一种果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及体外诊断技术领域，尤其是一种果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt及其制备方法和应用，其蛋白序列如SEQ ID No：1所示，编码该果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt的基因核酸序列如SEQ ID No：2所示。本发明的果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt，其催化能力较野生型提高了2倍左右，使其用量降低约50％，大大降低了人体血糖检测成本，将有利于改进果糖赖氨酸氧化酶的人体血糖水平的检测水平，提高试剂的反应灵敏度，提升试剂的在机稳定性，延长了试剂使用的寿命，提高了检测终端的试剂利用率，大大降低了使用成本，实现了产品高效环保生产。

权利要求

1.一种果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt，其特征在于：其蛋白序列如SEQ ID No：1所示。

2.一种编码权利要求1所述果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt的基因，其特征在于：其核酸序列如SEQ ID No：2所示。

3.一种含权利要求2所述基因的重组表达菌株。

4.权利要求3所述重组表达菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）突变体FODt编码基因的获得

以Aspergillus terreus中FODw的cDNA为模板，以引物281F、281R、411F、411R、FODtF和FODtR在氨基酸序列中引入P281E、F411R两处突变位点；其中，引物281F、281R、411F、411R、FODtF和FODtR的序列如SEQ ID No：3‑8所示；

以PCR方式扩增并获得突变体FODt编码基因，并在全长序列扩增时引入Eco RI和Not I两处酶切位点；

PCR反应体系50 μL，反应条件为：95℃预变性2 min，随后进行95℃20s，57℃20s，72℃

1.5 min，30个循环；反应结束后取10μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测；以AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒将FODt目的片段回收；

（2）重组质粒的构建

以Eco RI和Not I两种限制内切酶分别在37℃中酶切FODt目的片段和pPIC9K载体，通过AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒将两组酶切产物回收后，各取50‑100 ng回收产物混合后加入T4连接酶，于16℃环境中将FODt编码基因正向插入pPIC9K的Eco RI和Not I酶切位点之间，获得重组质粒；

（3）突变体FODt重组表达菌株的构建

将重组质粒转入E.coli BL21（DE3）感受态细胞中，吸取适量转化产物涂布于LB平板在

20‑37℃培养；待长出菌落后，随机挑取部分单克隆，验证阳性克隆；将阳性克隆接种于含有

5mL液体LB的试管中，于20‑37℃、100‑220 rpm进行过夜培养后，收取菌体并提取质粒；以Sac I限制性内切酶将3‑6μg的重组质粒于37℃中充分单酶切，获得线性化质粒，AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒将线性化质粒回收；

将回收后线性化的重组质粒以电转方式转入P. pastoris GS115感受态细胞中，于20‑

30℃中以YPD平板进行培养，挑取单菌落并验证阳性克隆，获得FODt重组表达菌株；将获得的重组菌株挑至BMGY培养基中于20‑30℃、100‑220 rpm条件培养后保存于10‑30%的甘油管中，放置于‑80℃中以保菌。

5.权利要求1所述果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt的制备方法，其特征在于：将权利要求3所述的重组表达菌株接种于种子液体培养基中进行发酵，在20‑30℃、

100‑220 rpm/min条件下培养至菌体OD600=2～8；将菌体离心后，用发酵液体培养基重悬细胞至OD600=0.5‑2.0，每隔24 h加入甲醇使其中甲醇浓度为0.3‑2.0%；将诱导后的发酵液离心后获得上清液，即为果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt粗酶液；

将粗酶液在4‑10℃、0.1‑0.5 MPa条件下进行浓缩超滤，获得浓缩粗酶液；随后以磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲液，在4‑10℃进行透析三次；再以DEAE‑SepharoseFast Flow阴离子交换柱对果糖赖氨酸氧化酶进行纯化，获得突变体FODt蛋白，并以凝胶电泳检测蛋白纯度。

6.根据权利要求5所述果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt的制备方法，其特征在于：所述种子液体培养基为BMGY，其溶剂为pH值3.5‑6.5、0.1 M的PBS缓冲液，溶质及其浓度为：Yeast ‑4Extract 10g/L、Tryptone 20 g/L、YNB 13.4 g/L、甘油10 g/L、生物素4×10 g/L。

7.根据权利要求5所述果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt的制备方法，其特征在于：所述发酵液体培养基为BMM，其溶剂为pH值3.5‑6.5、0.1 M的PBS缓冲液，溶质及其浓度为：YNB ‑4

13.4 g/L、甲醇5 g/L、生物素4×10 g/L。

8.权利要求1所述的果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt或权利要求5‑7任一项所述方法制备的果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt在制备血糖检测试剂或试剂盒中的应用。

说明书

一种果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及体外诊断技术领域，具体领域为一种果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 果糖胺是人体中的葡萄糖与血浆中的蛋白发生非酶糖化过程中形成的高分子酮胺结构类似物，它的浓度和人体血糖浓度呈正相关性，因此其含量可反应人体血糖总体水平。人体血浆蛋白的半衰期是17‑20天，因此，果糖胺可以反应人体2‑3周平均血糖水平，是快速反应人体短期血糖水平的精准指标，尤其适用于对血糖波动较大的脆性糖尿病及妊娠糖尿病患者。

[0003] 果糖胺的主要成分是糖化白蛋白，还包括糖化球蛋白、脂蛋白、氨基酸等。果糖胺的测定结果受到多种蛋白、胆红素、乳糜、低分子物质的影响，不够稳定。但是糖化白蛋白(Glycated Albumin，GA)只测量血液中糖化白蛋白一种物质的量，不受其他成分的影响，它的结构十分稳定，且不受高脂血压、血红蛋白病和年龄的影响，因此作为指示物用于检测人体血糖含量。GA测定方法操作简单，结果也比较准确，取样时不受饮食的限制，是作为糖尿病人的诊断、治疗和预防的一个理想监测指标，尤其是对糖尿病患者短期内血清葡萄糖控制情况及药物疗效方面有重要意义，可以及时诊断暴发性的糖尿病，因此在糖尿病预防和诊断中具有重要的应用价值。

[0004] 目前，临床上对于人体果糖胺浓度测定有如下方法：苯肼法、果糖法、亲和色谱法、硝基四氮唑蓝(NBT)法、糖醛法及果糖赖氨酸氧化酶法。其中，果糖赖氨酸氧化酶法检测血糖水平具有特异性高、精密度好、抗干扰能力强、线性范围宽等优点，能够较好满足临床需求，是很有前途的人体血糖水平的检测方法。

[0005] 在开发测定人体糖化白蛋白试剂盒的过程中，发明人研究团队发现因检测试剂的特殊性，需果糖赖氨酸氧化酶具有更高的稳定性、催化活性及血液耐受性，以便于试剂的长期保存运输和血液检测的灵敏和高效性。但目前果糖赖氨酸氧化酶的性质仍有不足，且多为欧美等国进口产品，价格昂贵，检测灵敏度、快捷性不能满足临床需求。

[0006] 因此，筛选可在长期保存、血液复杂成分等条件下发挥催化活性的果糖赖氨酸氧化酶，是改进已有酶法检测人体血糖水平用于糖尿病诊断治疗的关键，对提高试剂检测的灵敏度、稳定性以及节约生产成本、实现产品高效环保生产具有重要的意义。

发明内容

[0007] 针对现有技术中果糖赖氨酸氧化酶相关研究较少，且存在稳定性差、血液催化活力低等缺点，本发明提供了一种果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt及其制备方法和应用。

[0008] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0009] 本发明以土曲霉(Aspergillus terreus)的果糖赖氨酸氧化酶野生型FODw为出发蛋白，通过半理性设计构建突变文库，对酶性质进行改良，以酶活为评价标准筛选获得突变体酶命名为FODt，其催化活力相比野生型酶提高2.0倍。该突变体提高了果糖赖氨酸氧化酶的应用能力，降低了人体血糖酶法检测的成本，有利于改进酶法检测工艺，为解决现有酶法检测血清糖化白蛋白中的问题提供l研究基础。

[0010] 一种果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt，其蛋白序列如SEQ ID No：1所示。

[0011] 一种编码上述果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt的基因，其核酸序列如SEQ ID No：2所示。

[0012] 含有上述基因的重组表达菌株的构建方法，包括以下步骤：

[0013] (1)突变体FODt编码基因的获得

[0014] 以Aspergillus terreus中FODw的cDNA为模板，以如下引物281F、281R、411F、411R、FODtF和FODtR(下划线为突变位点序列)在氨基酸序列中引入P281E、F411R两处突变位点；其中，引物281F、281R、411F、411R、FODtF和FODtR的序列如SEQ ID No：3‑8所示；

[0015] 281F：TGAACATGAGGGCTATACCAAT

[0016] 281R：ATTGGTATAGCCCTCATGTTCA

[0017] 411F：GGGCCGCCGAGGTGGTCCA

[0018] 411R：TGGACCACCTCGGCGGCCC

[0019] FODtF：CGGAATTCATGCCGGTGACCAAAAGCAG(下划线为Nde I识别序列)[0020] FODtR：AAGCGGCCGCCAGTTTGCTAATATCGCGCT(下划线为XhoI识别序列)[0021] 以PCR方式扩增并获得突变体FODt编码基因，并在全长序列扩增时引入Eco RI和Not I两处酶切位点；

[0022] PCR反应体系50μL，反应条件为：95℃预变性2min，随后进行95℃20s，57℃20s，72℃1.5min，30个循环；反应结束后取10μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测；以AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒通过切胶等操作将FODt目的片段回收；

[0023] (2)重组质粒的构建

[0024] 以Eco RI和Not I两种限制内切酶分别在37℃中酶切FODt目的片段和pPIC9K载体1‑7个小时，通过AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒将两组酶切产物回收后，各取50‑100ng回收产物混合后加入T4连接酶，于16℃环境中将FODt编码基因正向插入pPIC9K的Eco RI和Not I酶切位点之间，获得重组质粒；

[0025] (3)突变体FODt重组表达菌株的构建

[0026] 通过化转方法将重组质粒转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，吸取适量转化产物涂布于LB(含100mg/L氨苄青霉素)平板在20‑37℃培养；待长出菌落后，随机挑取部分单克隆，验证阳性克隆；将阳性克隆接种于含有5mL液体LB(含100mg/L氨苄青霉素)的试管中，于20‑37℃、100‑220rpm进行过夜培养后，收取菌体并提取质粒；以Sac I限制性内切酶将3‑6μg的重组质粒于37℃中充分单酶切，获得线性化质粒，AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒将线性化质粒回收；

[0027] 将回收后线性化的重组质粒以电转方式转入P.pastoris GS115感受态细胞中，于20‑30℃中以YPD平板进行培养，挑取单菌落并验证阳性克隆，获得FODt重组表达菌株；将获得的重组菌株挑至BMGY培养基中于20‑30℃、100‑220rpm条件培养后保存于10‑30％的甘油管中，放置于‑80℃中以保菌。

[0028] 本发明的果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt的制备方法，具体为：

[0029] 将上述的重组表达菌株接种于种子液体培养基中进行发酵，在20‑30℃、100‑220rpm/min条件下培养至菌体OD600＝2～8；将菌体离心后，用发酵液体培养基重悬细胞至OD600＝0.5‑2.0，每隔24h加入甲醇使其中甲醇浓度为0.3‑2.0％；将诱导后的发酵液离心后获得上清液，即为果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt粗酶液；

[0030] 将粗酶液在4‑10℃、0.1‑0.5MPa条件下进行浓缩超滤，获得浓缩粗酶液；随后以pH值3.5‑6.5(更优选为pH值6.5)、浓度为20mM的磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲液，在4‑10℃进行透析三次；再以DEAE‑Sepharose Fast Flow阴离子交换柱对果糖赖氨酸氧化酶进行纯化，获得突变体FODt蛋白，并以凝胶电泳检测蛋白纯度。

[0031] 其中，所述种子液体培养基为BMGY，其溶剂为pH值3.5‑6.5、0.1M的PBS缓冲液，溶质及其浓度为：Yeast Extract 10g/L、Tryptone 20g/L、YNB 13.4g/L、甘油10g/L、生物素4‑4×10 g/L。

[0032] 其中，所述发酵液体培养基为BMM，其溶剂为pH值3.5‑6.5、0.1M的PBS缓冲液，溶质‑2 ‑4及其浓度为：YNB 13.4g/L、甲醇5g/L、硫酸铜1.5×10 g/L、生物素4×10 g/L。

[0033] 本发明的果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt可用于制备血糖检测试剂或试剂盒。通过检测人体血清中糖化白蛋白的浓度，反应出受检者近期血糖水平。

[0034] 首先用对白蛋白有特异性的蛋白酶将样本中的糖化白蛋白分解为氨基酸片段，果糖赖氨酸氧化酶能够特异性氧化葡萄糖与赖氨酸残基间的酮胺键，同时有H2O2生成，H2O2与显色底物在过氧化物酶的作用下生成显色物，颜色的深浅与糖化白蛋白成正比，颜色的变化来定量指示血糖的浓度。

[0035] 在1mL反应体系中，将FODt与适当浓度的糖化白蛋白在辣根过氧化物酶(0.02U)和10‑乙酰基‑3,7‑二羟基吩嗪(50μM)存在混合，于30℃环境中反应10分钟后，在590nm处检测吸光值变化。定义1个单位酶的酶活(U)为在30℃和底物饱和浓度下产生1mmoL过氧化氢所需的酶量，同时以野生型FODw氧化等量的糖化白蛋白为对照。

[0036] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0037] 本发明的果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt，其催化能力较野生型提高了2倍左右，使其用量降低约50％，大大降低了人体血糖检测成本，将有利于改进果糖赖氨酸氧化酶的人体血糖水平的检测水平，提高试剂的反应灵敏度，提升试剂的在机稳定性，延长了试剂使用的寿命，提高了检测终端的试剂利用率，大大降低了使用成本，实现了产品高效环保生产。

附图说明

[0038] 图1为果糖赖氨酸氧化酶FODt纯化后电泳检测，M为蛋白Maker，FODt为混合后果糖赖氨酸氧化酶纯蛋白，FODw为等量发酵液纯化后的纯蛋白条带，目标条带果糖赖氨酸氧化酶纯度较高，其大小约为40kDa。

[0039] 图2为果糖胺氧化酶催化反应定标曲线，A：实验组FODt催化反应定标曲线；B：对照组FODw催化反应定标曲线。

[0040] 图3为果糖胺氧化酶催化反应线性相关性验证，A：实验组FODt催化反应线性相关性曲线；B：对照组FODw催化反应线性相关性曲线。

具体实施方式

[0041] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0042] 菌株：大肠杆菌E.coli BL21(DE3)

[0043] 表达载体：pPIC9K

[0044] 培养基：

[0045] YPD培养基(1L)：20g Peptone，10g Yeast Extract溶于900mL水中，高压灭菌后，加入100mL 10×D，固体培养基添加1.5％的琼脂。

[0046] 种子液体培养基BMGY的溶剂为pH值6.0、0.1M的PBS缓冲液，溶质及其浓度如下：‑4
Yeast Extract 10g/L、Tryptone 20g/L、YNB 13.4g/L、甘油10g/L、生物素4×10 g/L。

[0047] 发酵液体培养基BMM的溶剂为pH值6.0、0.1M的PBS缓冲液，溶质及其浓度如下：YNB ‑413.4g/L、甲醇5g/L、生物素4×10 g/L。

[0048] 实施例1突变体FODt编码基因的获得及重组质粒的构建

[0049] 以Aspergillus terreus中FODw的cDNA为模板，以如下引物(下划线为突变位点序列)在氨基酸序列中引入P281E、F411R两处突变位点。序列分别如SEQ ID NO：3‑8所示。

[0050] 281F：TGAACATGAGGGCTATACCAAT

[0051] 281R：ATTGGTATAGCCCTCATGTTCA

[0052] 411F：GGGCCGCCGAGGTGGTCCA

[0053] 411R：TGGACCACCTCGGCGGCCC

[0054] FODtF：CGGAATTCATGCCGGTGACCAAAAGCAG(下划线为Nde I识别序列)[0055] FODtR：AAGCGGCCGCCAGTTTGCTAATATCGCGCT(下划线为XhoI识别序列)[0056] 以常规PCR方式扩增并获得突变体FODt编码基因(如SEQ ID NO:2所示)，并在全长序列扩增时引入Eco RI和Not I两处酶切位点。PCR反应体系50μL，反应条件为：95℃预变性2min，随后进行30个循环(95℃20s，57℃20s，72℃1.5min)，反应结束后取10μL PCR产物经
1％琼脂糖凝胶电泳检测。以AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒通过切胶等操作将FODt目的片段回收。

[0057] 以Eco RI和Not I两种限制内切酶分别在37℃中酶切FODt目的片段和pPIC9K载体7个小时，通过AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物，各取50ng回收产物混合后加入T4连接酶，于16℃环境中将FODt编码基因正向插入pPIC9K的Eco RI和Not I酶切位点之间，获得重组质粒。

[0058] 实施例2突变体FODt重组表达菌株的构建

[0059] 将重组质粒转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中于，转化产物涂板于LB(含100mg/L氨苄青霉素)平板在37℃培养。随机挑取部分单克隆，以菌落PCR方式验证阳性克隆。将阳性克隆接种于含有5mL液体LB(含100mg/L氨苄青霉素)试管中，于37℃、200rpm进行过夜培养后，收取菌体并提取质粒。以Sac I限制性内切酶将5μg的重组质粒于37℃中充分单酶切线性化，以AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒将线性化质粒回收。

[0060] 将回收后线性化的重组质粒以电转方式转入P.pastoris GS115感受态细胞中，于28℃中以YPD平板进行培养，挑取单菌落并验证阳性克隆，获得FODt重组表达菌株Pichia pastoris/pPIC9K‑FODt。将获得的重组菌株挑至BMGY培养基中于28℃、200rpm条件培养后保存于20％的甘油管中，放置于‑80℃中以保菌。

[0061] 实施例3发酵培养

[0062] 在28℃、200rpm条件下，将保存于甘油管中的实施例2的重组表达菌株Pichia pastoris/pPIC9K‑FODt接种于含50mL液体BMGY培养基的250mL摇瓶中培养至菌体生物量OD600值约8.0，离心后取菌体，以100mL发酵液BMM液体培养基重悬菌体，至菌体OD600值为1.0，继续培养并每隔24小时添加甲醇使其中甲醇浓度为0.5％。

[0063] 实施例4粗酶液获得

[0064] 连续检测FODt活力开始下降时，结束发酵并收集发酵液，在4℃、12000rpm下离心15分钟，弃沉淀收集上清液1L，即为FODt粗酶液，在4℃、0.3MPa条件下对粗酶液进行浓缩超滤，获得FODt浓缩粗酶液30mL。以3L磷酸氢二钠‑柠檬酸(pH 6.0，20mM)为透析缓冲液，在4℃环境中进行透析更换FODt缓冲体系。每隔5h更换一次透析缓冲液，连续透析三次，获得FODt粗酶液约31mL。

[0065] 实施例5果糖赖氨酸氧化酶FODt的纯化

[0066] 以阴离子交换柱：DEAE‑Sepharose Fast Flow纯化果糖赖氨酸氧化酶，配制纯化溶液：

[0067] 低盐：20mM磷酸氢二钠‑柠檬酸pH 6.5；

[0068] 高盐：在低盐缓冲液中加入150mM的硫酸铵；

[0069] NaCl：浓度为1M的NaCl溶液500mL；

[0070] NaOH：浓度为1M的NaOH溶液500mL；

[0071] 乙醇：体积分数为20％乙醇溶液1L；

[0072] H2O：超纯水1L。

[0073] 将配制完成的溶液均进行抽滤后超声除气。蛋白纯化具体步骤如下：

[0074] (1)调节仪器流速1.0mL/min，安装阴离子交换柱，使用20％乙醇冲洗柱体30min；

[0075] (2)冲洗柱体，依次更换H2O→NaCl→H2O→NaOH→H2O→高盐→H2O→低盐，每次更换均冲洗30min。

[0076] (3)将透析后的FODt粗酶液上样至柱中，调节高盐浓度，依次从低到高(0％‑100％)进行洗脱蛋白，并收集洗脱液。

[0077] (4)检测：以15％的SDS‑聚丙烯酰胺凝胶(SDS‑PAGE)检测收集洗脱液中的蛋白纯度，将只含有单一目标条带的洗脱液收集混合后备用(如图1)。

[0078] 实施例6FODt和FODw催化能力的比较

[0079] 二甲基亚砜(DMSO)为溶剂，配置10‑乙酰基‑3,7‑二羟基吩嗪母液10mM。

[0080] 构建1mL反应体系：辣根过氧化物酶0.02U、10‑乙酰基‑3,7‑二羟基吩嗪50μM、果糖胺2.0mg、FODt适量，以pH6.0的磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲液补齐至1mL。体系在30℃环境中反应10分钟后，在590nm处检测吸光值变化。同时以野生型FODw氧化等量的糖化白蛋白为对照。定义1个单位的酶活(U)为在30℃下催化饱和底物产生1mmoL过氧化氢所需的酶量。

[0081] 通过产物过氧化氢和10‑乙酰基‑3,7‑二羟基吩嗪结合显色吸光值变化可反应出糖化白蛋白被氧化量，分别设置酶的不同添加量，直至1.0mg的糖化白蛋白完全氧化。此时通过计算所需酶量FODt为7.5U、FODw为15.6U。

[0082] 实施例7FODt和FODw在检测试剂中应用的比较

[0083] 将上述实施例5中制备所得的FODt以及原有的FODw应用到诊断试剂中，通过成品试剂来检测FODt改进后的效果，包括反应度、分析灵敏度、线性范围以及稳定性等方面性能的改进。

[0084] 糖化白蛋白检测试剂的原理为：首先用对白蛋白有特异性的蛋白酶将样本中的糖化白蛋白分解为氨基酸片段，果糖赖氨酸氧化酶能够特异性氧化葡萄糖与赖氨酸残基间的酮胺键，同时有H2O2生成，H2O2与显色底物在过氧化物酶的作用下生成显色物，颜色的深浅与糖化白蛋白成正比，颜色的变化来定量指示血糖的浓度。

[0085] 该检测试剂为液体双试剂，最后结果计算公式为：

[0086]

[0087] 检测试剂的配方如下：

[0088]

[0089]

[0090] 上机检测参数为：

[0091]

[0092]

[0093] 其中以FODw作为对照组，FODt作为实验组，验证FODt突变之后的效果。两组酶配制后的诊断试剂相关性能的验证结果如下：

[0094] 1、定标结果及曲线：

[0095]

[0096] 结论：改造后的FODt实验组的酶对于诊断试剂反应度的提升具有明显的作用，可证实试剂的分析灵敏度更高。

[0097] 2、试剂准确度和批内精密度的验证：

[0098] 将匹配好的试剂对厂家的质控进行重复10次的检测，观察两组实验的准确度以及批内精密度。

[0099]

[0100]

[0101] 结论：改造后的FODt实验组的酶对于诊断试剂批内精密度以及准确度的提升具有明显的作用，改造后的实验组的试剂批内精密度＜1.0％。

[0102] 3、线性范围的验证

[0103] 将实验组和对照组的试剂进行线性范围验证，根据行标和企标的要求，采用倍比稀释的模式，验证两组试剂在浓度为30‑1000μmol/L范围的线性相关性。

[0104]

[0105] 结论：实验组的线性相关性相对于对照组更优，且a值和b值较小，更能反应试剂的优越性能。对照组的线性相关性虽满足企标要求，但是b值较大，有一个较大的截距，会对检测结果有一定的修正作用，非试剂正常检测出的结果。

[0106] 4、在机稳定性的提升

[0107] 将实验组和对照组试剂分别在日立7180试剂仓内进行在机稳定性的考察，每天对两个水平的高低值进行重复2次的检测，观察试剂的在机稳定性。

[0108]

[0109] 结论：改造后的FODt酶对于提升试剂的在机稳定性非常明显，可以提高试剂的利用率，降低检测终端的试剂成本，保证试剂检测的准确度。

[0110] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。