一株东北林蛙源蛙病毒FV3毒株及其应用

摘要

本发明涉及动物病毒分离方法领域，具体公开了一株东北林蛙源蛙病毒FV3毒株及其应用，所述蛙病毒FV3毒株保藏编号为：CGMCC NO.18531，保藏日期为：2019年09月02日。本发明获得的蛙病毒FV3毒株是一株未见报道的与已知FV3存在区别的野毒株，与FV3标准株的一致性达到了99％。

权利要求

1.一株东北林蛙源蛙病毒FV3毒株，其特征在于，所述FV3毒株保藏编号为：CGMCC NO.18531，保藏日期为：2019年09月02日。

2.一种权利要求1所述的东北林蛙源蛙病毒FV3毒株在制备疫苗中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疫苗为防治两栖类种群感染蛙病毒致病致死的流行病的疫苗。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述疫苗为全病毒灭活疫苗、减毒疫苗或基因工程疫苗。

说明书

一株东北林蛙源蛙病毒FV3毒株及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及动物病毒分离方法领域，具体涉及一株东北林蛙源蛙病毒FV3毒株及其应用。

背景技术

[0002] 蛙病毒(FV3)是虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属的模式病毒，是一种大型核质类DNA病毒(Nucleocytoplasmic Large DNA Viruses,NCLDV)，该科由五个属组成：⑴感染无脊椎动物的绿虹彩病毒属(Chloriridovirus)；⑵虹彩病毒属(Iridovirus)；⑶感染冷水脊椎动物的蛙病毒属(Ranavirus)；⑷肿大细胞虹彩病毒属(Megalocytivirus)；⑸淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)。其中蛙病毒属感染的宿主广泛。目前国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)将蛙病毒属的成员分为六种，包括该属的模式种类——蛙病毒3(Frog virus 3,FV3)；虎纹蝾螈病毒(Ambystoma tigrinum virus,ATV)；纹汀蛙虹彩病毒(Bohle iridovirus,BIV)；流行性造血器官坏死症病毒(Epizootic hematopoietic necrosis virus,EHNV)；欧洲鲶鱼病毒(European catfish virus,ECV)和桑堤‑库伯蛙病毒(Santee‑Cooper ranavirus，SCRV)。此外，还有一些没有被ICTV虹彩病毒研究组认证为独立种的远缘蛙病毒，例如新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)；石斑鱼虹彩病毒(grouper iridovirus,GIV)；普通产婆蟾蛙虹彩病毒(common midwife toad virus，CMTV)；大鲵虹彩病毒(Andrias davidianus ranavirus,ADRV；又名Chinese giant salamander iridovirus,GSIV)等等。

[0003] 自1966年Allan Granoff首次从美国中西部的北部豹蛙(Lithobates pipiens)体内分离到蛙病毒属的模式种——蛙病毒3(Frog virus 3,FV3)后，FV3成为了虹彩病毒科和蛙病毒属中的代表株。蛙病毒分布于全球除南极洲以外的六个大洲，32个国家。目前蛙病毒在全球范围内的已知地理分布和宿主范围仍在扩大。尽管在发现后的几十年中人们对FV3进行了深入的研究，但两栖动物的病原并没有受到重视。20世纪90年代早期，第二种蛙病毒——纹汀蛙虹彩病毒(Bohle iridovirus,BIV)从澳大利亚的养殖动物种分离出来，与此同时，在美国和英国的西南部也恰巧发生两栖动物的严重致死性疾病的流行，两栖类动物疾病才逐渐受到重视，但是这一疾病的病原直到90年代中期才被确认是蛙病毒。随后蛙病毒的爆发病例呈指数型增长，90％的病例都出现于2010年以后。目前，蛙病毒已经成为了两栖类种群健康的严重威胁，全球报道了18个属，超过107种两栖动物感染蛙病毒的案例，随着对两栖动物疾病状况监测的完善，这一数据还在增加中。

[0004] 最近，FV3在中国的淡水鱼类孵化场中多次被发现。蛙病毒病的流行多集中于夏季，包含了蝌蚪发育晚期及变态早期的阶段；发病迅速，死亡快，数百甚至数千只正常的蝌蚪会在发病后几天内出现90％的死亡；Wheelwright等人报道，曾出现至少20万只蝌蚪在24小时内全部死亡。这种季节性、快速死亡的病例在欧洲、亚洲、南美和中美洲的野生两栖类种群中也有发生，并且养殖种群的病例也都符合这些特点。蛙病毒病不仅对我国的蛙类养殖业和出口贸易造成了严重损失，而且对生态健康也构成了威胁。我国在蛙病毒的防控中尚无疫苗免疫措施。积极开展流行病学调查，密切追踪FV3的分子进化和抗原变异，选择免疫保护性好的病毒疫苗株，才能保证疫苗良好的免疫效果。

[0005] 蛙病毒属内有11个已知全基因组序列的成员，根据其26个核心基因进行系统发育分析，可将蛙病毒属划分为四个分化完全的类别：(1)TFV/FV3/BIV病毒；(2)CMTV/ADRV病毒；(3)ATV/EHNV病毒；(4)SGIV/GIV病毒。此外，由于蛙病毒全基因组的序列信息还在不断地更新和增加中(例如一些存在于完全不同种类的宿主上的蛙病毒)，因此还有可能会增加新的类别。需要注意的是，在蛙病毒类别分析的研究中，宿主范围尚未明确界定，因此，尚待利用系统发育分析对新发现的蛙病毒进行鉴定和分类研究。

发明内容

[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供了一株东北林蛙源蛙病毒FV3毒株及其应用，所述蛙病毒FV3毒株保藏编号为：CGMCC NO.18531。本发明获得的蛙病毒FV3毒株是一株未见报道的与已知FV3存在区别的野毒株，与FV3标准株的一致性达到了99％。

[0007] 本发明的第一个目的提供一株东北林蛙源蛙病毒FV3毒株，所述FV3毒株保藏编号为：CGMCC NO.18531，保藏日期为：2019年09月02日，保藏地址为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

[0008] 进一步地，所述FV3毒株在鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)中高滴度增殖，病毒滴度TCID50为‑7.23110 /0.1mL。

[0009] 进一步地，所述FV3毒株病毒粒子大小为140‑190nm，正六边形，在细胞中呈规则的晶格状排列。

[0010] 本发明的第二个目的是提供一种所述的东北林蛙源蛙病毒FV3毒株在制备疫苗中的应用。

[0011] 进一步地，所述疫苗为防治两栖类种群感染蛙病毒致病致死的流行病的疫苗。

[0012] 进一步地，所述疫苗为全病毒灭活疫苗、减毒疫苗或基因工程疫苗。

[0013] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

[0014] 1、本发明获得的东北林蛙源FV3/Rana dybowsky/HLJ/2013(简写为FV3)蛙病毒毒株，隶属于TFV/FV3/BIV病毒，且与FV3标准株(GenBank access No.AY548484)的一致性达到了99％，是一株未见报道的与已知FV3毒株存在区别的野毒株。

[0015] 2、本发明提供的所述的FV3/Rana dybowsky/HLJ/2013毒株的病毒粒子大小为140‑190nm，正六边形，在细胞中呈规则的晶格状排列。

[0016] 3、本发明提供的FV3/Rana dybowsky/HLJ/2013毒株可作为新毒株的快速鉴定以及分类的初步研究依据，从而为FV3蛙病毒的分子进化和流行病学研究提供资料，有作为制备相关疫苗的潜力。

[0017] 生物材料保藏信息说明

[0018] FV3/Rana dybowsky/HL J/2013，在本申请中简称为FV3毒株，已于2019年09月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18531，保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为蛙病毒。

附图说明

[0019] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0020] 图1表示本发明中蛙病毒MCP基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果示意图；其中，M代表Marker DL2000；序号1‑5代表检测的样本；“‑”表示阴性对照；

[0021] 图2表示本发明中东北林蛙源蛙病毒FV3 MCP基因的系统发育分析图；其中，G6代表本发明中分离株；

[0022] 图3表示本发明中蛙病毒LAMP检测结果；

[0023] 其中，M为100bp DNA Ladder marker；序号1‑9分别代表107个拷贝‑10‑2个拷贝；11代表阴性对照；

[0024] 图4表示本发明中LAMP染料法的检测结果图；

[0025] 其中，从左到右依次为：阳性对照，样本编号1‑6，阴性对照；

[0026] 图5表示本发明中细胞病变超微组织学电镜图；

[0027] 其中，图A表示感染蛙病毒的病变肝脏电镜图；

[0028] 图B表示正常肝脏组织电镜图；

[0029] 图6表示本发明中蛙病毒粒子在细胞内的电镜图；

[0030] 其中，图A表示蛙病毒粒子在细胞质内处于待装配状态的电镜图；

[0031] 图B表示蛙病毒粒子在细胞内完成组装的成熟病毒粒子电镜图；

[0032] 图C表示蛙病毒粒子在细胞膜处释放的电镜图；

[0033] 其中，Nu:细胞核；Cy:细胞质；M:线粒体；方框内为成熟的病毒粒子；箭头:正在出芽方式释放的病毒粒子；三角形:病毒核衣壳。

具体实施方式

[0034] 下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0035] 本发明提供了一株东北林蛙源FV3/Rana dybowsky/HLJ/2013(简写为FV3)蛙病毒毒株，并提供了该毒株的高度保守的，通常用作分类鉴定的基因——主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因全序列(Genebank Accession Number：MN368914)，可作为新毒株的快速鉴定以及分类的初步研究依据。从而为FV3蛙病毒的分子进化和流行病学研究提供资料，同时提供了该毒株的分离、鉴定的方法以及该毒株的部分生物学性质。

[0036] 实施例1

[0037] 一、蛙病毒FV3毒株的分离及鉴定

[0038] 无菌条件下取蛙病毒阳性东北林蛙肝脏和肾脏组织，按照1：10的比例加入灭菌PBS缓冲液，使用灭菌后的玻璃匀浆器将组织研磨为无明显组织块的匀浆液。将该组织匀浆液于‑20℃和室温，反复冻融三次，彻底破碎组织细胞；8,000×rpm，4℃离心30分钟后，经0.22μm的滤器过滤，获得组织匀浆液，备用。取生长24h(以不超过48h为限)后的单层鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)，弃培养瓶内的旧培养液，加入1ml预热的灭菌PBS缓冲液，轻柔摇晃细胞瓶，洗涤细胞2次；弃PBS缓冲液后加入1‑1.5ml前述制备好的组织匀浆液，翻动细胞瓶保证组织匀浆液均匀、充分地覆盖于细胞上，放入25℃含5％ CO2培养箱中吸附1小时，期间每隔20分钟将细胞培养瓶轻轻摇晃数下，以防止组织匀浆液不均匀吸附；1小时后弃组织匀浆液，加入5ml病毒维持液(98％ MEM+2％ FBS)，于25℃，5％ CO2低温培养箱中培养，pH值6.8‑7.2，每日观察细胞状态。观察EPC细胞出现80％的细胞病变(CPE)后，将细胞培养瓶置于‑80℃和室温环境下反复冻融三次，取瓶内的细胞培养液至15ml离心管中，8,000×rpm在4℃的低温条件下离心10分钟，所得到的上清液即为东北林蛙蛙病毒的分离毒种(病毒原液)，采用：⑴对得到的病毒原液利用DNA病毒提取试剂盒及PCR kit进行聚合酶链反应(PCR)检测；⑵对PCR产物进行测序鉴定；⑶对细胞病变进行亚显微组织学(高倍光镜)观察；⑷对细胞病变进行超微组织学(电镜)观察，确认其各种性质，鉴定为感染病毒为蛙病毒。

[0039] 若首次接种的组织匀浆液5天后仍未出现明显的CPE，则采用上述方法收集细胞培养液进行第二次的盲传，直至盲传出现CPE，按照上述方法收集病毒。

[0040] 根据蛙病毒检测常用的MCP基因，采用世界动物卫生组织推荐的蛙病毒引物，进行扩增，扩增长度约500bp左右。优化PCR反应体系和循环参数，扩增MCP基因片段(如图1)。PCR产物进行胶回收，测序。为了保证测序结果的准确性，挑选3个PCR产物进行测序，该病毒的主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因序列(Genebank Accession Number：MN368914)，隶属于TFV/FV3/BIV病毒，且与FV3标准株(GenBank access No.AY548484)的一致性达到了99％(如图2)，因此，这是一株未见报道的与已知FV3毒株存在区别的野毒株。

[0041] 发明人对该毒株进行了生物保藏，其保藏编号为：CGMCC NO.18531，保藏日期为：2019年09月02日。

[0042] 1、病毒的LAMP鉴定

[0043] 利用在线LAMP引物设计软件(PrimerExplorerV3)，根据蛙病毒标准株(FV3)的主要衣壳蛋白(MCP)基因序列设计引物，优化东北林蛙蛙病毒的LAMP反应体系，62℃反应30分钟。⑴将扩增产物琼脂糖电泳观察；⑵将0.2μL工作浓度的SYBR Green加入反应体系，于紫外灯下观察颜色变化判断结果。

[0044] 结果如图3和图4所示，细胞培养液中含有FV3病毒。

[0045] 从图4可以看到，阳性对照和1‑4号均显示为绿色，即为阳性。

[0046] 2、FV3毒株MCP基因序列的测定

[0047] (1)引物设计

[0048] 根据蛙病毒检测常用的MCP基因，采用Mao等人所设计的蛙病毒引物，所述引物为RV‑P1引物(序列如SEQ ID NO.1所示)和RV‑P2引物(序列如SEQ ID NO.2所示)；

[0049] SEQ ID NO.1：GACTTGGCCACTTATGAC

[0050] SEQ ID NO.2：GTCTCTGGAGAAGAAGAA

[0051] (2)病毒DNA 的提取

[0052] 以含毒的细胞培养液为DNA提取的材料，按照组织微量基因组DNA试剂盒(海基生物科技有限公司)说明书进行操作。

[0053] (3)MCP基因的PCR

[0054] 使用天根生化科技(北京)公司2×Taq PCR MasterMix(含染料)Kit，反应体系为20ul：RNase FreedH2O 8.2μl，2×Taq Mix 10μl，RNA样品1μl，上下游引物各0.4μl。RT‑PCR反应条件为：94℃,5min预变性；94℃,30sec变性，；55℃30sec退火；72℃,30sec延伸；最后
72℃延伸5min；共35个循环，4℃结束反应。

[0055] (4)扩增产物的回收纯化

[0056] PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，按Gel Extraction kit的说明回收和纯化核酸。

[0057] (5)FV3分离株MCP基因片段的序列测定及分析

[0058] 每个片段分别送三个公司测序(英潍捷基(上海)贸易有限公司，北京华大，北京迪安百泰公司)。

[0059] MCP基因片段概况及系统进化分析所使用的序列区域，MCP基因的长度、蛋白编码情况以及系统进化分析所使用的核酸范围如SEQ ID NO.3所示：

[0060] SEQ ID NO.3：

[0061] GGTCGGA‑GCCACCACGTACTTTGTCAAGGAGCACTACCCCGTGGGGTGGTTCACCAAGCTGCCGTCTCTGGCTGCCAAGATGTCGGGTAACCCGGCTTTCGGGCAGCAGTTTTCGGTCGGCGTTCCCAGGTCGGGGGATTACATCCTCAACGCCTGGTTGGTGCTCAAGACCCCCGAGGTCGAGCTCCTGGCTGCAAACCAGCTGGGAGACAATGGCACCATCAGGTGGACAAAGAACCCCATGCACAACATTGTGGAGAGCGTCACCCTCTCATTCAACGACATCAGCGCCCAGTCCTTTAACACGGCATACCTGGACGCCTGGAGCGAGTACACCATGCCAGAGGCCAAGCGCATAGGCTACTATAACATGATAGGCAACACCAGCGATCTCATCAACCCCGCCCCGGCCACAGGCCAGGACGGAGCCAGGGTCCTCCCGGCCAAGAACCTGGTTCTTCCCCTCCCATTCATCTTCTCCAGAGACAA

[0062] 3、实验毒株MCP基因的进化树构建

[0063] 如图2所示，该病毒的MCP基因序列(Genebank Accession Number：MN368914)，隶属于TFV/FV3/BIV病毒，且与FV3标准株(GenBank access No.AY548484)的一致性达到了99％。

[0064] 二、蛙病毒FV3毒株的特性分析

[0065] 1、病毒在鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)中的生长特性：该病毒在鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)中可高滴度生长。

[0066] 2、毒株TEID50的测定，将毒株10倍系列稀释后，各取0.1ml接种鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)，其具体的滴度测定如表1所示。

[0067] 表1东北林蛙蛙病毒滴度的计算

[0068]

[0069] 实验结果得到：病毒滴度TCID50为10‑7.231/0.1mL。

[0070] 实施例2

[0071] 一、感染了蛙病毒的东北林蛙的肝脏、肾脏、皮肤细胞病变观察。

[0072] 1、细胞病变亚显微组织学，对感染了蛙病毒的东北林蛙的肝脏、肾脏、皮肤等进行了组织切片和HE染色，在光学显微镜下对其进行观察。结果如图5所示，感染蛙病毒的病变肝脏可见多处大的坏死灶，肝血窦扩张淤血，肝血细胞质可见空泡变性(图5，图A)，而正常肝脏组织的肝细胞排列规则，胞质流转，可见棕黄色色素沉积(图5，图B)；病变的肾脏组织检查发现，肾小球充满粉染物，肾小管上皮细胞可见空泡变性，少量上皮细胞凋亡，间质淋巴细胞浸润；对病变皮肤进行观察发现，表皮细胞空泡变性，四周见空晕。

[0073] 2、细胞病变超微组织学(电镜)观察，取已出现30％典型CPE的EPC细胞，经由常规的细胞消化操作，避免使用含EDTA的胰酶消化液，将消化下来的细胞经1000×rpm离心5分钟，得到细胞沉淀后贴壁缓慢加入电镜固定液(由2.5％的戊二醛和磷酸缓冲液配制)，避免破坏细胞沉淀的形态，4℃固定2小时以上。醋酸铀‑枸橼酸铅双染色，切片完成。经透射电镜观察电镜结果。结果如图6所示，病毒粒子在镜下显示为大小基本一致，约140‑190nm之间的正六边形，且在细胞中呈规则的晶格状排列，可确定该病毒即为蛙病毒。镜下细胞质中的低电子区域即为病毒的装配区，在装配区可见到部分等待被组装的病毒核衣壳(图6，图A)，而完成组装的成熟病毒粒子则以晶格状排列的方式大量聚集在细胞中(图6，图B)；在细胞膜附近，可见到部分成熟的病毒粒子正在以出芽方式从细胞中释放((图6，图C)。

[0074] 尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

[0075] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。