一种靶向甲型流感病毒保守线性B细胞表位的广谱单克隆抗体及其应用

摘要

本发明公开了一种靶向甲型流感病毒保守线性B细胞表位的广谱单克隆抗体及其应用。所述的单克隆抗体命名为5F10，是由杂交瘤细胞株CCTCC NO:C2022152产生。该单克隆抗体能够特异识别并广谱结合不同株甲型流感病毒的NP蛋白，与禽、猪、人源的多种亚型的甲型流感病毒均具有良好反应性。该单克隆抗体靶向NP蛋白第81～85位氨基酸的线性B细胞抗原表位，且该抗原表位在甲型流感病毒中高度保守。该单克隆抗体可以很好地应用于免疫荧光、Western blot、免疫沉淀、免疫组化等试验，为NP蛋白结构、功能的实验研究和临床样本中甲型流感病毒的检测诊断提供了有力工具，具有广阔的应用前景和较高的使用价值。

权利要求

1.一种靶向甲型流感病毒保守线性B细胞表位的广谱单克隆抗体5F10，其特征在于，所述抗体5F10由杂交瘤细胞株CCTCC NO:C2022152产生。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体5F10，其特征在于，其特异性识别甲型流感病毒NP蛋白保守的线性B细胞表位。

3.如权利要求1或2所述的单克隆抗体5F10，其特征在于，该单克隆抗体特异性靶向甲型流感病毒NP蛋白第81～85位肽段，所述第81～85位肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求1所述的单克隆抗体5F10在制备甲型流感病毒及其NP蛋白检测试剂中的应用。

说明书

一种靶向甲型流感病毒保守线性B细胞表位的广谱单克隆抗

体及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，主要涉及一株可稳定分泌具有靶向甲型流感病毒保守线性B细胞表位的广谱单克隆抗体的杂交瘤细胞株，同时涉及该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体及其应用。

背景技术

[0002] 甲型流感病毒的感染宿主广泛，涉及人、禽、猪、马、犬等多种动物，尤其在人和禽群中造成严重危害，可引起流行甚至大流行。并且，动物源性甲型流感病毒跨越种间障碍直接感染人的事件时有发生，给公共卫生安全带来了严峻挑战。由于亚型众多且变异迅速，甲型流感病毒的高效快速诊断一直是临床实践中的迫切需求之一。

[0003] 目前，基于单克隆抗体的诊断方法，例如ELISA和胶体金免疫层析，因其灵敏度高、操作简便、出结果快等优势而越来越多地应用于甲型流感病毒的检测。但值得注意的是，这些诊断方法的有效性直接受制于检测用单克隆抗体对于甲型流感病毒的广谱性识别能力。甲型流感病毒的变异机制复杂、新型变异株往往不定期的出现，因此单克隆抗体越具广谱性，应用单克隆抗体建立的相应诊断方法发生漏检和假阴性的概率就越低。

[0004] 相较于能够激发机体产生中和抗体但频繁发生抗原漂移的表面糖蛋白HA和NA，甲型流感病毒的内部蛋白具有更高的保守性而更适合作为检测靶标。其中，NP蛋白在甲型流感病毒不同亚型不同毒株间的氨基酸同源性大于90％，高度保守，且其作为病毒粒子中表达丰度较高的结构蛋白还具有优良的免疫原性。因此，开发能够特异性识别不同甲型流感病毒NP蛋白的广谱性单克隆抗体，对于流感的诊断以及NP蛋白结构和功能的深入研究，均具有重要意义和广泛的应用前景。

发明内容

[0005] 为了解决现有技术存在的问题，本发明通过杂交瘤技术制备获得了1株特异性针对甲型流感病毒NP蛋白并具有广谱性识别H1～H11亚型禽流感病毒、H1和H3亚型人流感病毒与H1和H3亚型猪流感病毒的单克隆抗体，且该单克隆抗体靶向NP蛋白第81～85位氨基酸的保守线性B细胞表位，属于IgG1亚类。该单克隆抗体的成功获得，一方面为不同亚型、不同宿主来源甲型流感病毒的快速诊断奠定了重要基础，有利于甲型流感病毒快速检测试剂的进一步开发与应用；另一方面也为甲型流感病毒NP蛋白的结构和功能研究提供了重要的技术支持，有利于甲型流感病毒致病与免疫机制的进一步解析。

[0006] 本发明了提供了一种特异性结合甲型流感病毒NP蛋白的广谱性单克隆抗体5F10，由杂交瘤细胞株CCTCC NO:C2022152产生。该单克隆抗体能够与多种亚型、多种宿主来源的甲型流感病毒在间接免疫荧光和Western blot试验中发生特异性的免疫结合反应。

[0007] 本发明还提供了所述单克隆抗体5F10识别的抗原表位，利用噬菌体表面展示随机多肽文库筛选技术，鉴定所述单克隆抗体靶向甲型流感病毒NP蛋白第81～85位氨基酸的线81 85
性B细胞表位，其氨基酸序列为5’‑ EHPSA ‑3’，如SEQ ID NO.1所示；该表位在甲型流感病毒中高度保守，可进一步应用于抗甲型流感病毒通用表位疫苗的开发。

[0008] 本发明还提供了所述单克隆抗体5F10在制备甲型流感病毒检测试剂中的应用。

[0009] 本发明的特点和优点在于：本发明公开了一种靶向甲型流感病毒NP蛋白保守线性B细胞表位的广谱单克隆抗体5F10，由杂交瘤细胞5F10(保藏号CCTCC NO:C2022152)分泌产生，可以应用于对甲型流感病毒及其NP蛋白的检测，且具有良好的广谱性。间接免疫荧光和Western blot试验均证明所述单克隆抗体能够与禽源H1‑H11亚型、人和猪源H1和H3亚型的不同株甲型流感病毒结合，且该单克隆抗体在免疫沉淀和免疫组化试验中也具有良好的反应性，可应用于进一步开发甲型流感病毒的通用型检测试剂盒，为实验和临床样本中甲型流感病毒的快速检测提供强有力工具。

附图说明

[0010] 图1为杂交瘤细胞5F10上清对NP蛋白真核表达质粒转染293T细胞的IFA鉴定图。

[0011] 图2为单克隆抗体5F10对NP蛋白真核表达质粒转染293T细胞的Western blot鉴定图。

[0012] 图3为单克隆抗体5F10与不同亚型、不同宿主来源甲型流感病毒感染MDCK细胞的IFA结果图。

[0013] 图4为单克隆抗体5F10与不同亚型、不同宿主来源甲型流感病毒感染MDCK细胞的Western blot结果图。

[0014] 图5为单克隆抗体5F10识别抗原表位的鉴定结果。

[0015] 图6为单克隆抗体5F10识别抗原表位的保守性分析结果。

[0016] 图7为单克隆抗体5F10应用于免疫沉淀试验的结果图。

[0017] 图8为单克隆抗体5F10应用于免疫组化试验的结果图。

[0018] 本发明中的杂交瘤细胞5F10于2022年5月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，分类命名为杂交瘤细胞株5F10，保藏编号为CCTCC  NO:C2022152。

具体实施方式

[0019] 下面将结合附图和具体的实施例进一步阐述本发明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但这些实施例不作为对本发明的范围进行限定。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用材料、试剂若无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0020] 实施例一

[0021] 杂交瘤细胞株5F10及其产生的单克隆抗体的获得

[0022] 动物免疫

[0023] 将经灭活处理和超速离心纯化的甲型流感病毒QD1(H5N1)作为免疫原，初次免疫时与弗氏完全佐剂等体积混合，乳化完全后以皮下多点注射的方式免疫6周龄BALB/c小鼠，剂量为0.2mL/鼠。免疫后第14天进行第二次免疫，使用弗氏不完全佐剂，其他免疫条件同第一次免疫。免疫后第28天按第二次免疫的条件进行第三次免疫。免疫后第35天进行小鼠尾静脉采血，并对获得的三免血清使用血凝抑制(HI)试验测定其HI抗体效价，当免疫小鼠HI滴度≥7log2，随即腹腔注射经灭活纯化的QD1(H5N1)病毒进行冲击免疫并于3天后实施细胞融合。

[0024] 细胞融合与阳性杂交瘤细胞的筛选

[0025] 按常规杂交瘤技术进行。简言之，在融合前一天，以健康ICR小鼠的腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，适量分装于96孔细胞培养板中备用，培养基为含15％胎牛血清的HAT培养基。融合当天，超净工作台中取出免疫小鼠的脾脏，研磨获得脾细胞悬液；同时，收集处于对数生长期的SP2/0细胞于融合管中，并与制备好的脾细胞进行混合，期间需加入预温至37℃的聚乙二醇(如PEG1500)促使两种细胞发生融合，然后先慢后快滴加无抗生素无血清DMEM培养基以终止融合反应。将上述融合管低速离心10分钟后弃去上清，使用含15％胎牛血清的HAT培养基对沉淀的细胞进行重悬，均匀滴加到预先铺有饲养细胞的96孔细胞培养板，于5％CO2、37℃细胞培养箱中静置培养。

[0026] 约5天后，使用含15％胎牛血清的HAT培养基对细胞板中的每孔细胞进行一半培养液的更换；约10天后，改用含15％胎牛血清的HT培养基进行全孔培养液的更换；再经约14天的连续培养后，融合后的杂交瘤细胞培养上清变黄或细胞在孔底有明显分布时，对细胞上清进行间接ELISA试验来筛选阳性杂交瘤细胞。该ELISA试验中，包被抗原为经灭活纯化的QD1(H5N1)病毒，梯度稀释的待检细胞上清为一抗(其中将融合用小鼠的血清设为阳性血清对照)，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，TMB溶液显色后使用2M H2SO4对反应进行终止。读取450nm波长处的吸光值，选择OD450读值接近1.0且P/N比值≥2.1的细胞孔为阳性细胞孔；历经三次筛选均呈阳性读值的细胞孔方被计为具有ELISA反应活性的阳性杂交瘤细胞孔。

[0027] 为进一步筛选抗NP蛋白的杂交瘤细胞，对经ELISA检测阳性的细胞取其上清进行了间接免疫荧光(IFA)试验。使用NP蛋白的真核表达质粒pHW2000‑NP转染293T细胞，同时设立转染pHW2000空载体的细胞孔作为阴性对照。于转染后36小时对细胞进行固定，固定液采用4％多聚甲醛，4℃作用20分钟；固定完成后使用含5％脱脂乳的PBST溶液在室温孵育1小时进行封闭；PBST洗涤3次后，以待检的杂交瘤细胞上清为一抗，在4℃进行过夜孵育；经PBST洗涤3次后；以经PBST作适当稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG为荧光二抗，避光作用1h，再经3次PBST洗涤后于显微镜下观察是否存在特异性的绿色荧光。如图1所示，杂交瘤细胞5F10(图1A)和小鼠阳性血清(图1B)均能够与pHW2000‑NP质粒表达的NP蛋白发生结合而产生明亮的绿色荧光，转染pHW2000空载体的细胞中无特异性荧光(图1C)。因此，成功筛选出1株可识别NP蛋白的杂交瘤细胞5F10。

[0028] 阳性杂交瘤细胞的亚克隆与腹水的制备

[0029] 使用有限稀释法对杂交瘤细胞5F10进行克隆化。将阳性杂交瘤细胞5F10孔中的细胞轻缓吹下，吸取100μL细胞悬液转移至另一96孔板的第1行第1列孔，并对其在第1列的8个细胞孔中自上而下依次进行2倍的倍比稀释，稀释液为HT培养基；将计数后细胞量约100个的孔内细胞进一步转移至离心管中，使用4mL HT培养基进行稀释，仍以每孔100μL的量滴加入细胞板的第2和3列；对离心管中残留的细胞悬液再次补加HT培养基至4mL，混匀后分别加于细胞板的第4～5列；继续补加HT培养基于离心管中，并仍按上述方法将稀释的细胞悬液依次铺于第6和7列、第8和9列、第10～12列；最后，将细胞板放入细胞培养箱，于5％CO2、37℃条件下静置培养。约第5天观察并标记出呈现单个克隆细胞生长的培养孔；约第10天对细胞上清中的抗体效价进行检测并选择抗体滴度最高的单细胞集落孔，按上述方法再次进行有限稀释。该克隆化的过程可重复多次，直至单克隆细胞孔抗体检测阳性率达100％。

[0030] 将灭菌的液体石蜡经腹腔注射BALB/c小鼠，约0.5mL/只；约第7天，每只小鼠腹腔6
接种约1×10 个杂交瘤细胞；第14～17天，小鼠腹部明显膨大后抽取腹水，离心取上清，测定其抗体水平并分装备用。

[0031] 实施例二

[0032] 单克隆抗体5F10的Western blot反应性测定

[0033] 将真核表达质粒pHW2000‑NP转染293T细胞，同时转染pHW2000空载体作为阴性对照。36h时弃去细胞培养液，用PBS对细胞稍作洗涤，枪头吸干多余的水分并置于冰上裂解细胞，将裂解物以10000r/min离心10min后收集上清即为蛋白样品。在所制备的蛋白样品中加入适量的上样缓冲液，混匀后100℃煮样5分钟；随后进行SDS‑PAGE电泳，上样量为10μL/孔；电泳完成后按常规湿转的方法进行转印，进而将转印好的PVDF膜置于5％的脱脂乳中进行封闭；将实施例一制备的单克隆抗体5F10经1:2000稀释后作为一抗，于4℃水平摇床中孵育过夜；TBST进行3次洗膜后，用HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，室温摇床作用1小时；同上使用PBST洗膜3次后对PVDF膜进行显影并观测结果。如图2所示，转染pHW2000空载体的293T细胞样品中无条带，而转染pHW2000‑NP质粒的293T细胞样品在55kDa处产生明显的单一反应条带，大小与NP蛋白相同，表明单克隆抗体5F10特异性针对NP蛋白。因此，5F10具Western blot特性，可用于Western blot试验。

[0034] 实施例三

[0035] 单克隆抗体5F10的广谱反应性测定

[0036] 选取H1～H11亚型的禽流感病毒(包含H1N1、H2N3、H3N2、H4N6、H5NX、[0037] H6N2、H7N9、H8N4、H9N2、H10N7、H11N9亚型)、H1N1亚型(包含欧亚类禽EA H1N1和2009大流行性Pdm09 H1N1进化谱系)和H3N2亚型的猪流感病毒、H1N1亚型(包含季节性Seasonal H1N1和Pdm09 H1N1进化谱系)和H3N2亚型的人流感病毒感染MDCK细胞，分别使用IFA和Western blot试验对单克隆抗体5F10与不同亚型、不同宿主来源甲型流感病毒的反应性进行了测定。一方面如图3所示，IFA结果显示不同株甲型流感病毒感染的MDCK细胞中均可见清晰的绿色荧光，表明单克隆抗体5F10能够广谱性地识别甲型流感病毒的NP蛋白。
另一方面如图4所示，Western blot结果显示不同株甲型流感病毒感染的MDCK细胞样品均能够在55kDa处产生明显的反应条带，再次佐证单克隆抗体5F10能够广谱性地识别甲型流感病毒的NP蛋白。

[0038] 实施例四

[0039] 单克隆抗体5F10的亚类鉴定及抗原表位的鉴定

[0040] 使用Sigma‑Aldrich公司的鼠单克隆抗体亚类鉴定试剂盒Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents，参照说明书，对杂交瘤细胞5F10分泌的单克隆抗体进行鉴定，结果显示为IgG1型。

[0041] 使用NEB公司的噬菌体表面展示随机多肽文库试剂盒Ph.D.‑7TM Phage Display Peptide Library Kit，参照说明书，对单克隆抗体5F10识别的抗原表位进行鉴定。将筛选得到的阳性噬菌体克隆进行DNA的提取，并使用序列为5’‑CCCTCATAGTTAGCGTAACG‑3’(SEQ ID NO.2)的引物‑96gIII对噬菌体中插入的核苷酸序列进行测序，进而推导出插入片段对应的7肽序列。随后，通过与QD1(H5N1)病毒的NP基因序列进行比对，定位匹配的氨基酸位点，确定该单克隆抗体所识别的模拟表位。如图5所示，对18个阳性噬菌体克隆的测序结果表明，它们一致性地具有3个连续的氨基酸HPS，这与NP蛋白第82～84位完全吻合。并且，7个克隆共同具有EHPS的连续氨基酸，6个具有HSPA，另有2个具有EHPSA，均与NP蛋白第81～85位区间的相应肽段完全匹配。因此表明，NP蛋白上E81‑H82‑P83‑S84‑A85的氨基酸基序是单克隆抗体5F10识别的抗原表位的核心基序。进一步使用在线分析工具iBCE‑EL(网址：http://thegleelab.org/iBCE‑EL)对EHPSA肽段是否属于线性B细胞表位的可能性进行了评估，结果显示其以0.9072的概率值被预测为线性B细胞表位。因此，单克隆抗体5F10识别的是NP蛋白上的线性B细胞表位。

[0042] 进一步通过比对NP蛋白的氨基酸序列，对该EHPSA表位在甲型流感病毒中的保守性进行了分析。从GISAID数据库中下载中国地区不同宿主来源的甲型流感病毒(n＝13634)，包括不同亚型的禽流感病毒(n＝8110)、猪流感病毒(n＝712)和人流感病毒(n＝
4812)，对其NP基因第81～85位氨基酸序列的比对结果如图6所示，EHPSA基序在不同宿主来源的甲型流感病毒中均高度保守，提示该保守线性B细胞表位可进一步应用于抗甲型流感病毒通用表位疫苗的开发。

[0043] 实施例五

[0044] 单克隆抗体5F10在免疫沉淀试验中的应用

[0045] 以禽源H5N6亚型的甲型流感病毒株为例，对单克隆抗体5F10在免疫沉淀试验中的应用进行了评估。将培养至70％丰度的MDCK细胞接种1MOI剂量的H5N6禽流感病毒。感染24小时后，对细胞进行裂解，提取蛋白：弃去培养细胞的上清液，经预冷的PBS清洗2遍，加入含终浓度1mM PMSF的细胞裂解液，冰上裂解10分钟后转移至预冷的离心管中，4℃离心10分钟再将上清转移至新的预冷的离心管中，从中吸取20μL作为input。然后加入单克隆抗体5F10，37℃孵育30分钟使单克隆抗体与相应蛋白发生结合。接下来，添加protein A+G Agarose，在4℃缓慢旋转混匀4小时使单克隆抗体与Agarose发生结合。随后，4℃离心3分钟后弃去上清，加入含有DTT的细胞裂解液，上下颠倒混匀进行洗涤，再离心去上清，重复5次。
将上述制备的免疫沉淀样品加入终浓度为1×的上样缓冲液，100℃煮样5分钟后进行Western blot鉴定。如图7所示，单克隆抗体5F10可以与细胞样品中的NP蛋白结合，并使用免疫印迹的方式将NP蛋白检测出来。因此，单克隆抗体5F10可以应用于免疫沉淀试验检测甲型流感病毒NP蛋白。

[0046] 实施例六

[0047] 单克隆抗体5F10在免疫组化试验中的应用

[0048] 以禽源H5N6亚型的甲型流感病毒株为例，对单克隆抗体5F10在免疫组化试验中的6.0
应用进行了评估。将10 EID50剂量的H5N6禽流感病毒滴鼻感染6周龄BALB/c小鼠，于感染后第3天取小鼠肺脏进行福尔马林固定，随后进行石蜡包埋和切片。接着，将制备好的切片与单克隆抗体5F10在4℃孵育过夜；PBST清洗3次后滴加HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃作用
40分钟；随后用DAB进行显色并在显微镜下观察成像。结果如图8所示，H5N6亚型禽流感病毒感染的小鼠肺组织中可见呈现黄褐色的免疫组化阳性细胞，表明单克隆抗体5F10可以应用于免疫组化试验检测甲型流感病毒的感染。