居海胆杆菌及其应用和培养方法、降解塑料的方法转让专利
申请号 : CN202310029945.5
文献号 : CN115725479B
文献日 : 2023-03-28
发明人 : 穆军 , 姚玲弟
申请人 : 海南热带海洋学院
摘要 :
本发明涉及微生物应用技术领域，具体是居海胆杆菌及其应用和培养方法、降解塑料的方法。本发明提供了居海胆杆菌及其应用和培养方法、降解塑料的方法。本发明提供的居海胆杆菌（Echinicola sp.），其保藏编号为CGMCC No.26016，具有塑料降解功能，能够降解海水中的聚乙烯，降解效率高。实验表明，本发明从海南三亚河近入海口附近红树林底泥中成功分离筛选出居海胆杆菌MY08，经过所述居海胆杆菌MY08处理20天的聚乙烯塑料薄膜发生降解，其降解速率为750±6 mg/(d•m3)，而没有经过所述居海胆杆菌MY08处理的聚乙烯塑料薄膜表面没有被侵蚀的痕迹，也未出现质量变化。
权利要求 :
1.一株居海胆杆菌（Echinicola sp.），其特征在于，于2022年11月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 26016。
2.权利要求1所述的居海胆杆菌在降解聚乙烯塑料中的应用。
3.权利要求1所述居海胆杆菌的培养方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的居海胆杆菌接种于培养基中，进行培养。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述居海胆杆菌的接种量为5% 20%。
~
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养在pH值为6 8下进行。
~
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养在10℃ 40℃以100 r/min 150 ~ ~r/min下进行。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以质量份计，所述培养基的成分包括：
3份 7份的蛋白胨、0.5份 1.5份的酵母粉、0.05份 0.15份的柠檬酸铁、15份 20份的氯~ ~ ~ ~化钠、5份 10份的氯化镁、3份 5份的硫酸钠、1份 2份的氯化钙、0.5份 1份的氯化钾、0.1份~ ~ ~ ~
0.5份的碳酸钠、0.05份 0.1份的溴化钾、0.01份 0.05份的氯化锶、0.01份 0.05份的硼~ ~ ~ ~酸、0.001份 0.005份的硅酸钠、0.001份 0.005份的氟化钠、0.001份 0.005份的硝酸铵、~ ~ ~
0.005份 0.01份的磷酸氢二钠、10份 30份的琼脂和500份 1500份的水；
~ ~ ~
或者，
3份 7份的蛋白胨、0.5份 1.5份的酵母粉、0.05份 0.15份的柠檬酸铁、15份 20份的氯~ ~ ~ ~化钠、5份 10份的氯化镁、3份 5份的硫酸钠、1份 2份的氯化钙、0.5份 1份的氯化钾、0.1份~ ~ ~ ~
0.5份的碳酸钠、0.05份 0.1份的溴化钾、0.01份 0.05份的氯化锶、0.01份 0.05份的硼~ ~ ~ ~酸、0.001份 0.005份的硅酸钠、0.001份 0.005份的氟化钠、0.001份 0.005份的硝酸铵、~ ~ ~
0.005份 0.01份的磷酸氢二钠和500份 1500份的水；
~ ~
或者，
0.5份~1份的K2HPO4、0.5份~1份的KH2PO4、0.8份~1.2份的NH4NO3、0.08份~0.12份的CaCl2、0.01份~0.04份的FeSO4、500份~1500份的海水和聚乙烯塑料；所述聚乙烯塑料在所述培养基中的含量为1 g /L 3 g/L；
~
或者，
0.5份~1份的K2HPO4、0.5份~1份的KH2PO4、0.8份~1.2份的NH4NO3、0.08份~0.12份的CaCl2、0.01份~0.04份的FeSO4、0.1份~0.5份酵母浸粉、500份~1500份的海水和聚乙烯塑料；
所述聚乙烯塑料在所述培养基中的含量为1 g /L 3 g/L。
~
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述居海胆杆菌在接种前在富集培养基进行富集培养；
以质量份计，所述富集培养基的成分包括：0.5份~1份的K2HPO4、0.5份~1份的KH2PO4、0.8份~1.2份的NH4NO3、0.08份~0.12份的CaCl2、0.01份~0.04份的FeSO4、0.08份~0.12份的酵母浸粉、500份 1500份的海水和聚乙烯塑料。
~
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述聚乙烯塑料在所述培养基中的含量为
1 g /L 3 g/L。
~
说明书 :
居海胆杆菌及其应用和培养方法、降解塑料的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及海洋环境污染修复领域，具体是居海胆杆菌及其应用和培养方法、降解塑料的方法。
背景技术
[0002] 塑料是日常生活中最常见的有机合成高分子聚合材料，因其价格低、质量轻、使用方便而被广泛应用。随着不可降解塑料的消耗，诸多不良效应也与之而来。据统计，全球海水中总计约有3.5万吨微塑料碎片，占所有海洋废弃物的60%～80%，并且这一数量级还在不断增长。微塑料能够直接与水生生物接触，直接威胁水生生态系统的健康。它们在潮间带、近海沉积物中积累，或在水体中悬浮，可被浮游生物、鱼类、鸟类和海洋哺乳动物摄食，同时它们还可通过食物链传递影响不同营养级生物的健康。
[0003] 目前，针对海洋塑料污染的治理问题尚缺乏有效的技术手段。目前通常认为，一部分塑料可能被生物附着后导致重量的增加，进而沉入海底，一部分可能被海洋动物摄食，还有一部分可能被光解或微生物降解。通过生物降解消除海洋中微塑料污染是一类环境友好并且有应用前景的方法，但现阶段获得的能适应海洋环境的塑料降解菌种质资源非常有限，使得其在海洋塑料污染的原位修复应用方面存在大的技术瓶颈。海洋微生物资源浩瀚广博，定向筛选新的高效的海洋塑料（微塑料）降解菌，开发解决海洋塑料末端污染技术，极具发展潜力和应用前景。
发明内容
[0004] 有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供居海胆杆菌及其应用和培养方法、降解塑料的方法，本发明提供的居海胆杆菌具有塑料降解功能，能够降解海水中的塑料，降解效率高。
[0005] 本发明提供了居海胆杆菌（Echinicola sp.），于2022年11月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，其保藏编号为CGMCC No. 26016。
[0006] 上述居海胆杆菌及其细胞成分、代谢物、代谢物的衍生物、分泌物中的至少一种均在本发明的保护范围以内。可以理解的是，所述细胞成分包括细胞、包含该细胞的培养液和组成细胞的各种化学成分中的至少一种；所述代谢物包括新陈代谢中的中间代谢物和最终代谢物中的至少一种；所述分泌物包括核酸、酶、抗体、外泌体和激素中的至少一种。
[0007] 本发明提供了上述居海胆杆菌在降解聚乙烯塑料中的应用。本发明提供的居海胆杆菌能够利用塑料为碳源和能源，具有降解塑料的功能，降解效率高。在一个实施例中，所述塑料为塑料颗粒或塑料薄膜。在一个实施例中，所述塑料为微塑料。
[0008] 本发明提供了降解塑料的方法，包括：用上述居海胆杆菌对聚乙烯塑料进行降解。具体而言，本发明所述降解塑料的方法包括：用上述居海胆杆菌与聚乙烯塑料接触，进行繁殖，降解。本发明所述降解塑料的方法可以在自然环境或培养基中进行。在一个实施例中，用上述居海胆杆菌与聚乙烯塑料接触，在海水中进行繁殖，降解。在一个实施例，用上述居海胆杆菌与聚乙烯塑料接触，在培养基中进行繁殖，降解。
[0009] 本发明提供了上述居海胆杆菌的培养方法，包括：将上述居海胆杆菌接种于培养基中，进行培养。具体而言，本发明将上述居海胆杆菌的培养液接种于培养基中进行培养；所述培养基为2216E固体培养基、2216E液体培养基、无机盐液体培养基或活性测试液体培养基。在本发明的某些实施例中，所述居海胆杆菌按5% 20%的接种量接种于培养基中，优选~
按5% 10%的接种量，更优选按10%的接种量。在本发明的某些实施例中，将上述居海胆杆菌~
的培养液接种于2216E固体培养基，再接种于无机盐液体培养基中进行培养。在本发明的某些实施例中，将上述居海胆杆菌的培养液接种于活性测试液体培养基或者2216E液体培养基中进行培养。在本发明的某些实施例中，将上述居海胆杆菌的培养液接种于无机盐液体培养基中进行培养。在本发明的某些实施例中，将上述居海胆杆菌的培养液接种于含有
2216E固体培养基的平板上或含有2216E固体培养基的斜面试管中进行培养。
按5% 10%的接种量，更优选按10%的接种量。在本发明的某些实施例中，将上述居海胆杆菌~
的培养液接种于2216E固体培养基，再接种于无机盐液体培养基中进行培养。在本发明的某些实施例中，将上述居海胆杆菌的培养液接种于活性测试液体培养基或者2216E液体培养基中进行培养。在本发明的某些实施例中，将上述居海胆杆菌的培养液接种于无机盐液体培养基中进行培养。在本发明的某些实施例中，将上述居海胆杆菌的培养液接种于含有
2216E固体培养基的平板上或含有2216E固体培养基的斜面试管中进行培养。
[0010] 本发明通过调节所述培养基的pH值，从而调节上述培养过程中的pH值。在一个实施例中，用1 mol/L 3 mol/L的NaOH来调节所述培养基的pH值为6 8，优选为7。~ ~
[0011] 在本发明的某些实施例中，以质量份计，所述无机盐液体培养基的成分包括：0.5份~1份的K2HPO4、0.5份~1份的KH2PO4、0.8份~1.2份的NH4NO3、0.08份~0.12份的CaCl2、0.01份~0.04份的FeSO4、500份~1500份的海水和聚乙烯塑料；所述聚乙烯塑料的含量为1 g/L~3 g/L，优选为2 g/L。在一个实施例中，所述无机盐液体培养基的成分包括：0.7 g的K2HPO4、0.7 g的KH2PO4、1.0 g的NH4NO3、0.1 g的CaCl2、0.02g的FeSO4、1 L的海水和聚乙烯塑料；所述聚乙烯塑料的含量为1 g/L 3 g/L，优选为2 g/L。
~
~
[0012] 在本发明的某些实施例中，以质量份计，所述活性测试液体培养基的成分包括：0.5份~1份的K2HPO4、0.5份~1份的KH2PO4、0.8份~1.2份的NH4NO3、0.08份~0.12份的CaCl2、
0.01份~0.04份的FeSO4、0.1份~0.5份酵母浸粉、500份~1500份的海水和聚乙烯塑料；所述聚乙烯塑料的含量为1 g/L 3 g/L，优选为2 g/L。在一个实施例中，所述活性测试液体培养~
基的成分包括：0.7 g的K2HPO4、0.7 g的KH2PO4、1.0 g的NH4NO3、0.1 g的CaCl2、0.02g的FeSO4、0.15 g酵母浸粉、1 L的海水和聚乙烯塑料；所述聚乙烯塑料的含量为1 g/L~3 g/L，优选为2 g/L。
0.01份~0.04份的FeSO4、0.1份~0.5份酵母浸粉、500份~1500份的海水和聚乙烯塑料；所述聚乙烯塑料的含量为1 g/L 3 g/L，优选为2 g/L。在一个实施例中，所述活性测试液体培养~
基的成分包括：0.7 g的K2HPO4、0.7 g的KH2PO4、1.0 g的NH4NO3、0.1 g的CaCl2、0.02g的FeSO4、0.15 g酵母浸粉、1 L的海水和聚乙烯塑料；所述聚乙烯塑料的含量为1 g/L~3 g/L，优选为2 g/L。
[0013] 在本发明的某些实施例中，以质量份计，所述2216E固体培养基的成分包括：3份 7~份的蛋白胨，0.5份 1.5份的酵母粉，0.05份 0.15份的柠檬酸铁，15份 20份的氯化钠，5份~ ~ ~ ~
10份的氯化镁，3份 5份的硫酸钠，1份 2份的氯化钙，0.5份 1份的氯化钾，0.1份 0.5份的~ ~ ~ ~
碳酸钠，0.05份 0.1份的溴化钾，0.01份 0.05份的氯化锶，0.01份 0.05份的硼酸，0.001份~ ~ ~
0.005份的硅酸钠，0.001份 0.005份的氟化钠，0.001份 0.005份的硝酸铵，0.005份 0.01~ ~ ~ ~
份的磷酸氢二钠，10份 30份的琼脂和500份 1500份的水。在一个实施例中，所述2216E固体~ ~
培养基的成分包括：5.0 g的蛋白胨，1.0 g的酵母粉，0.1 g的柠檬酸铁，19.45 g的氯化钠，
5.98 g的氯化镁，3.24 g的硫酸钠，1.8 g的氯化钙，0.55 g的氯化钾, 0.16 g的碳酸钠,
0.08 g的溴化钾, 0.034 g的氯化锶，0.022 g的硼酸, 0.004 g的硅酸钠，0.0024 g的氟化钠，0.0016 g的硝酸铵，0.008 g的磷酸氢二钠，15 g的琼脂和1000 mL的水。
10份的氯化镁，3份 5份的硫酸钠，1份 2份的氯化钙，0.5份 1份的氯化钾，0.1份 0.5份的~ ~ ~ ~
碳酸钠，0.05份 0.1份的溴化钾，0.01份 0.05份的氯化锶，0.01份 0.05份的硼酸，0.001份~ ~ ~
0.005份的硅酸钠，0.001份 0.005份的氟化钠，0.001份 0.005份的硝酸铵，0.005份 0.01~ ~ ~ ~
份的磷酸氢二钠，10份 30份的琼脂和500份 1500份的水。在一个实施例中，所述2216E固体~ ~
培养基的成分包括：5.0 g的蛋白胨，1.0 g的酵母粉，0.1 g的柠檬酸铁，19.45 g的氯化钠，
5.98 g的氯化镁，3.24 g的硫酸钠，1.8 g的氯化钙，0.55 g的氯化钾, 0.16 g的碳酸钠,
0.08 g的溴化钾, 0.034 g的氯化锶，0.022 g的硼酸, 0.004 g的硅酸钠，0.0024 g的氟化钠，0.0016 g的硝酸铵，0.008 g的磷酸氢二钠，15 g的琼脂和1000 mL的水。
[0014] 在本发明的某些实施例中，以质量份计，所述2216E液体培养基的成分包括：3份 7~份的蛋白胨，0.5份 1.5份的酵母粉，0.05份 0.15份的柠檬酸铁，15份 20份的氯化钠，5份~ ~ ~ ~
10份的氯化镁，3份 5份的硫酸钠，1份 2份的氯化钙，0.5份 1份的氯化钾，0.1份 0.5份的~ ~ ~ ~
碳酸钠，0.05份 0.1份的溴化钾，0.01份 0.05份的氯化锶, 0.01份 0.05份的硼酸，0.001~ ~ ~
份 0.005份的硅酸钠，0.001份 0.005份的氟化钠，0.001份 0.005份的硝酸铵，0.005份~ ~ ~ ~
0.01份的磷酸氢二钠和500份 1500份的水。在一个实施例中，所述2216E液体培养基的成分~
包括：5.0 g的蛋白胨，1.0 g的酵母粉，0.1 g的柠檬酸铁，19.45 g的氯化钠，5.98 g的氯化镁，3.24 g的硫酸钠，1.8 g的氯化钙，0.55 g的氯化钾, 0.16 g的碳酸钠, 0.08 g的溴化钾, 0.034 g的氯化锶，0.022 g的硼酸, 0.004 g的硅酸钠，0.0024 g的氟化钠，0.0016 g的硝酸铵，0.008 g的磷酸氢二钠和1000 mL的水。
10份的氯化镁，3份 5份的硫酸钠，1份 2份的氯化钙，0.5份 1份的氯化钾，0.1份 0.5份的~ ~ ~ ~
碳酸钠，0.05份 0.1份的溴化钾，0.01份 0.05份的氯化锶, 0.01份 0.05份的硼酸，0.001~ ~ ~
份 0.005份的硅酸钠，0.001份 0.005份的氟化钠，0.001份 0.005份的硝酸铵，0.005份~ ~ ~ ~
0.01份的磷酸氢二钠和500份 1500份的水。在一个实施例中，所述2216E液体培养基的成分~
包括：5.0 g的蛋白胨，1.0 g的酵母粉，0.1 g的柠檬酸铁，19.45 g的氯化钠，5.98 g的氯化镁，3.24 g的硫酸钠，1.8 g的氯化钙，0.55 g的氯化钾, 0.16 g的碳酸钠, 0.08 g的溴化钾, 0.034 g的氯化锶，0.022 g的硼酸, 0.004 g的硅酸钠，0.0024 g的氟化钠，0.0016 g的硝酸铵，0.008 g的磷酸氢二钠和1000 mL的水。
[0015] 在本发明的某些实施例中，上述居海胆杆菌的培养液的获得步骤包括：将环境样品中的本发明所述居海胆杆菌进行驯化、富集，初筛，复筛，得到上述居海胆杆菌的培养液。
[0016] 首先将环境样品中的本发明所述居海胆杆菌进行驯化。具体而言，首先将塑料置于环境中，进行连续原位驯化。在本发明的某些实施例中，将塑料置于海南三亚红树林根泥中，连续原位驯化土著微生物4周以上，优选为4周，取所述塑料和塑料周围的根泥作为环境样品。本发明所述塑料和上述一样，不再赘述。
[0017] 在环境中对本发明所述居海胆杆菌进行驯化后，再进行富集。具体而言，将驯化后得到的环境样品置于富集培养基中，对本发明所述居海胆杆菌进行富集培养。在本发明的某些实施例中，将驯化后得到的环境样品置于富集培养基中，对本发明所述居海胆杆菌进行富集培养4周以上，优选为6周。在一个实施例中，所述富集培养在pH值为6 8下进行，优选~为7。在一个实施例中，所述富集在10℃ 40℃、100 r/min 150 r/min下进行，优选在28℃、~ ~
120 r/min下进行。在一个实施例中，所述环境样品按5 20%的接种量置于所述富集培养基~
中，优选为5 10%。
~
120 r/min下进行。在一个实施例中，所述环境样品按5 20%的接种量置于所述富集培养基~
中，优选为5 10%。
~
[0018] 本发明通过调节所述富集培养基的pH值，从而调节上述富集过程中的pH值。在一个实施例中，用1 mol/L 3 mol/L的NaOH来调节所述富集培养基的pH值为6 8，优选为7。~ ~
[0019] 在本发明的某些实施例中，以质量份计，所述富集培养基的成分包括：0.5份 1份~的K2HPO4，0.5份~1份的KH2PO4，0.8份~1.2份的NH4NO3，0.08份~0.12份的CaCl2，0.01份~0.04份的FeSO4，0.08份~0.12份的酵母浸粉、500份~1500份的海水和聚乙烯塑料；所述聚乙烯塑料的含量为1 g/L 3 g/L，优选为2 g/L。在一个实施例中，所述富集培养基的成分包括：0.7 ~
g的K2HPO4，0.7 g的KH2PO4，1.0 g的NH4NO3，0.1 g的CaCl2，0.02 g的FeSO4，0.1 g的酵母浸粉、1 L的海水和聚乙烯塑料；所述聚乙烯塑料的含量为1 g/L 3 g/L，优选为2 g/L。
~
g的K2HPO4，0.7 g的KH2PO4，1.0 g的NH4NO3，0.1 g的CaCl2，0.02 g的FeSO4，0.1 g的酵母浸粉、1 L的海水和聚乙烯塑料；所述聚乙烯塑料的含量为1 g/L 3 g/L，优选为2 g/L。
~
[0020] 将本发明所述居海胆杆菌进行驯化和富集后，再进行初筛和复筛，得到居海胆杆菌的培养液。具体而言，将上述富集培养后的居海胆杆菌稀释涂布后，采用平板划线法进行初筛培养，再在无机盐液体培养基中进行复筛培养，得到居海胆杆菌的培养液。在本发明的某些实施例中，将上述富集培养后的居海胆杆菌通过稀释涂布转接到2216E固体培养基中进行初筛培养3天 7天，然后采用平板划线法根据形态、大小和颜色进行划线分离，得到初~筛居海胆杆菌；然后挑一环所述居海胆杆菌在无机盐液体培养基中进行复筛培养1 2周，得~
到居海胆杆菌的培养液。本发明所述2216E固体培养基和无机盐液体培养基和上述一样，不‑1 ‑2 ‑3
再赘述。在本发明的某些实施例中，所述稀释涂布的稀释梯度为10 、10 、10 。在一个实施例中，所述划线分离的次数为2次 3次。在一个实施例中，所述初筛培养在10℃ 40℃、100 ~ ~
r/min 150 r/min下进行，优选在28℃、120 r/min下进行；所述复筛培养在10℃ 40℃、100 ~ ~
r/min 150 r/min下进行，优选在28℃、120r/min下进行。
~
到居海胆杆菌的培养液。本发明所述2216E固体培养基和无机盐液体培养基和上述一样，不‑1 ‑2 ‑3
再赘述。在本发明的某些实施例中，所述稀释涂布的稀释梯度为10 、10 、10 。在一个实施例中，所述划线分离的次数为2次 3次。在一个实施例中，所述初筛培养在10℃ 40℃、100 ~ ~
r/min 150 r/min下进行，优选在28℃、120 r/min下进行；所述复筛培养在10℃ 40℃、100 ~ ~
r/min 150 r/min下进行，优选在28℃、120r/min下进行。
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[0021] 本发明提供了居海胆杆菌及其应用和培养方法、降解塑料的方法。本发明提供的居海胆杆菌（Echinicola sp.），其保藏编号为CGMCC No. 26016。本发明提供的居海胆杆菌具有塑料降解功能，能够降解海水中的聚乙烯，降解效率高。实验表明，本发明从海南三亚河近入海口附近红树林底泥中成功分离筛选出居海胆杆菌MY08，经过所述居海胆杆菌MY08处理20天的聚乙烯塑料薄膜表面变得粗糙，并且出现明显的侵蚀孔洞，其发生了降解，其降3
解速率为750±6 g/(d•m)，而未经过所述居海胆杆菌MY08处理的聚乙烯塑料薄膜表面没有被侵蚀的痕迹，也未出现质量变化，通过红外光谱分析进一步证实了本发明所述居海胆杆菌MY08利用塑料为能源，具有塑料降解功能。
解速率为750±6 g/(d•m)，而未经过所述居海胆杆菌MY08处理的聚乙烯塑料薄膜表面没有被侵蚀的痕迹，也未出现质量变化，通过红外光谱分析进一步证实了本发明所述居海胆杆菌MY08利用塑料为能源，具有塑料降解功能。
[0022] 生物保藏说明
[0023] 生物材料：MY08，分类命名：居海胆杆菌（Echinicola sp.），于2022年11月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 26016。
附图说明
[0024] 图1为基于16S rRNA基因序列构建的实施例1所得菌株的系统发育树图；
[0025] 图2为实施例1所得菌株在2216E固体培养基中的形态图；
[0026] 图3为实施例1所得菌株的生长曲线图；
[0027] 图4为对照组的聚乙烯塑料薄膜的表面形态图；
[0028] 图5为实验组的聚乙烯塑料薄膜的表面形态图;
[0029] 图6为实验组和对照组的聚乙烯塑料薄膜的红外光谱图。
具体实施方式
[0030] 本发明公开了居海胆杆菌及其应用和培养方法、降解塑料的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0031] 以下结合实施例对本发明进行进一步阐述：
[0032] 实施例1
[0033] 分离聚乙烯塑料海洋降解菌，步骤包括原位驯化和富集培养，具体如下：
[0034] 1. 原位驯化：在位于海南省三亚市三亚河近入海口附近岸边红树林根泥中，浅层埋放聚乙烯塑料薄膜条带，连续原位驯化土著微生物，增生塑料降解菌群落，驯化时间为期4周。4周后采集所述聚乙烯塑料薄膜及其包覆的根泥样品，供下一步富集培养用。
[0035] 2. 富集培养：无菌操作条件下，取原位驯化获得的样品——聚乙烯塑料薄膜及包覆的根泥作为接种物，其中聚乙烯塑料薄膜剪成长宽均为1 cm大小的方块，按10%的接种量加入到300 mL锥形瓶内的100 mL 灭菌的富集培养基中，于28℃、120 r/min的条件下，摇床培养6周。
[0036] 所述富集培养基的配方（/L）包括：0.7 g的K2HPO4，0.7 g的KH2PO4，1.0 g的NH4NO3，0.1 g的CaCl2，0.02 g的FeSO4，0.1 g的酵母浸粉和1000 mL的天然陈化海水，调节pH至7.0。
所述灭菌的富集培养基事先用121℃高压灭菌20分钟，待冷却至室温后，按2 g/L加入长和宽均为1 cm的事先经过无菌处理的聚乙烯塑料薄膜，所述无菌处理的方法为将聚乙烯塑料薄膜用2% SDS浸泡2 h，再用75%的酒精浸泡2 h，无菌水冲洗3次。
所述灭菌的富集培养基事先用121℃高压灭菌20分钟，待冷却至室温后，按2 g/L加入长和宽均为1 cm的事先经过无菌处理的聚乙烯塑料薄膜，所述无菌处理的方法为将聚乙烯塑料薄膜用2% SDS浸泡2 h，再用75%的酒精浸泡2 h，无菌水冲洗3次。
[0037] 对上述富集培养后的聚乙烯塑料海洋降解菌进行活性筛选，步骤包括初筛和复筛，具体如下：
[0038] 1、初筛：将上述经富集培养后的菌液，采用平皿稀释涂布法进行分离，稀释梯度，‑1 ‑2 ‑3稀释梯度为10 、10 、10 。所述菌液在培养皿平板上生长3天后，挑选涂布长出的形态、大小、颜色不同的菌落，在新鲜海洋2216E固体培养基平板上进行划线分离2 3次，获得纯菌~
株。
株。
[0039] 所述海洋2216E固体培养基配方（/L）为：5.0 g的蛋白胨，1.0 g的酵母粉，0.1 g的柠檬酸铁，19.45 g的氯化钠，5.98 g的氯化镁，3.24 g的硫酸钠，1.8 g的氯化钙，0.55 g的氯化钾，0.16 g的碳酸钠，0.08 g的溴化钾，0.034 g的氯化锶，0.022 g的硼酸，0.004 g的硅酸钠，0.0024 g的氟化钠，0.0016 g的硝酸铵，0.008 g的磷酸氢二钠，15 g的琼脂和1 L的去离子水，pH值为7.6 ± 0.2。所述海洋2216E固体培养基事先经过121℃高压灭菌20分钟。
[0040] 2.复筛（回测）：为防止初筛得到的活性菌株出现假阳性，将初筛得到的纯菌株进行复筛（回测）。挑一环生长好的纯菌株菌苔至100 mL的无机盐液体培养基中，28℃，120r/min培养1周。将培养液作为接种物接种到平板上，经培养有生长物者作为有效菌株。所述无机盐液体培养基的配方（/L）为：0.7 g的K2HPO4，0.7 g的KH2PO4，1.0 g的NH4NO3，0.1 g的CaCl2，0.02 g的FeSO4和1 L的天然海水, 用1 mol/L的NaOH调节pH至7.0，121℃高压灭菌20分钟，待冷却至室温后，按2 g/L加入长和宽均为1cm的事先经过无菌处理的聚乙烯塑料薄膜，所述无菌处理的方法为将聚乙烯塑料薄膜用2% SDS浸泡2 h，再用75%的酒精浸泡2 h，无菌水冲洗3次。
[0041] 实施例2
[0042] 由实施例1的分离和筛选最终获得一株能够利用聚乙烯塑料为碳源和能源的海洋降解菌MY08。将MY08菌株接种到2216E固体培养基上生长，2 3天采收平板上的菌落，用于提~取菌体核酸测序。进行16S rRNA基因测序和同源性分析，具体如下：
[0043] 使用TSINGKE植物DNA提取试剂盒（通用型）对实施例1所得菌株进行DNA提取，得到所述菌株的DNA样品。所提取的DNA样品适量稀释后作为PCR模板，采用细菌通用引物27F(5’‑AGTTTGATCMTGGCTCAG‑3’）, 1492R（5’‑GGTTACCTTGTTCGACTT‑3’）进行PCR扩增，长度1500 bp。扩增体系：45 µL的1×TSE101金牌mix，2 µL的引物27F，2 µL的引物1492R，1 µL的DNA模板。扩增程序：预变性98℃ 2 min；循环阶段98℃ 10 s、56℃ 10 s、72℃ 10 s，循环
35次；延伸阶段 72℃ 5 min，保存阶段4℃。将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（2 µL样品+6 µL溴酚蓝），300 V电压下12 min，获取鉴定胶图。将准备好的PCR产物送至广州擎科测序部进行一代测序。所得序列用ContigExpress拼接，并去除两端不准的部分，将拼接好的序列在EzBioCloud比对，发现其属于Echinicola属，基于16S rRNA基因序列构建了菌株系统发育树，如图1所示，图1为基于16S rRNA基因序列构建的实施例1所得菌株的系统发育树图，图1显示了实施例1所得菌株与Echinicola shivajiensis在进化树上聚在同一个分支，并上传至NCBI获得登录号为OP002069。
35次；延伸阶段 72℃ 5 min，保存阶段4℃。将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（2 µL样品+6 µL溴酚蓝），300 V电压下12 min，获取鉴定胶图。将准备好的PCR产物送至广州擎科测序部进行一代测序。所得序列用ContigExpress拼接，并去除两端不准的部分，将拼接好的序列在EzBioCloud比对，发现其属于Echinicola属，基于16S rRNA基因序列构建了菌株系统发育树，如图1所示，图1为基于16S rRNA基因序列构建的实施例1所得菌株的系统发育树图，图1显示了实施例1所得菌株与Echinicola shivajiensis在进化树上聚在同一个分支，并上传至NCBI获得登录号为OP002069。
[0044] 实施例1所得菌株在2216E固体培养基上的菌落呈橙色，圆形，表面光滑，边缘整齐，如图2所述，图2为实施例1所得菌株在2216E固体培养基中的形态图。实施例1所得菌株在2216E液体培养基中，在28℃、120 r/min的条件下有氧培养测定生长曲线，结果如图3和表1所示，图3为实施例1所得菌株的生长曲线图，表1为图3所示菌株的生长曲线的数据。其中，所述2216E液体培养基的配方(/L)为：5.0 g的蛋白胨，1.0 g的酵母粉，0.1 g的柠檬酸铁，19.45 g的氯化钠，5.98 g的氯化镁，3.24 g的硫酸钠，1.8 g的氯化钙，0.55 g的氯化钾，0.16 g的碳酸钠，0.08 g的溴化钾，0.034 g的氯化锶，0.022 g的硼酸，0.004 g的硅酸钠，0.0024 g的氟化钠，0.0016 g的硝酸铵，0.008 g的磷酸氢二钠和1000 mL的去离子水，pH值为7.6±0.2。
[0045] 表1
[0046] 时间/t 0 2 4 6 8 12 18 24 32 48 56OD600 0.1745 0.281 0.529 0.703 0.8515 0.9456 1.1915 1.3485 1.5105 1.614 1.617[0047] 综合比对以上特征，初步将实施例1所得菌株鉴定为Echinicola sp.MY08菌株，即居海胆杆菌MY08。
[0048] 实施例3
[0049] 本发明所述居海胆杆菌MY08在降解商用聚乙烯塑料方面的应用，降解及表征分别采用以下步骤进行（所用到的培养基的配方和上述一样，不再赘述）：
[0050] 1、种子培养液的制备
[0051] 共有两种方式；第一种是将本发明所述居海胆杆菌MY08斜面菌苔接种到活性测试液体培养基中，所述培养基事先按2 g/L的量加入了长宽均为1 cm的事先经过无菌处理的聚乙烯塑料薄膜（处理方法和实施例1所述相同）；将其在28℃、120 r/min的条件下培养1周得到菌悬液；第二种是将本发明所述居海胆杆菌MY08斜面菌苔接种到2216E液体培养基中，在28℃、120 r/min的条件下培养24小时得到菌悬液。
[0052] 以上两种方式制得的菌悬液均可以作为种子培养液使用，进行本实施例的降解聚乙烯塑料并进行扫描电镜表面形态的测定和官能团的测定均采用第一种方式制得菌悬液。
[0053] 活性测试液体培养基配方（/L）：0.7 g的K2HPO4，0.7 g的KH2PO4，1.0 g的NH4NO3，0.1 g的CaCl2，0.02 g的FeSO4，0.15 g的酵母浸粉，1000 mL的天然陈化海水，pH调至7.0；
121℃高压灭菌20分钟，待冷却至室温后，按2 g/L加入长和宽均为1 cm的事先经过无菌处理的聚乙烯塑料薄膜，所述无菌处理的方法为将聚乙烯塑料薄膜用2% SDS浸泡2 h，再用
75%的酒精浸泡2 h，无菌水冲洗3次。
121℃高压灭菌20分钟，待冷却至室温后，按2 g/L加入长和宽均为1 cm的事先经过无菌处理的聚乙烯塑料薄膜，所述无菌处理的方法为将聚乙烯塑料薄膜用2% SDS浸泡2 h，再用
75%的酒精浸泡2 h，无菌水冲洗3次。
[0054] 2、扩大培养降解聚乙烯塑料
[0055] 将上述种子培养液按照10%的接种量接种到事先按2 g/L的量加入了长宽均为1 cm的无菌聚乙烯塑料薄膜的活性测试液体培养基中并以此为实验组，再以不接菌的事先按2 g/L的量加入了聚乙烯塑料薄膜的活性测试液体培养基为对照组，所述实验组和对照组的聚乙烯薄膜均事先恒重称量得到聚乙烯薄膜的初始重量；实验组和对照组每组设置3个平行，在28℃、120 r/min的条件下培养20天后，测定聚乙烯塑料薄膜的失重情况、表面形态变化、官能团变化等。
[0056] 3、定量和定性表征聚乙烯薄膜降解效果
[0057] 1）聚乙烯薄膜降解速率定方法：将上述实验组和对照组中的聚乙烯薄膜经5% SDS清洗振荡清洗5 h，超声波清洗30 min，再用75%的酒精浸泡2小时，最后用无菌水冲洗3次，放置40℃烘箱干燥24 h后恒重称量，得到细菌降解后的聚乙烯薄膜重量。降解速率按照下列公式计算：降解速率=（聚乙烯薄膜的初始重量‑细菌降解后的聚乙烯薄膜重量）/培养液体积·降解时间。
[0058] 经过居海胆杆菌MY08菌株处理20天后，塑料薄膜的降解速率为750±6 mg/d•m3，而对照组并未出现质量变化，说明居海胆杆菌MY08能够有效降解聚乙烯塑料。
[0059] 2）聚乙烯薄膜的表面形态观察：分别取上述实验组和对照组的聚乙烯塑料薄膜按照上述1）中相同的做法进行清洗和干燥，再分别溅射喷金140 s制备电镜观察样品，并通过场发射扫描电子显微镜在束流40 mA和加速电压5 kV条件下观察其表面形态，如图4 5所~示，图4为对照组的聚乙烯塑料薄膜的表面形态图，图5为实验组的聚乙烯塑料薄膜的表面形态图。由图4 5可知，实验组的聚乙烯塑料薄膜表面变得粗糙，并且出现明显的侵蚀孔洞，~
而未经细菌处理的对照组的聚乙烯塑料薄膜表面没有被侵蚀的痕迹。
而未经细菌处理的对照组的聚乙烯塑料薄膜表面没有被侵蚀的痕迹。
[0060] 3）聚乙烯薄膜官能团测定：分别取上述实验组和对照组的聚乙烯塑料薄膜按照上述1）中相同的做法进行清洗和干燥，通过傅立叶红外变换仪以ATR模式进行测定，波数范围‑1 ‑1 ‑14000 cm 400 cm ，扫描次数32次，分辨率4 cm 。测定结果如图6所示，图6为实验组和对~ ‑1
照组的聚乙烯塑料薄膜的红外光谱图；红外谱图显示，与对照组相比，实验组在1610 cm 处‑1 ‑1
引入了羧基键（COO‑）不稳定极性官能团，在2840 cm 和2910 cm 处的碳氢键（CH2‑）对称伸缩振动的吸收峰减弱，主链CH2‑结构式减少，主链有被切断可能性，表明实验组中MY08对聚乙烯薄膜存在化学降解作用。
照组的聚乙烯塑料薄膜的红外光谱图；红外谱图显示，与对照组相比，实验组在1610 cm 处‑1 ‑1
引入了羧基键（COO‑）不稳定极性官能团，在2840 cm 和2910 cm 处的碳氢键（CH2‑）对称伸缩振动的吸收峰减弱，主链CH2‑结构式减少，主链有被切断可能性，表明实验组中MY08对聚乙烯薄膜存在化学降解作用。
[0061] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。