一种复合脂质体佐剂及其制备方法转让专利
申请号 : CN202310028633.2
文献号 : CN115737800B
文献日 : 2023-05-23
发明人 : 王维龙 , 李彦良 , 李娜 , 李超 , 袁楚晓 , 罗士强 , 吴双 , 姚文荣 , 洪坤学 , 刘勇
申请人 : 江苏瑞科生物技术股份有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种复合脂质体佐剂,由以下成分组成:
A)由DOPC和DOTAP组合的脂质混合物;
B)胆固醇;和
C)3D‑MPL与PolyI:C,
其中DOPC与DOTAP的重量比为4:1‑6:1,脂质混合物与胆固醇的重量比是4:1,胆固醇与
3D‑MPL的重量比是5:1,3D‑MPL与PolyI:C的重量比是1:2‑1:5。
2.如权利要求1所述的复合脂质体佐剂,其特征在于,所述DOPC与DOTAP的重量比为6:1或4:1。
3.如权利要求1所述的复合脂质体佐剂,其特征在于,所述3D‑MPL与PolyI:C的重量比为1:2或1:5。
4.如权利要求1‑3中任一项所述的复合脂质体佐剂的制备方法,包括如下步骤:步骤1)制备有机相:将包含DOPC/DOTAP的脂质混合物、胆固醇和3D‑MPL按质量比90‑
100:20‑30:4‑5的比例溶解于有机溶剂中,得到有机相备用;
步骤2)制备水相:使用注射用水、生理盐水或缓冲盐溶液,制得水相备用;
步骤3)制备脂质体溶液:用微流控装置混合有机相和水相,去除有机溶剂、过滤得到脂质体溶液;
步骤4)制备佐剂原液:用注射用水、生理盐水或缓冲盐溶液溶解的PolyI:C溶液与脂质体溶液混合,得到复合脂质体佐剂原液。
5.如权利要求4所述的复合脂质体佐剂的制备方法,其特征在于,所述步骤3)可以用如下步骤替代:制备脂质体溶液:将有机相在水浴下减压、旋蒸后得脂质薄膜;在脂质薄膜中加入水相进行水化、再经过微射流均质获得浓缩脂质体原液,进一步稀释成所需要浓度的脂质体溶液。
6.如权利要求4或5所述的复合脂质体佐剂的制备方法,其特征在于,所述有机溶剂选自乙腈、二甲基甲酰胺、甲醇、丙酮、二甲基亚砜、乙醇、正丙醇、异丙醇、氯仿或其中两者的混合物。
7.一种疫苗组合物,包括权利要求1‑3中任一项所述的复合脂质体佐剂和抗原类成分。
8.如权利要求7所述的疫苗组合物的制备方法,包括如下步骤:步骤1)制备有机相:将包含DOPC/DOTAP的脂质混合物、胆固醇和3D‑MPL按质量比90‑
100:20‑30:4‑5的比例溶解于有机溶剂中,得到有机相备用;
步骤2)制备水相:使用注射用水、生理盐水或缓冲盐溶液溶解抗原类成分,制得水相备用;
步骤3)制备脂质体溶液:用微流控装置混合有机相和水相,去除有机溶剂、过滤得到脂质体溶液;
步骤4)制备疫苗组合物:用注射用水、生理盐水或缓冲盐溶液溶解的PolyI:C溶液与脂质体溶液混合,得到疫苗组合物。
9.如权利要求8所述的疫苗组合物的制备方法,其特征在于,所述步骤3)可以用如下步骤替代:制备脂质体溶液:将有机相在水浴下减压、旋蒸后得脂质薄膜;在脂质薄膜中加入水相进行水化,再经过微射流均质获得浓缩脂质体原液,进一步稀释成所需要浓度的脂质体溶液。
10.如权利要求8或9所述的疫苗组合物的制备方法,其特征在于,所述有机溶剂选自乙腈、二甲基甲酰胺、甲醇、丙酮、二甲基亚砜、乙醇、正丙醇、异丙醇、氯仿或其中两者的混合物。
说明书 :
一种复合脂质体佐剂及其制备方法
技术领域
背景技术
一个亲水的“头部”区域。在双层体中,脂质单层体的疏水“尾部”指向双层体内部,亲水“头
部”朝向双层体外部。脂质体可具有多种物理化学性质,例如大小、脂质组成、表面电荷、流
动性、双分子膜的数量。根据脂质双层体的数量,脂质体可归类为单层小囊泡(UV)或者多层
小囊泡(MLV),单层小囊泡是由单一脂质双层体构成,多层小囊泡是由两个或多个同心的双
层体构成且双层体彼此被水层间隔分离。水溶性化合物被捕获入脂质体的水相/核,相反
的,亲脂性化合物被捕获入脂质双层膜的核心。
长疫苗在注射部位停留、增加抗原提呈、延长刺激体内细胞免疫时间的重要因素。但如果细
胞摄入大量的阳离子脂质,将对细胞产生较大的毒性作用,引起细胞凋亡或坏死,其是否会
在细胞内积累,目前尚不十分明确需要更深入的研究[生命的化学,2016,36(1):50‑56]。
剂使用,在加强BCG免疫后,能有效诱导小鼠特异性的细胞免疫应答,且能有效的减轻结核
分枝杆菌感染造成的病理损伤(专利号:201110199072X)。然而,该佐剂稳定性较差,易于发
生絮凝现象,不利于最终投入生产和实际应用。为此,我们在前期脂质体佐剂和PolyI:C的
基础上,研究更加稳定和有效的新型免疫佐剂,以增强疫苗的保护效果,适于后期的研发和
生产。
合脂质体佐剂由于细胞膜负电而更易于进入细胞内,同时激活不同的信号通路,从而发挥
协同作用,高质量的免疫组合物不仅有强大的免疫刺激性同时具有更高的稳定性。
发明内容
脂质体溶液。
剂。
1:3的流速比运行。例如在23℃温度下以5ml/min的总流速和有机相:水相=1:4的流速比运
行。例如在25℃温度下以6ml/min的总流速和有机相:水相=1:5的流速比运行等。
道合胞病毒(RSV)、流感病毒、新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)、肝炎病毒和狂犬病毒中的至少
一种。
液。
1:3的流速比运行。例如在23℃温度下以5ml/min的总流速和有机相:水相=1:4的流速比运
行。例如在25℃温度下以6ml/min的总流速和有机相:水相=1:5的流速比运行等。
(VZV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒、新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)、肝炎病毒和狂犬病
毒中的至少一种,所述的抗原类物质在一些实施例中优选重组蛋白类形式的抗原。
DOPC与DDA的脂质组合。主要优点是DOTAP与中性脂质例如DOPC的组合更稳定,制成的脂质
体混合物保持无沉淀状态时间可超过2个月,相比于仅使用中性脂质的稳定性增加3‑5倍。
另外,DOPC与DDA的脂质组合获得的脂质体粒径大于200nm,对工艺后期的过滤除菌等会有
不利影响,而本发明的复合脂质体佐剂可以获得粒径在100‑200nm之间的脂质体颗粒,有利
于后期工艺及免疫增效。
与3D‑MPL联合使用可以同时激活两种TLR信号通路,更高效地激活先天免疫系统。另一方
面,存在于脂质层的MPL,与吸附在脂质外层的PolyI:C,两层存在位置差,以特定比例组合
的3D‑MPL和PolyI:C能够在不同信号通路中更好地发挥联合作用,使得免疫效果更持久。
附图说明
具体实施方式
置不同,3D‑MPL嵌在脂质双分子层上,而PolyI:C存在于外水相。在本发明的说明书中,提及
“一个实施例”时均意指在该实施例中描述的具体参数、步骤等至少包含在根据本发明的一
个实施例中。因而,在本发明的说明书中,若采用了诸如“根据本发明的一个实施例”、“在一
个实施例中”等用语并不用于特指在同一个实施例中,若采用了诸如“在另外的实施例中”、
“根据本发明的不同实施例”、“根据本发明另外的实施例”等用语,也并不用于特指提及的
特征只能包含在特定的不同的实施例中。本领域的技术人员应该理解,在本发明说明书的
一个或者多个实施例中公开的各具体参数、步骤等可以以任何合适的方式组合。
成的dsRNA,刺激机体产生抗病毒免疫反应和炎症反应,具有良好的抗病毒作用。研究发现,
将Poly I:C直接作为药物应用于临床时,会对身体产生一定的毒性。为了降低其对机体的
毒性,并提高Poly I:C刺激机体产生干扰素的能力,研究人员对其进行了改造,创造出多种
Poly I:C衍生物。
8倍。但是,Poly‑ICLC同样对机体有一定的毒性。使用脂质体包被Poly‑ICLC后,能够显著降
低其副作用。
150,000至550,000道尔顿之间,特别是66,000至660,000道尔顿之间。
氏阴性细菌例如明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)R595的脂多糖(LPS)的无毒衍
生物。它保持LPS的佐剂特性同时显示出降低的毒性(Johnson等1987 Rev. Infect.Dis.9
Suppl:S512‑S516)。3D‑MPL是3‑O‑脱酰单磷酰脂质A(或3脱‑ O ‑酰化单磷酰脂质A)。化学
上它是具有4、5或6个酰化链的3‑脱酰单磷酰脂质A的混合物。在一个实施例中,本发明的免
疫原性组合物包含3‑ O ‑脱酰单磷酰脂质A(3D‑MPL)。
(VZV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒、新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)、肝炎病毒和狂犬病
毒中的至少一种。
70、72、81、89),中等风险型HPV(例如HPV26、53、66、73、82),或者高危型HPV(例如HPV16、18、
31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)。
成的HPV病毒样颗粒。
组装而成的HPV病毒样颗粒。
道病毒的抗原可以来自上述型别中的一种或任意组合,所述抗原优选为由VP1蛋白、VP2蛋
白、VP3蛋白以及VP4蛋白组成的病毒样颗粒(VLP)。VP1蛋白、VP2蛋白、VP3蛋白以及VP4蛋白
由前体蛋白P1在3CD蛋白酶的作用下分解后产生。
EV71、柯萨奇A组6型、10型和16型病毒颗粒。
TB12.9等。PE/PPE家族蛋白优选包含PPE17、PPE18、PPE34、PPE42、、PPE57PE‑PGRS33、PE35‑
PPE68、PE‑PGRS62、PE‑PGRS17、PE‑PGRS11、PE25‑PPE41等。DosR家族蛋白优选包含Rv2029c、
Rv2031c、Rv2627c、Rv3133c等。
杆菌的抗原包含CFP‑10蛋白、PE35蛋白、PPE68蛋白和Rv2627c蛋白。在一个优选的实施方式
中,来源于结核分枝杆菌的抗原包含由CFP‑10蛋白、PE35蛋白、PPE68蛋白和Rv2627c蛋白形
成的融合蛋白。
白或其功能性片段。在一个优选的实施方式中,来源于单纯疱疹病毒(HSV)的抗原包含gB蛋
白的胞外结构域或其功能片段。在一个实施方式中,gB蛋白的胞外结构域的功能片段包含
gB蛋白的融合环(fusion‑loop)结构域。在一个实施方式中,gB蛋白的胞外结构域包含至少
一个氨基酸突变,优选的,所述氨基酸突变为脯氨酸取代。在一个实施方式中,HSV‑1的gB蛋
白的胞外结构域包含406位的脯氨酸取代。在一个实施方式中,HSV‑2的gB蛋白的胞外结构
域包含408位的脯氨酸取代。在一个实施方式中,来源于单纯疱疹病毒(HSV)的抗原包含
HSV‑1 gB蛋白的融合环结构域与HSV‑2 gB蛋白的融合环结构域形成的融合蛋白。
蛋白,其缺少gE蛋白的羧基端疏水锚区。
素(HA蛋白)。在一个优选的实施方式中,来源于流感病毒的抗原包含灭活的流感病毒。
毒(SARS‑CoV‑2)的抗原为SARS‑CoV‑2刺突蛋白(S蛋白)的受体结合结构域(RBD)或其功能
活性片段与N端结构域(NTD)或其功能活性片段形成的融合蛋白。在一个优选的实施方式
中,所述融合蛋白进一步包含foldon结构域、人免疫球蛋白的Fc结构域或其功能活性片段。
在一个更优选的实施方式中,来源于新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)的抗原包含来自不同毒株
的融合蛋白,每个融合蛋白为受体结合结构域(RBD)或其功能活性片段、N端结构域(NTD)和
foldon结构域或其功能活性片段形成的融合蛋白。在一些实施方式中,来源于新型冠状病
毒(SARS‑CoV‑2)的抗原包含源自免疫优势毒株的融合蛋白和源自流行优势毒株的融合蛋
白,其中,所述免疫优势毒株包含原型株和Beta株中的至少一种,所述流行优势毒株包含
Delta株和Omicron株中的至少一种。
功能活性片段形成的融合蛋白,其中,所述免疫优势毒株包含原型株和Beta株中的至少一
种,所述流行优势毒株包含Delta株和Omicron株中的至少一种。所述Omicron株包括BA.1、
BA.2、BA.3、BA.4、BA.5、BF.7、BQ.1和XBB变异株。
稀释成所需要浓度的脂质体溶液。
脂质体佐剂制剂。
Gr1 DOPC/DOTAP(1:1),3D‑MPL 5μg,PolyI:C 100μg
Gr2 DOPC/DOTAP(2:1),3D‑MPL 5μg,PolyI:C 100μg
Gr3 DOPC/DOTAP(4:1),3D‑MPL 5μg,PolyI:C 100μg
Gr4 DOPC/DOTAP(6:1),3D‑MPL 5μg,PolyI:C 100μg
Gr5‑1 DOPC/DDA(1:1),3D‑MPL 5μg,PolyI:C 100μg
Gr5‑2 DOPC/DDA(2:1),3D‑MPL 5μg,PolyI:C 100μg
Gr5‑3 DOPC/DDA(4:1),3D‑MPL 5μg,PolyI:C 100μg
Gr5‑4 DOPC/DDA(6:1),3D‑MPL 5μg,PolyI:C 100μg
Gr2 2:1 >200
Gr3 4:1 100‑200
Gr4 6:1 100‑200
Gr5‑1 1:1的DOPC/DDA >200
Gr5‑2 2:1的DOPC/DDA >200
Gr5‑3 4:1的DOPC/DDA >200
Gr5‑4 6:1的DOPC/DDA >200
物模型开展了免疫原性研究。每组6只,采用0天初免,两针间隔14天的免疫程序,于0天进行
水痘苗接种,35天和49天进行重组带状疱疹疫苗免疫。重组带状疱疹疫苗第二次免疫后14
天(63d),取小鼠脾脏分离小鼠脾淋巴细胞,以VZV gE(1‑546aa)肽库为刺激物,通过流式细
胞术检测细胞内细胞因子IFN‑γ、IL‑2 的水平。
Gr2 0.287 0.425 0.474 1.186
Gr3 0.369 0.139 0.240 0.748
Gr4 0.341 0.203 0.462 1.006
脂质体大小(nm)的考量,根据所需要的佐剂剂量,100‑200nm的脂质体大小合适,优选6:1和
4:1比例关系的DOPC/DOTAP脂质混合物。
式。
20℃温度下以4ml/min的总流速和有机相:水相=1:3的流速比运行微流控装置,获得脂质体
溶液。制备佐剂原液:PolyI:C取4g(厂家是Sigma,货号:P1530,CAS号:42424‑50‑0),溶解于
磷酸盐水溶液(50mM PB,包含100mM 的NaCl),与脂质体溶液混合,得到终浓度的复合脂质
体佐剂原液。
21645‑51‑2,厂家:CRODA,货号:AJV3012,批号:0001678865)4mg/ml分别吸附polyI:C和3D‑
MPL,再混合至合适的浓度备用。含缓冲液的VZV gE抗原与佐剂原液混合,得到终浓度的疫
苗制剂。
Gr1‑2 脂质体 DOPC/DOTAP(4:1),3D‑MPL,polyI:C(0.5mg/ml) 3D‑MPL 5μg,polyI:C 50μg
Gr1‑3 脂质体 DOPC/DOTAP(4:1),3D‑MPL,polyI:C(1mg/ml) 3D‑MPL 5μg,polyI:C 50μg
Gr2 氢氧化铝佐剂 氢氧化铝,3D‑MPL,polyI:C(0.5mg/ml) Al 50μg,3D‑MPL 5μg,polyI:C 25μgGr3 氢氧化铝佐剂 氢氧化铝,3D‑MPL,polyI:C(1mg/ml) Al 50μg,3D‑MPL 5μg,polyI:C 50μgGr4 脂质体 DOPC/DOTAP(4:1),3D‑MPL,polyI:C(2mg/ml) 3D‑MPL 5μg,polyI:C 100μg
展了免疫原性研究。每组6只,采用0天初免,两针间隔14天的免疫程序,于0天进行水痘苗接
种,35天和49天进行重组带状疱疹疫苗免疫。重组带状疱疹疫苗第二次免疫后14天(63d),
取小鼠脾脏分离小鼠脾淋巴细胞,以VZV gE(1‑546aa)肽库为刺激物,通过流式细胞术检测
细胞内细胞因子IFN‑γ、IL‑2 的水平。
Gr1‑1 0.475 0.468 0.594 1.537
Gr1‑2 0.421 0.258 0.527 1.206
Gr1‑3 0.413 0.215 0.512 1.140
Gr2 0.406 0.231 0.469 1.106
Gr3 0.314 0.178 0.585 1.077
Gr4 0.453 0.205 0.499 1.157
胞免疫的效果是最优的。3D‑MPL与PolyI:C的重量比范围可以是1:2‑1:20之间,优选的比例
是3D‑MPL与PolyI:C的重量比1:2、1:5和1:10,最优的比例是1:2。
液。
研究。每组6只,采用0天初免,两针间隔14天的免疫程序,于0天进行水痘苗接种,35天和49
天进行重组带状疱疹疫苗免疫。重组带状疱疹疫苗第二次免疫后14天(63d),取小鼠脾脏分
离小鼠脾淋巴细胞,以VZV gE(1‑546aa)肽库为刺激物,通过流式细胞术检测细胞内细胞因
子IFN‑γ、IL‑2的水平。
Gr2 0.492 0.240 0.485 1.217
本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护
范围之内。