。

[0030] 该化合物的绝对构型是通过计算ECD与实测ECD比较得到的。实测ECD与(1R,7R)‑2的计算ECD的谱图表现出高度的一致性，因此推测该化合物的绝对构型是1R,7R。

[0031] 通过以上信息，确定了该化合物的结构，将其命名为stellerasespene B。

[0032] 化合物2的1H(400MHz)与13C(100MHz)NMR数据(CDCl3)

[0033]

[0034] 本发明还提供一种药物组合物，包括所述的没药烷型倍半萜类化合物、该化合物在药学上可接受的盐、药学上可接受的赋形剂或/和载体。

[0035] 本发明还提供瑞香狼毒根提取物在治疗神经炎症引起的神经退行性疾病的药物中的应用。

[0036] 本发明还提供所述没药烷型倍半萜类化合物或其在药学上可接受的盐在治疗神经炎症引起的神经退行性疾病的药物中的应用。

[0037] 对本发明提供的2个新的没药烷型倍半萜类化合物进行了抗神经炎症作用的考察。体外细胞测试的模型为脂多糖(LPS)诱导的小鼠小胶质细胞BV‑2细胞。结果显示所述化合物对LPS诱导的炎症反应均有显著的抑制作用。

[0038] 本发明的优点：

[0039] 本发明提供的没药烷型倍半萜类化合物为新化合物，结构新颖，且均为立体构型确定的光学纯化合物，同时其神经细胞保护活性强，具有进一步开发的价值。

附图说明

[0040] 图1为本发明的化合物1的UV谱；

[0041] 图2为本发明的化合物1的HR‑ESIMS谱；

[0042] 图3为本发明的化合物1的CD谱；

[0043] 图4为本发明的化合物1的1H‑NMR谱(600MHz,DMSO‑d6)；

[0044] 图5为本发明的化合物1的13C‑NMR谱(150MHz,DMSO‑d6)；

[0045] 图6为本发明的化合物1的HSQC谱(600MHz,DMSO‑d6)；

[0046] 图7为本发明的化合物1的HMBC谱(600MHz,DMSO‑d6)；

[0047] 图8为本发明的化合物1的NOESY谱(600MHz,DMSO‑d6)；

[0048] 图9为本发明的化合物2的UV谱；

[0049] 图10为本发明的化合物2的HR‑ESIMS谱；

[0050] 图11为本发明的化合物2的CD谱；

[0051] 图12为本发明的化合物2的1H‑NMR谱(400MHz,DMSO)；

[0052] 图13为本发明的化合物2的13C‑NMR谱(100MHz,DMSO)；

[0053] 图14为本发明的化合物2的HSQC谱(600MHz,DMSO)；

[0054] 图15为本发明的化合物2的HMBC谱(600MHz,DMSO)。

具体实施方式

[0055] 实施例1：本发明所述化合物1‑2的制备，具体包括以下步骤：

[0056] (1)取干燥的瑞香狼毒根(50.0kg)以70％乙醇回流提取2次，每次回流2‑4h，合并提取液浓缩得浸膏，浸膏采用乙酸乙酯萃取并将所得馏分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷‑甲醇按100:0,50:1,30:1,20:1,10:1,5:1,3:1,1:1,0:100v/v进行梯度洗脱，共收集到6个馏分Fr.A–Fr.F。

[0057] (2)馏分Fr.B经HP‑20柱和ODS开放柱色谱，以甲醇‑水按10:90,30:70,50:50,70:30,90:10v/v进行梯度洗脱，得4个馏分Fr.B1–Fr.B4。

[0058] (3)馏分Fr.B3经硅胶柱色谱，以石油醚‑二氯甲烷按50:1,30:1,20:1,10:1,5:1,3:1,1:1v/v在TLC分析的基础上得到4个亚馏分Fr.B3a‑Fr.B3d。

[0059] (4)在制备型反相高效液相色谱上使用甲醇‑水85:15v/v的流动相来分离Fr.B3b得到了化合物1(7.0mg)和化合物2(20.1mg)。

[0060] 实施例2

[0061] 化合物1‑2在体外抑制LPS诱导的小鼠小胶质细胞BV‑2细胞炎症作用的考察。

[0062] 用Griess法检测LPS诱导的BV‑2细胞内的NO产物含量。BV‑2细胞系置于含10％胎牛血清以及1％双抗的DMEM培养基内，37℃，5％CO2的培养箱中进行培养。稳定传代培养至3
对数生长的细胞用于实验。取对数生长期的BV‑2小胶质瘤细胞以5×10 个/孔的密度接种于96孔板中，待细胞生长至60％时加入10μM的受试化合物，共培养1h后观察细胞生长状态良好，加入10μg/mL的LPS，24h后取上清液用NO试剂盒检测NO浓度。利用紫外分光光度计(Thermo Scientific Multiskan MK3，上海，中国)在540nm处测定吸光度。结果显示，化合物1和2表现出比阳性药米诺环素更好的抗炎作用。

[0063]Comp. NO产物(μM)
1 0.7±0.01***
2 1.1±0.08**
Mino 1.5±0.31**
###
LPS 5.2±0.02

[0064] 对照组相比于模型组的NO产物浓度###P<0.001；实验组相比于模型组的NO产物浓度*P<0.1,**P<0.05,***P<0.001。