一种基于Th17.1细胞数量及相关比值预测原发性肝癌患者预后的系统

摘要

本发明提供一种基于Th17.1细胞数量及相关比值预测原发性肝癌患者预后的系统，包括：(1)样本采集和处理模块，被设置为从所述患者获得外周血单个核细胞；(2)检测模块，被设置为针对通过所述样本采集和处理模块获得的所述外周血单个核细胞，识别并统计其中CD4+T细胞总数以及Th17和Th17.1亚群细胞数，得到Th17.1细胞在CD4+T细胞中的占比和Th17.1/Th17比值；和(3)预后判断模块，被设置为实现以下判断：将通过所述检测模块得到的Th17.1细胞在CD4+T细胞中的占比和Th17.1/Th17比值与参考值比较，所述数值低于参考值，判断所述原发性肝癌患者预后不良。本发明所述系统为临床提供一种新的预测原发性肝癌患者进展和结局的工具，从而辅助临床上对患者的治疗策略的考量。

权利要求

1.一种基于Th17.1细胞数量及相关比值预测原发性肝癌患者预后的系统，包括：(1)样本采集和处理模块，被设置为从所述患者获得外周血单个核细胞；

(2)检测模块，被设置为针对通过所述样本采集和处理模块获得的所述外周血单个核细胞，识别并统计其中CD4+T细胞总数以及Th17和Th17.1亚群细胞数，得到Th17.1细胞在CD4+T细胞中的占比和Th17.1/Th17比值；

(3)预后判断模块，被设置为实现以下判断：

将通过所述检测模块得到的Th17.1细胞在CD4+T细胞中的占比和Th17.1/Th17比值与参考值比较；若数值高于参考值，判断所述原发性肝癌患者预后良好；若数值低于参考值，判断所述原发性肝癌患者预后不良。

2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述原发性肝癌患者预后良好是指患者确诊原发性肝癌后，生存期≥1年；所述原发性肝癌患者预后不良是指患者确诊原发性肝癌后，生存期＜1年。

3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述原发性肝癌患者具有如下特征：(1)BCLC处于0‑A期，

(2)肿瘤<3cm，

(3)AFP<400ng/ml，

(4)HBsAg(+)，

(5)HBV水平<500IU/ml，和

(6)HBeAg(‑)。

4.根据权利要求1或3所述的系统，其特征在于，所述样本采集和处理模块被设置为从所述患者获得外周血，并从中分离外周血单个核细胞。

5.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述检测模块被设置为利用CD4+T细胞亚群表型的混合抗体来识别Th17和Th17.1亚群细胞数。

6.根据权利要求5所述的系统，其特征在于，所述检测模块还被设置为利用流式细胞仪来识别和收集Th17和Th17.1亚群细胞。

7.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述预后判断模块中采用的参考值为从所述原发性肝癌患者群获得的所述Th17.1细胞在CD4+T细胞中的占比和Th17.1/Th17比值的中位数。

说明书

一种基于Th17.1细胞数量及相关比值预测原发性肝癌患者预

后的系统

技术领域

[0001] 本发明属于适用于医学领域的信息处理技术领域，具体涉及一种基于Th17.1细胞数量及相关比值预测原发性肝癌患者预后的系统。

背景技术

[0002] 原发性肝癌(Primary Liver Cancer，PLC)是威胁人类健康的重大疾病之一，其中约80％‑90％均为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，其恶性程度高，侵袭性强，预后差。2021年发布的《全球癌症报告》显示，肝癌发病率居恶性肿瘤第6位，死亡率居第3位，2020年全球共有约90.6万新发病例及83万死亡病例。2000‑2014年期间，我国肝癌的发病率和死亡率每年分别下降约2.3％和2.6％，但其在恶性肿瘤中的排序仍居前列。可见，肝癌目前仍是我国乃至全球的重大公共卫生问题。

[0003] 近年来，免疫疗法已经成为肿瘤治疗的热点并被认为是抗肿瘤治疗的重要手段，为攻克肿瘤带来了新希望。肿瘤免疫疗法通过激活和增强患者现有的肿瘤特异性免疫反应来发挥作用。有证据表明肿瘤的免疫环境是影响抗肿瘤免疫疗效的重要因素，也可能成为开发新免疫疗法的潜在靶点。CD4+T淋巴细胞(CD4+T lymphocytes，CD4+T)在抗肿瘤效应的发挥和维持中起到关键作用。CD4+T细胞主要由两部分细胞组成，即辅助性T细胞(T helper cell，Th)和调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)。CD4+T细胞可分为四个主要谱系，包括Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞和Treg细胞。每个谱系都具有独特的表型特征及效应功能。并且每个谱系都可以转分化为另一个谱系，这种现象称为CD4+T细胞的可塑性。Th17细胞作为其中可塑性的代表，在肿瘤中的作用引起了研究人员的关注。与经典的Th1及Th2细胞不同，Th17细胞在肿瘤中的作用具有“两面性”。Th17细胞既能向促炎的Th1细胞转分化形成过渡表型Th17.1细胞，通过促进肿瘤血管形成和增加肿瘤免疫逃逸而产生促肿瘤作用；也能向表达Foxp3的Treg细胞转分化形成Th17/Treg细胞，通过增强自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)和细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)或通过促进T淋巴细胞的浸润而发挥抗肿瘤效应。关于Th17细胞与肿瘤预后的关系，现有技术中有不同的报道。一些研究认为，Th17细胞浸润与结直肠癌的不良预后相关(Liu J.,等.IL‑17is associated with poor prognosis and promotes angiogenesis via stimulating VEGF production of cancer cells in colorectal carcinoma.Biochem Biophys Res Commun[J].2011,407(2):348‑54)。但是Lv L.等却认为Th17细胞与食道癌更好的临床结局相关(Lv L.,等.The accumulation and prognosis value of tumor infiltrating IL‑
17producing cells in esophageal squamous cell carcinoma.PLoS One[J].2011,6(3):e18219)。

[0004] 当前预测肝癌预后的模型，除了针对肝癌的术后复发、总生存、无进展生存等结局，如巴塞罗那分级(BCLC)，肝脏储备功能Child‑Pugh分级、奥田邦雄(Okuda)分级等外，还有针对乙肝病毒感染引起的肝癌合并肿瘤相关性贫血预后的系统(公开号CN114141371A的中国发明专利申请)。

[0005] 但是尚未见到基于Th17.1细胞数量及相关比值预测原发性肝癌患者预后的系统。

发明内容

[0006] 为了克服现有技术的不足，本发明提供一种基于Th17.1细胞数量及相关比值预测原发性肝癌患者预后的系统。

[0007] 为实现上述技术效果，本发明采用了如下的技术方案：

[0008] 一种基于Th17.1细胞数量及相关比值预测原发性肝癌患者预后的系统，包括：

[0009] (1)样本采集和处理模块，被设置为从所述患者获得外周血单个核细胞；

[0010] (2)检测模块，被设置为针对通过所述样本采集和处理模块获得的所述外周血单个核细胞，识别并统计其中CD4+T细胞总数以及Th17和Th17.1亚群细胞数，得到Th17.1细胞在CD4+T细胞中的占比和Th17.1/Th17比值；

[0011] (3)预后判断模块，被设置为实现以下判断：

[0012] 将通过所述检测模块得到的Th17.1细胞在CD4+T细胞中的占比和Th17.1/Th17比值与参考值比较；若所述数值高于参考值，判断所述原发性肝癌患者预后良好，若所述数值低于参考值，判断所述原发性肝癌患者预后不良。

[0013] 优选地，所述原发性肝癌患者预后良好是指患者确诊原发性肝癌后，生存期≥1年；所述原发性肝癌患者预后不良是指患者确诊原发性肝癌后，生存期＜1年。

[0014] 优选地，所述原发性肝癌患者具有如下特征：

[0015] (1)BCLC处于0‑A期，

[0016] (2)肿瘤<3cm，

[0017] (3)AFP<400ng/ml，

[0018] (4)HBsAg(+)，

[0019] (5)HBV水平<500IU/ml，和

[0020] (6)HBeAg(‑)。

[0021] 优选地，所述样本采集和处理模块被设置为从所述患者获得外周血，并从中分离外周血单个核细胞。

[0022] 优选地，所述检测模块被设置为利用CD4+T细胞亚群表型的混合抗体来识别Th17和Th17.1亚群细胞数。

[0023] 还优选地，所述检测模块还被设置为利用流式细胞仪来识别和收集Th17和Th17.1亚群细胞。

[0024] 优选地，所述预后判断模块中采用的参考值为从原发性肝癌患者群获得的Th17.1细胞在CD4+T细胞中的占比和Th17.1/Th17比值的中位数。

[0025] 发明人在研究CD4+T细胞亚群及其可塑性以及对原发性肝癌的免疫环境的关系时发现，Th17.1数量以及Th17/Th17.1比值与原发性肝癌患者确诊后1年的疾病进展和结局相关。基于这样的发现，Th17.1在CD4+T细胞中的占比以及Th17/Th17.1比值成为预测原发性肝癌患者预后的新指标，并为临床提供一种新的预测原发性肝癌患者进展和结局的工具，从而辅助临床上对患者的治疗策略的考量。

附图说明

[0026] 下面结合附图对本发明做进一步的说明。

[0027] 图1示出了实施例1中为了检测外周血单个核细胞(PBMC)中CD4+T细胞各亚群的占比情况设置的圈门策略。

[0028] 图2示出了实施例1中正常人(HD)和肝癌患者(PLC)中的Th17、Th1和Th17.1细胞在外周血单个核细胞(PBMC)中的占比；其中：

[0029] A(上图)是流式示意图；

[0030] B(下图)的统计图示出了各细胞亚群的占比；从左到右依次为Th17细胞占比、Th17.1细胞占比、Th17.1/Th17比值、Th1细胞占比。图中：***P<0.001；****P<0.0001。

[0031] 图3示出了实施例2中按照不同BCLC分期及肿瘤大小对肝癌患者进行分类后，不同肿瘤特征患者Th17.1、Th17.1/Th17、Th1、Th17数量比较的结果；其中：

[0032] A(上图)示出了不同BCLC分期的患者之间的比较，其中0‑B为早中期，C‑D为晚期；

[0033] B(下图)示出了不同肿瘤大小的患者之间的比较。

[0034] 图4示出了实施例3中分析在原发性肝癌患者中Th17和Th17.1与经典CD4+T细胞亚群Th1和Treg的相关性的结果。

[0035] 图5示出了实施例4中随访1年不同结局原发性肝癌患者(生存组(alive)vs.死亡组(dead))的Th17、Th1、Th17.1及Treg数量。

[0036] 图6示出了实施例5中患者Th17.1、Th1细胞数量以及Th17.1/Th17比值的百分比预测肝癌患者1年生存的ROC曲线。图中：

[0037] 1：Th17.1细胞数量预测肝癌患者1年生存的ROC曲线；

[0038] 2：Th1细胞数量预测肝癌患者1年生存的ROC曲线；

[0039] 3：Th17.1/Th17比值的百分比预测肝癌患者1年生存的ROC曲线。

[0040] 图7示出了实施例5中，肝癌患者不同Th17.1水平(Th17.1 low‑低Th17.1水平，Th17.1 high‑高Th17.1水平)及其在不同亚组中的K‑M曲线分析；图中，

[0041] 1：低Th17.1水平的K‑M曲线；

[0042] 2：高Th17.1水平的K‑M曲线。

[0043] 其中：

[0044] A：示出了高、低Th17.1水平组的总生存率；

[0045] B：示出了不同BCLC分期亚组中高、低Th17.1水平组的生存率，其中左图为0‑A期，右图为B‑D期；

[0046] C：示出了不同肿瘤大小亚组中高、低Th17.1水平组的生存率，其中左图为肿瘤直径＜3cm，右图为肿瘤直径＞3cm；

[0047] D：示出了不同AFP水平亚组中高、低Th17.1水平组的生存率，其中左图为AFP＜400ng/ml，右图为AFP＞400ng/ml；

[0048] E：示出了不同乙肝表面抗原(HBsAg)水平亚组中高、低Th17.1水平组的生存率，其中左图为HBsAg(‑)，右图为HBsAg(+)；

[0049] F：示出了不同乙肝病毒DNA水平亚组中高、低Th17.1水平组的生存率，其中左图为HBV DNA＜500IU/ml，右图为HBV DNA＞500IU/ml；

[0050] G：示出了不同乙肝E抗原(HBeAg)水平亚组中高、低Th17.1水平组的生存率，其中左图为HBeAg(‑)，右图为HBeAg(+)。

[0051] 图8示出了实施例5中，肝癌患者不同Th17.1/Th17水平(Th17.1/Th17low‑低Th17.1/Th17水平，Th17.1/Th17 high‑高Th17.1/Th17水平)及其在不同亚组中的K‑M曲线分析；图中，

[0052] 1：低Th17.1/Th17水平的K‑M曲线；

[0053] 2：高Th17.1/Th17水平的K‑M曲线。

[0054] 其中：

[0055] A：示出了高、低Th17.1/Th17水平组的总生存率；

[0056] B：示出了不同BCLC分期亚组中高、低Th17.1/Th17水平组的生存率，其中左图为0‑A期，右图为B‑D期；

[0057] C：示出了不同肿瘤大小亚组中高、低Th17.1/Th17水平组的生存率，其中左图为肿瘤直径＜3cm，右图为肿瘤直径＞3cm；

[0058] D：示出了不同AFP水平亚组中高、低Th17.1/Th17水平组的生存率，其中左图为AFP＜400ng/ml，右图为AFP＞400ng/ml；

[0059] E：示出了不同乙肝表面抗原(HBsAg)水平亚组中高、低Th17.1/Th17水平组的生存率，其中左图为HBsAg(‑)，右图为HBsAg(+)；

[0060] F：示出了不同乙肝病毒DNA水平亚组中高、低Th17.1/Th17水平组的生存率，其中左图为HBV DNA＜500IU/ml，右图为HBV DNA＞500IU/ml；

[0061] G：示出了不同乙肝E抗原(HBeAg)水平亚组中高、低Th17.1/Th17水平组的生存率，其中左图为HBeAg(‑)，右图为HBeAg(+)。

[0062] 图9示出了实施例5中，肝癌患者不同Th1水平(Th1 low‑低Th1水平，Th1 high‑高Th1水平)的K‑M曲线分析；图中，

[0063] 1：低Th1水平的K‑M曲线；

[0064] 2：高Th1水平的K‑M曲线。

具体实施方式

[0065] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

[0066] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。研究例：原发性肝癌患者外周血CD4+T细胞亚群的识别和统计

[0067] (一)研究对象

[0068] 主要研究对象为2018年1月至2018年12月于北京地坛医院中西医结合中心经住院治疗的原发性肝癌患者122例，同时从中西医结合门诊收入37例健康受试者。2021年8月‑12月收集中西医结合中心经住院治疗的低病毒血症乙肝肝癌患者12例。

[0069] 1.1诊断标准

[0070] 慢性乙型病毒性肝炎西医诊断标准：参照2017年欧洲肝脏研究学会最新发布的乙型肝炎病毒感染临床实践指南及我国中华医学会制定的《慢性乙型肝炎防治指南》(2015年版)中的诊断标准执行，既往有慢性乙型病毒性肝炎病史或血清乙型肝炎表面抗原(hepatitis B s antigen，HBsAg)阳性时间持续≥6个月即可诊断。

[0071] 低病毒血症的诊断标准：对于乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染低病毒血症尚无统一定义，本研究对其定义参考2017年在Hepatology发表的一项关于低病毒血症研究，即具有可检测到的血清HBV病毒且病毒水平<2000IU/ml，结合实际HBV检测水平，本研究定义的低病毒血症为血清中具有可检测到的HBV病毒且病毒水平<500IU/ml。

[0072] 原发性肝细胞癌(HCC)临床诊断标准：HCC的诊断根据2017年我国卫生部修订的《原发性肝癌诊疗规范》结合EASL发布的肝癌临床实践指南[30]，要求必须具有以下(1)表现，同时具备(2)①或(2)②+(3)时，可诊断原发性肝癌：

[0073] (1)具有肝硬化及HBV(HBV‑DNA阳性)和/或HCV感染(HCV‑RNA阳性)的证据；

[0074] (2)HCC典型影像学特征：同期多排CT扫描和/或动态对比增MRI检查显示肝脏占位在动脉期快速不均质血管强化，而静脉期或延迟期快速洗脱。

[0075] ①如果肝脏占位直径≥2cm，CT或MRI中有一项显示肝脏占位的特征；②如果肝脏占位直径为1‑2cm，需要CT和MRI两项都显示肝脏占位的特征，来加强诊断的特异性。

[0076] (3)血清AFP≥400μg/L持续1个月或≥200μg/L持续2个月，且排除其他原因(妊娠、生殖系胚胎源性肿瘤、活动性肝病等)引起的AFP升高。

[0077] 除以上临床诊断标准之外，还有病理学诊断，即原发性肝癌的金标准。

[0078] 1.2纳入标准

[0079] 肝癌患者：

[0080] (1)年龄18‑75岁，性别不限；

[0081] (2)符合上述原发性肝癌诊断标准。

[0082] 低病毒血症乙肝肝癌患者；

[0083] (1)年龄18‑75岁，性别不限；

[0084] (2)符合上述原发性肝癌诊断标准。

[0085] (3)符合以上慢乙肝诊断标准；

[0086] (4)符合以上低病毒血症诊断标准。

[0087] 1.3排除标准

[0088] (1)合并HIV感染者；

[0089] (2)合并心、肺、肾、脑等重要脏器严重疾病伴功能不全患者；

[0090] (3)转移性肝癌患者或者合并其他肿瘤；

[0091] (4)孕妇及哺乳期妇女；

[0092] (5)临床资料、相关检查及检验结果不完整者。

[0093] 2.实验试剂与耗材

[0094] 2.1流式细胞术主要试剂和耗材

[0095] 2.1.1流式抗体

[0096]

[0097] 2.1.2其他试剂及耗材

[0098]

[0099]

[0100] 2.3主要实验仪器

[0101]

[0102] 3.实验方法

[0103] 3.1标本采集

[0104] 本研究主要采集中西医结合中心住院肝癌患者122例、健康受试者37例静脉血4ml及低病毒血症乙肝肝癌患者12例静脉血8ml，置于含EDTA抗凝剂的采血管中，6小时内处理，待行外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)分离。

[0105] 3.2血浆及PBMC的分离

[0106] (1)取患者及健康对照静脉血，2000rpm×10min离心，取上清，留取血浆，于‑80℃保存，以备后续实验用；

[0107] (2)剩余血液加入等体积PBS稀释并混匀，小心轻柔地铺于盛有3ml淋巴细胞分离液的离心管中，并以2000rpm×20min离心，设置为升9降4；

[0108] (3)小心吸取中间层白色云雾状的单个核淋巴细胞层，加入盛有8mlPBS的离心管中，并以1500rpm×10min离心；

[0109] (4)弃上清，弹匀细胞，此即PBMC。以备行CD4+T细胞亚群抗体染色，准备流式细胞仪上机检测。

[0110] 3.3CD4+T细胞亚群的检测

[0111] (1)将提取的PBMC按5×105个细胞分于流式管中，加入已配好的CD4+T细胞亚群表型的混抗(混抗配色为：CD3、CD4、CD8、CD25、CD45RA、CXCR3、CXCR5、CCR4、CCR6、CCR7、CCR10)，放在振荡器上涡匀，于室温避光30min。

[0112] (2)取出，加入2mL PBS清洗细胞碎片和未结合的荧光抗体混匀，1200rpm×5min离心，弃上清，弹匀细胞；

[0113] (3)在准备上机的5min前加入3μl 7‑AAD抗体，弹匀，采用Fortessa流式细胞仪上机收细胞，Diva软件收集并分析数据。

[0114] 4.统计学分析

[0115] 采用SPSS 25.0和GraphPad Prism 7.0进行统计，使用Flowjo软件对流式数据进行分析。根据数据是否服从正态分布，选择T检验或者非参检验，多组间采用ANOVA分析。K‑M曲线采用log‑rank检验分析。P<0.05表示有统计学差异。

[0116] 实施例1：肝癌患者和正常人的Th17及Th17.1细胞数量及Th17.1/Th17比值[0117] 为检测PBMC中CD4+T细胞各亚群的占比情况，首先设置了圈门策略。如图1所示：(1)去粘连：FSC‑A/FSC‑H；(2)圈出淋巴细胞：FSC‑A/SSC‑A；(3)去死细胞：CD3/7‑AAD；(4)圈出CD4+T细胞：CD4/CD8；(5)在CD4门下圈出Treg细胞亚群：CD25hi/CD25lo/CD45RA；(6)在CD4门下圈出记忆T细胞：CD45RA/CCR7；(7)去除Tfh样细胞：CXCR5/CCR10；(8)圈出不同趋化因子受体表达类型的细胞：CCR4/CCR6；(9)在CCR6+CCR4+门下圈出Th17细胞：CXCR3/CCR10；
(10)在CCR6+CCR4‑门下圈出Th17.1细胞：CXCR3/CCR10；(11)在CCR6‑CCR4‑门下圈出Th1细胞：CXCR3/CCR10。

[0118] 正常人和肝癌患者中CD4+T细胞亚群的各亚群的占比情况见图2所示。比较正常人和肝癌患者的检测结果，可以发现：相比正常人，肝癌患者Th17细胞、Th17.1以及Th17.1/Th17比值显著增加(P＝0.0001；P<0.0001；P<0.0001)，而Th1细胞的占比在两组中无统计学差异(P＝0.919)。

[0119] 实施例2：Th17、Th17.1细胞及Th17.1/Th17比值与肿瘤特征的关系

[0120] 为了进一步明确在肝癌PBMC中Th17和Th17.1以及Th1细胞与肿瘤特征的关系，按照BCLC分期——0‑B(早中期)和C‑D(晚期)，及肿瘤大小——＜5cm和≥5cm，对具有不同肿瘤特征的患者的Th17、Th17.1以及Th1细胞数量及Th17.1/Th17比值进行了比较。结果见图3。

[0121] 图3中的A图显示，在早中期肝癌患者(0‑B期)中，其Th17细胞数量明显较低(P＝0.029)，而Th17.1、Th1细胞及Th17.1/Th17比值在不同BCLC分期间没有显著差异(P>0.05)。
图3中的B图示出，肿瘤<5cm的患者相比肿瘤更大的患者其Th1细胞数量升高(P＝0.034)，而Th17、Th17.1细胞及Th17.1/Th17比值在不同肿瘤大小之间无显著差异(P>0.05)。

[0122] 实施例3：肝癌患者Th17、Th17.1细胞与经典CD4+T细胞亚群的相关性

[0123] 为了进一步明确Th17细胞与过渡表型Th17.1细胞在肝癌中的作用，对其数量与已知的经典T细胞亚群(如Treg细胞及Th1细胞)进行了相关性分析。结果见图4所示。

[0124] 图4显示：Th17细胞的数量与活化型Treg细胞(aTreg)存在显著正相关(r＝0.528，P<0.001)。而Th17.1的数量与Th1细胞呈显著正相关(r＝0.603，P<0.001)。进一步比较Th17.1/Th17比值，令人惊喜的发现其同样与Th1细胞呈显著正相关(r＝0.595，P<0.001)，同时与aTreg细胞数量存在负相关r＝‑0.304，P＝0.012)。

[0125] 实施例4：生存的肝癌患者具有更高的Th17.1细胞数量及Th17.1/Th17比值[0126] 为了进一步探求Th17、Th17.1细胞数量以及Th17.1/Th17比值与患者生存结局的关系，依据随访后1年的患者生存结局，将患者分为生存组(alive，87例)及死亡组(dead，35例)，分别比较患者的基线Th17、Th17.1细胞数量以及Th17.1/Th17比值在两组间的差异。具体见图5。

[0127] 图5示出：Th17.1细胞数量以及Th17.1/Th17比值在生存组患者中均明显升高(P＝0.023；P＝0.014)，同时观察到Th1细胞也有相似的趋势(P＝0.011)，而Th17细胞在两组间未观察到统计学差异(P＝0.462)。

[0128] 实施例5：Th17.1、Th1细胞数量及Th17.1/Th17比值能够预测肝癌患者短期生存[0129] 基于实施例4的结果，有必要进一步探求Th17.1、Th1细胞数量以及Th17.1/Th17比值是否能够预测患者的(短期)生存结局。因此，将以上细胞占比或其比值与患者1年生存进行了ROC曲线分析，结果见图6。

[0130] 图6示出，Th17.1、Th1细胞数量以及Th17.1/Th17比值预测患者1年生存的ROC曲线下面积分别为0.631、0.652及0.649，都接近0.7，说明上述指标可能有较好的预测效能。

[0131] 为了进一步明确不同水平Th17.1、Th1细胞数量以及Th17.1/Th17比值对肝癌患者1年生存的预测效能，以Th17.1及Th1细胞在CD4+T细胞中占比和Th17.1/Th17比值的中位数为界值为界值，分别将患者分为高低两组。对不同组患者1年生存率分别进行K‑M曲线分析，结果分别见图7、图8和图9。其中，Th17.1细胞在CD4+T细胞中占比中位数为3.1％，Th1细胞在CD4+T细胞中占比中位数为3.75％，Th17.1/Th17比值的中位数为91.1％。

[0132] 在Th17.1的亚组比较时发现高Th17.1水平组患者的生存率明显升高(80.3％vs 62.3％，P＝0.024)(图7A)。基于此，进一步进行了亚组分析，发现此现象主要在BCLC早期(0‑A)、肿瘤<3cm、AFP<400ng/ml以及HBsAg(+)的患者人群中存在差异(图7B‑E)。因此进一步在HBsAg(+)的乙肝肝癌患者中进行亚层分析(图7F‑G)，发现在HBV水平<500IU/ml、HBeAg(‑)的患者中，此预测能力更为显著。

[0133] Th17.1/Th17比值高的患者生存率明显较高(80.3％vs 62.3％，P＝0.015)(图8A)。亚组分析中，发现了与Th17.1细胞中观察到的结果极为相似的结果。即在肿瘤<3cm、AFP<400ng/ml以及HBsAg(+)的患者人群中存在差异(图8B‑E)。进一步在HBsAg(+)的乙肝肝癌患者中进行亚层分析(图8F‑G)，发现在HBV水平<500IU/ml、HBeAg(‑)的患者中，此预测能力更为显著。

[0134] 但是，在Th1细胞的高低两组患者中1年生存的K‑M曲线分析结果显示两组间无显著差异(P＝0.087)(图9)。因此，Th1细胞数量不适合作为预测原发性肝癌患者预后的指标。

[0135] 综上，本发明以Th17.1细胞在CD4+T细胞中占比和Th17.1/Th17比值作为预测原发性肝癌患者预后的指标。

[0136] 应用例

[0137] 1.患者冯xx，男，43岁，2018年1月19日首次诊断为原发性肝癌，肿瘤多发，最大肿瘤直径为1.2cm，BCLC分期为A期，即肝癌早期。通过流式检测该患者外周血CD4+T细胞亚群数量发现：Th17.1/CD4+T(％)为12.84％，Th17.1/Th17(％)为209.4％，以上两个指标分别高于参考值(Th17.1细胞在CD4+T细胞中占比3.1％，Th17.1/Th17百分比值为91.1％)。因此预测该患者预后良好，生存期≥1年。经长期随访，实际患者一年内肿瘤未复发，生存期为22.97个月。

[0138] 2.患者崔xx，男，61岁，2018年5月10日首次诊断为原发性肝癌，肿瘤多发，最大肿瘤直径为2.1cm，BCLC分期为A期，即肝癌早期。通过流式检测该患者外周血CD4+T细胞亚群数量发现：Th17.1/CD4+T(％)为9.42％，Th17.1/Th17(％)为657.2％，以上两个指标分别高于参考值(Th17.1细胞在CD4+T细胞中占比3.1％，Th17.1/Th17百分比值为91.1％)。因此预测该患者预后良好，生存期≥1年。经长期随访，实际患者一年内肿瘤未复发，生存期为19.27个月。

[0139] 3.患者王xx，男，67岁，2018年4月17日首次诊断为原发性肝癌，肿瘤多发，最大肿瘤直径为1.5cm，BCLC分期为A期，即肝癌早期。通过流式检测该患者外周血CD4+T细胞亚群数量发现：Th17.1/CD4+T(％)为2.24％，Th17.1/Th17(％)为59.32％，以上两个指标分别低于参考值(Th17.1细胞在CD4+T细胞中占比3.1％，Th17.1/Th17百分比值为91.1％)。因此预测该患者预后不良，生存期＜1年。经长期随访，实际患者一年内肿瘤复发，生存期为9.67个月。

[0140] 4.患者潘xx，女，69岁，2018年2月23日首次诊断为原发性肝癌，肿瘤单发，最大肿瘤直径为2.5cm，BCLC分期为A期，即肝癌早期。通过流式检测该患者外周血CD4+T细胞亚群数量发现：Th17.1/CD4+T(％)为1.08％，Th17.1/Th17(％)为15.56％，以上两个指标分别低于参考值(Th17.1细胞在CD4+T细胞中占比3.1％，Th17.1/Th17百分比值为91.1％)。因此预测该患者预后不良，生存期＜1年。经长期随访，实际患者一年内肿瘤复发，生存期为11.8个月。

[0141] 总之，本发明提供了一种新的预测原发性肝癌患者进展和结局的工具。通过检测患者外周血CD4+T细胞亚群数量，以Th17.1在CD4+T细胞中的占比以及Th17/Th17.1比值为预测原发性肝癌患者预后的新指标。

[0142] 以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。