一种短小芽孢杆菌LX4400及其应用

摘要

本发明提供了一种短小芽孢杆菌LX4400及其应用。本发明的短小芽孢杆菌LX4400的保藏编号为CGMCC No.25787，该短小芽孢杆菌LX4400为大豆根瘤菌的伴生菌，在实际应用过程中与大豆品种的匹配具有广谱性。上述短小芽孢杆菌LX4400在与根瘤菌同时施用时具有明显的增效作用，不仅能够显著提高植株的生物量，还能够明显增强植株的抗性，有利于提高根瘤菌的实际应用效果。

权利要求

1. 一种短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LX4400，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No. 25787。

2.一种短小芽孢杆菌菌剂，其特征在于，通过权利要求1所述的短小芽孢杆菌LX4400发酵制得。

3. 根据权利要求2所述的短小芽孢杆菌菌剂，其特征在于，发酵时，在基础发酵培养基中添加15‑25 mL/L根瘤菌胞外多糖粗液，根瘤菌胞外多糖粗液中的胞外多糖含量为19‑22 

7 7

g/L，胞外多糖的分子量为0.7×10‑1.5×10 Da。

4.根据权利要求3所述的短小芽孢杆菌菌剂，其特征在于，短小芽孢杆菌菌剂中短小芽孢杆菌LX4400的有效活菌数为100‑120亿/mL。

5.权利要求2所述的短小芽孢杆菌菌剂在根瘤菌剂使用过程中的应用，其特征在于，该短小芽孢杆菌菌剂的使用方法为拌种、包衣、冲施或喷施，该短小芽孢杆菌菌剂与大豆根瘤菌剂共同施用，或者该短小芽孢杆菌菌剂与花生根瘤菌剂、紫云英根瘤菌剂、降香黄檀根瘤菌剂、苜蓿根瘤菌剂、绿豆根瘤菌剂、红小豆根瘤菌剂、甘草根瘤菌剂、黄芪根瘤菌剂、豌豆根瘤菌剂和/或菜豆根瘤菌剂共同施用。

说明书

一种短小芽孢杆菌LX4400及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种短小芽孢杆菌LX4400及其应用。

背景技术

[0002] 国际上大豆根瘤菌的研究和应用已有一百多年的历史，无论发达国家还是发展中国家，都十分重视根瘤菌接种技术在大豆种植中的推广应用与研究工作。近几十年来我国在大豆种植上忽视地下部分，种植时依赖化学肥料，与国际上普遍接种应用根瘤菌技术相差甚远。主要原因是由于根瘤菌施用接种技术落后，造成了根瘤菌接种效率低，施用效果不理想。所以如何能更加有效的接种根瘤菌成为了研究的热点。

[0003] 为了更加有效地提高根瘤菌接种效果，促进根瘤菌应用技术的推广，特提出本发明。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种短小芽孢杆菌LX4400及其应用，该短小芽孢杆菌LX4400在与根瘤菌同时施用时具有明显的增效作用，不仅能够显著提高植株的生物量，还能够明显增强植株的抗性，有利于提高根瘤菌的实际应用效果。

[0005] 本发明提供一种短小芽孢杆菌LX4400，该短小芽孢杆菌LX4400的保藏编号为CGMCC No.25787。

[0006] 特别是，该短小芽孢杆菌LX4400分离自大豆植株根瘤内部，是根瘤菌的伴生菌；具体地，所述分离过程包括：将新鲜的大豆根瘤表面消毒，无菌操作条件下挤出汁液，涂抹于根瘤菌固体平板培养基上，28‑30℃静置培养，待培养物长出后，经过反复划线纯化，获得该短小芽孢杆菌LX4400的纯培养物。

[0007] 进一步地，该短小芽孢杆菌LX4400回接验证过程是：将该短小芽孢杆菌LX4400的纯培养物和大豆根瘤菌在大豆播种时随种接入，待大豆长至初花期，采集新鲜、饱满的大豆根瘤，对大豆根瘤进行表面消毒，无菌操作条件下取内部汁液涂抹于根瘤菌固体平板培养基进行培养，经过反复划线纯化，在不同品种大豆根瘤内部均再次分离获得短小芽孢杆菌LX4400；更具体地，该短小芽孢杆菌LX4400回接验证所用豆种表面经过消毒处理，栽培土、浇灌用水均经过121℃灭菌30min的处理。

[0008] 本发明的短小芽孢杆菌LX4400分离自大豆植株根瘤，该菌株与大豆根瘤菌共同紧密生长，在菌株分离过程中与根瘤菌很难分离，经回接实验验证该菌株为大豆根瘤菌的伴生菌。对分离得到的菌株进行16SrDNA测序，结果用Blast软件进行同源性比对，结果表明该菌株与短小芽孢杆菌的同源性为99％，构建系统发育树，证明该菌株为短小芽孢杆菌；同时，结合菌落、菌体形态特征及理化特性，从而鉴定该菌株为短小芽孢杆菌。

[0009] 本发明的短小芽孢杆菌LX4400分类命名为：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LX4400；保藏编号为：CGMCC No.25787；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号楼中国科学院微生物研究所；保藏时间为：2022年09月23日。

[0010] 研究表明：本发明的短小芽孢杆菌LX4400为大豆根瘤菌的伴生菌，在实际应用过程中与大豆品种的匹配具有广谱性，在与根瘤菌同时施用时具有明显的增效作用，不仅能够显著提高植株的生物量，还能够明显增强植株的抗性，有利于提高根瘤菌的实际应用效果；此外，本发明的短小芽孢杆菌LX4400在与防御假单胞菌或荧光假单胞菌混配时能够有效延长防御假单胞菌和荧光假单胞菌的存活时间，有利于提高防御假单胞菌和荧光假单胞菌的储存稳定性并延长产品货架期。

[0011] 本发明还提供一种短小芽孢杆菌菌剂，通过对上述的短小芽孢杆菌LX4400进行发酵制得。

[0012] 本发明对短小芽孢杆菌LX4400的发酵培养基和发酵方法不作严格限制，可以采用本领域的常规培养基及培养条件进行发酵。在一实施方式中，对短小芽孢杆菌LX4400进行发酵的发酵培养基组分可以包括：葡萄糖10‑20g/L，蛋白胨1‑3g/L，硫酸铵2‑4g/L，磷酸氢二钾0.5‑2g/L，磷酸二氢钾0.5‑2g/L，硫酸镁0.5‑1g/L；调节发酵培养基的pH值为6.8‑7.0，常规灭菌后使用。此外，发酵条件可以包括：发酵温度30‑35℃，转速160‑200rpm，发酵时间1.5‑2.5d。在上述条件下，短小芽孢杆菌菌剂中短小芽孢杆菌LX4400菌剂的活菌数为50‑80亿/mL。

[0013] 进一步地，经过培养基优化后，短小芽孢杆菌菌剂中短小芽孢杆菌LX4400菌剂的活菌数提高为100‑120亿/mL。具体地，优化方法是发酵时向基础发酵培养基中添加15‑25mL/L根瘤菌胞外多糖粗液；具体地，该根瘤菌胞外多糖粗液中胞外多糖的分子量(重均分
7 7
子量)为0.7×10 ‑1.5×10 Da；根瘤菌胞外多糖粗液中的胞外多糖总含量为19‑22g/L。此外，根瘤菌胞外多糖粗液的添加量可以为15‑25mL/L。

[0014] 上述根瘤菌胞外多糖粗液可以通过利用大豆根瘤菌进行液体发酵、浓缩制得，大豆根瘤菌来自领先生物农业股份有限公司；对大豆根瘤菌的发酵培养基和发酵方法不作严格限制，可以采用本领域的常规培养基及培养条件进行发酵。在一实施方式中，对大豆根瘤菌进行发酵的发酵培养基的组成为：甘露醇10‑15g/L，氯化钠0.1‑0.3g/L，硫酸镁0.2‑0.4g/L，硫酸钙0.08‑0.12g/L，磷酸氢二钾0.8‑1.2g/L和酵母膏0.8‑1.2g/L。此外，发酵条件可以包括：发酵温度28‑30℃，转速160‑200rpm，发酵时间6‑8d。

[0015] 在基础发酵培养基中添加上述根瘤菌胞外多糖粗液能够有效提高短小芽孢杆菌LX4400的活菌数并延长短小芽孢杆菌菌剂在恶劣条件下的货架期。

[0016] 本发明还提供上述短小芽孢杆菌菌剂在根瘤菌剂使用过程中的应用。该短小芽孢杆菌菌剂在根瘤菌剂使用过程中的使用方法为拌种、包衣、冲施、喷施。具体地，在应用时，该短小芽孢杆菌菌剂与大豆根瘤菌剂共同施用。更具体地，在包衣或拌种使用时，大豆根瘤菌剂的用量可以为2‑3mL/公斤种子，短小芽孢杆菌菌剂的用量可以为0.1‑0.2mL/公斤种子。

[0017] 此外，在应用时，该短小芽孢杆菌菌剂还可以与花生根瘤菌、紫云英根瘤菌、降香黄檀根瘤菌、苜蓿根瘤菌、绿豆根瘤菌、红小豆根瘤菌、沙打旺根瘤菌、甘草根瘤菌、黄芪根瘤菌、豌豆根瘤菌、菜豆根瘤菌和/或三叶草根瘤菌共同施用。上述各根瘤菌剂可以为液态制剂，液态制剂中根瘤菌的活菌数可以为50‑120亿/mL。

[0018] 本发明的短小芽孢杆菌LX4400在与大豆根瘤菌同时施用时比单独施用大豆根瘤菌能够更加显著地提高大豆植株的生物量、全氮等，对大豆根瘤菌的施用具有明显的增效作用；同时，还可以与花生根瘤菌、紫云英根瘤菌、降香黄檀根瘤菌、苜蓿根瘤菌、绿豆根瘤菌、红小豆根瘤菌、沙打旺根瘤菌、甘草根瘤菌、黄芪根瘤菌、豌豆根瘤菌、菜豆根瘤菌、三叶草根瘤菌等多种根瘤菌同时施用，从而提升根瘤菌的应用效果。本发明的短小芽孢杆菌LX4400首次作为大豆根瘤菌的伴生菌被发现，提供了短小芽孢杆菌新的应用技术领域，对根瘤菌的实际推广和应用意义显著。

具体实施方式

[0019] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0020] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

[0021] 下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0022] 实施例1短小芽孢杆菌LX4400的分离鉴定

[0023] 一、菌株分离

[0024] 将新鲜大豆根瘤用2％次氯酸钠溶液浸泡10min，然后用无菌水冲洗3‑5次，再用75％酒精浸泡10min，然后无菌水冲洗3‑5次，完成根瘤表面消毒。

[0025] 随后，用无菌平板和手术刀将根瘤表面切开，挤出汁液，涂抹于常规的根瘤菌固体平板培养基上，28℃静置培养7‑10天进行第一次纯化，挑取根瘤菌菌落，继续在根瘤菌平板培养基上划线，28℃静置培养7‑10天进行第二次纯化；如此重复纯化10‑15次，得到根瘤菌伴生菌的单菌落，并对根瘤菌伴生菌进行鉴定。

[0026] 将上述获得的菌株采用常规细菌DNA的提取方法提取总DNA，并进行PCR扩增，16SrDNA测序结果用Blast软件进行同源性比对，该菌株与短小芽孢杆菌的同源性为99％；
同时，构建系统发育树，结果表明该菌株为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，将其命名为短小芽孢杆菌LX4400，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.25787。

[0027] 实施例2制备短小芽孢杆菌LX4400发酵液

[0028] 一、菌株活化

[0029] 菌株活化所采用的固体培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，加水定容至1L，调节pH值至6.8‑7.0，121℃条件下灭菌30min。

[0030] 将保存于‑80℃冰箱甘油管中的短小芽孢杆菌LX4400在固体培养基平板上划线活化，32℃恒温培养2天后备用。

[0031] 二、制备种子液

[0032] 种子培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，加水定容至1L，调节pH值至6.8‑7.0，121℃条件下灭菌30min。

[0033] 将步骤一活化好的菌种转接至上述种子培养基中，32℃恒温震荡培养24h后，得到种子液。

[0034] 三、制备发酵培养基

[0035] 发酵培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨1g/L，硫酸铵2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，调节pH值至6.8‑7.0，115℃条件下灭菌20min。

[0036] 按发酵培养基体积的5％，将步骤二制备的种子液转接至发酵培养基中，32℃恒温200rpm震荡培养2天，即制得短小芽孢杆菌LX4400菌剂。

[0037] 对上述短小芽孢杆菌LX4400菌剂中的有效活菌数采用国标《GB20287‑2006农用微生物菌剂》中菌落计数的方法进行检测，结果见表1；此外，将上述短小芽孢杆菌LX4400发酵液在37℃下进行高温储存试验，并在储存第0、1、3、6个月进行有效活菌数检测，结果见表2。

[0038] 实施例3制备短小芽孢杆菌LX4400菌剂

[0039] 除发酵培养基的组成不同之外，其余与实施例2相同，即制得短小芽孢杆菌LX4400菌剂。

[0040] 本实施例的发酵培养基在实施例2的发酵培养基中额外添加了根瘤菌胞外多糖粗液20mL/L。

[0041] 根瘤菌胞外多糖粗液的制备方法如下：

[0042] a.斜面培养

[0043] 斜面培养基：将10g甘露醇、0.2g氯化钠、0.3g硫酸镁、0.1g硫酸钙、1.0g磷酸氢二钾、1g酵母膏、20g琼脂，用水补充达到总体积1000mL，调节pH值至6.8，121℃条件下灭菌30min。

[0044] 将领先生物农业股份有限公司的大豆根瘤菌菌种接种于上述斜面培养基，置于恒温培养箱中在28℃的条件下培养7‑10d，得到斜面培养物。

[0045] b.种子培养

[0046] 种子培养基：将10g甘露醇、0.2g氯化钠、0.3g硫酸镁、0.1g硫酸钙、1.0g磷酸氢二钾、1g酵母膏溶于水中，用水补充达到总体积1000mL，调节pH值至6.8，121℃条件下灭菌30min。

[0047] 使用接种环将步骤a得到的斜面培养物接种到上述种子培养基中，置于恒温培养箱中在温度28℃与转速180rpm的条件下培养5d，得到种子培养物。

[0048] c.发酵培养

[0049] 发酵培养基：将15g甘露醇、0.2g氯化钠、0.3g硫酸镁、0.1g硫酸钙、1.0g磷酸氢二钾、1.2g酵母膏溶于水中，用水补充达到总体积1000mL，调节pH值至6.8，121℃条件下灭菌30min。

[0050] 按照发酵培养基体积的5％接种，将步骤b得到的种子培养物转接至上述发酵培养基中，置于恒温培养箱中在温度28℃与转速180rpm的条件下培养7d，发酵结束后得到含有胞外多糖的大豆根瘤菌发酵液；对大豆根瘤菌发酵液进行减压浓缩，制得根瘤菌胞外多糖粗液。

[0051] 对上述根瘤菌胞外多糖粗液中的胞外多糖的分子量和含量采用凝胶过滤法和苯酚‑硫酸法进行检测；结果表明，上述根瘤菌胞外多糖粗液中的胞外多糖的分子量为1.1×7
10Da，胞外多糖总含量为21.2g/L。

[0052] 本实施例制备的短小芽孢杆菌LX4400菌剂中的有效活菌数采用国标《GB20287‑2006农用微生物菌剂》中菌落计数的方法进行检测，结果见表1；此外，将上述短小芽孢杆菌LX4400发酵液在37℃下进行高温储存试验，并在储存第0、1、3、6个月进行有效活菌数检测，结果见表2。

[0053] 表1短小芽孢杆菌LX4400菌剂的有效活菌数

[0054]不同处理 有效活菌数
实施例2 68亿/mL
实施例3 102亿/mL

[0055] 表2菌剂在高温储存过程中的有效活菌数变化情况

[0056]

[0057] 表1、表2结果表明：

[0058] 在基础发酵培养基中添加根瘤菌胞外多糖不仅能够有效提高短小芽孢杆菌LX4400菌剂的有效活菌数，同时将短小芽孢杆菌LX4400在高温下的存活率由26.5％提高到了85.3％，进而有利于提高产品货架期。

[0059] 实施例4短小芽孢杆菌LX4400回接验证试验

[0060] 将实施例1分离得到的短小芽孢杆菌LX4400再进行回接验证实验，具体步骤如下：

[0061] 大豆品种：黑河43、黑河48、东生1号、合农69。

[0062] 大豆根瘤菌菌剂：领先生物农业股份有限公司生产的富思德大豆根瘤菌菌剂，有效活菌数为119亿/mL。

[0063] 短小芽孢杆菌菌剂：实施例2制备的短小芽孢杆菌LX4400菌剂，有效活菌数为68亿/mL。

[0064] 回接验证试验方法如下：

[0065] 1)将上述四种品种的豆种表面进行消毒，将新鲜大豆根瘤用2％次氯酸钠溶液浸泡10min，然后用无菌水冲洗3‑5次，再用75％酒精浸泡10min，然后用无菌水冲洗3‑5次，完成豆种表面消毒。

[0066] 2)花盆装好栽培土后121℃灭菌30min。

[0067] 3)将消毒后的豆种分别埋入提前灭好菌的栽培土中培育。

[0068] 4)每盆同时浇灌大豆根瘤菌菌剂0.1mL和短小芽孢杆菌菌剂0.005mL。

[0069] 5)在25℃恒温培养室培养，大豆整个生长过程中采用无菌水浇水。

[0070] 6)初花期采集根瘤分菌验证，按实施例1中短小芽孢杆菌LX4400的分离方法操作。

[0071] 回接验证试验结果表明：在四组处理中均获得短小芽孢杆菌LX4400，且与大豆根瘤菌紧密生长，因此短小芽孢杆菌LX4400为大豆根瘤菌的伴生菌，且在实际应用过程中与大豆品种的匹配具有广谱性。

[0072] 实施例5短小芽孢杆菌LX4400和大豆根瘤菌盆栽种植试验

[0073] 一、实验材料：

[0074] 供试豆种：黑河43、合农69。

[0075] 供试地址：河北省秦皇岛市领先生物农业股份有限公司恒温培养室。

[0076] 供试土壤：黑龙江省北安市地区黑土。

[0077] 供试菌剂：

[0078] 1、大豆根瘤菌菌剂：领先生物农业股份有限公司生产的富思德大豆根瘤菌菌剂，有效活菌数为119亿/mL。

[0079] 2、短小芽孢杆菌菌剂：

[0080] 1)短小芽孢杆菌菌剂1：实施例2制备的短小芽孢杆菌LX4400菌剂；

[0081] 2)短小芽孢杆菌菌剂2：河北中保绿农作物科技有限公司生产的菌剂；

[0082] 3)短小芽孢杆菌菌剂3：武汉科诺生物科技有限公司生产的菌剂；

[0083] 4)短小芽孢杆菌菌剂4：江苏天象生物科技有限公司生产的菌剂；

[0084] 5)短小芽孢杆菌菌剂5：由标准短小芽孢杆菌按照实施例2方法发酵制备得到的菌剂，标准短小芽孢杆菌购自北京万佳标准物质研发中心，编号BWCC66005。

[0085] 将短小芽孢杆菌菌剂1‑5均稀释至50亿/mL备用。

[0086] 二、实验方法：

[0087] 对供试豆种表面消毒后包衣、播种，设8个处理(处理见表3)，处理1‑7在包衣前均将菌剂/混合菌剂稀释至总体积为4mL后进行包衣，每个处理5个重复；盛花期、收获期调查，调查结果见表4、表5。

[0088] 表3大豆盆栽试验方案

[0089]

[0090]

[0091] 表4不同处理对大豆生长及植株含氮量的影响(黑河43)

[0092]

[0093] 表4中，不同小写字母代表差异性显著(p＜0.05)。

[0094] 表5大豆盆栽实验调查结果(合农69)

[0095]

[0096] 表5中，不同小写字母代表差异性显著(p＜0.05)。

[0097] 由表4、表5结果可知：

[0098] 1、单独施用短小芽孢杆菌LX4400，对植株的有效结瘤数、籽粒含氮量、茎叶含氮量、生物量促进效果不显著；单独施用大豆根瘤菌菌剂对植株的有效结瘤数、籽粒含氮量、茎叶含氮量、生物量具有一定的促进效果；

[0099] 2、相对于单独施用大豆根瘤菌菌剂，同时施用大豆根瘤菌菌剂和标准短小芽孢杆菌或其它普通市购的短小芽孢杆菌对植株的有效结瘤数、籽粒含氮量、茎叶含氮量、生物量并无更进一步的促进作用，说明标准短小芽孢杆菌和其它普通市购的短小芽孢杆菌对大豆根瘤菌菌剂不具有明显的增效作用；

[0100] 3、相对于单独施用大豆根瘤菌菌剂，同时施用大豆根瘤菌菌剂和短小芽孢杆菌LX4400，对植株的有效结瘤数、籽粒含氮量、茎叶含氮量、生物量具有明显的促进效果，植株的各参数均比单独施用大豆根瘤菌菌剂具有明显的提高，说明短小芽孢杆菌LX4400对大豆根瘤菌菌剂具有明显的增效作用，能够提高根瘤菌在植株根部的侵染能力。

[0101] 实施例6短小芽孢杆菌LX4400与花生根瘤菌协同促生试验

[0102] 一、实验材料：

[0103] 供试花生：鲁花9号。

[0104] 供试地址：河北省秦皇岛市领先生物农业股份有限公司恒温培养室。

[0105] 供试土壤：河北秦皇岛地区黄棕壤。

[0106] 供试菌剂：

[0107] 1、花生根瘤菌菌剂：富思德花生根瘤菌菌剂，有效活菌数为102亿/mL，领先生物农业股份有限公司生产；

[0108] 2、短小芽孢杆菌菌剂：

[0109] 1)短小芽孢杆菌菌剂1：实施例2制备的短小芽孢杆菌LX4400菌剂；

[0110] 2)短小芽孢杆菌菌剂2：河北中保绿农作物科技有限公司生产的菌剂；

[0111] 3)短小芽孢杆菌菌剂3：武汉科诺生物科技有限公司生产的菌剂；

[0112] 4)短小芽孢杆菌菌剂4：江苏天象生物科技有限公司生产的菌剂；

[0113] 5)短小芽孢杆菌菌剂5：由标准短小芽孢杆菌按照实施例2方法发酵制备得到的菌剂，标准短小芽孢杆菌购自北京万佳标准物质研发中心，编号BWCC66005。

[0114] 为了保证试验结果的准确性，分别将短小芽孢杆菌菌剂1‑5均稀释至50亿/mL备用。

[0115] 二、实验方法：

[0116] 对供试花生种子表面消毒后拌种，设8个处理(处理见表6)，处理1‑7在拌种前均将菌剂/混合菌剂稀释至总体积为6mL后进行拌种，每个处理5个重复；收获期调查，调查结果见表7。

[0117] 表6花生盆栽试验方案

[0118]

[0119] 表7花生盆栽实验调查结果

[0120]

[0121]

[0122] 表7中，不同小写字母代表差异性显著(p＜0.05)。

[0123] 由表7结果可知：

[0124] 1、单独施用短小芽孢杆菌LX4400，对植株的果数、百果重、植株干重、植株全氮的促生效果不显著；同时，单独施用花生根瘤菌菌剂对植株的果数、百果重、植株干重、植株全氮具有一定的促进效果；

[0125] 2、相对于单独施用花生根瘤菌菌剂，同时施用花生根瘤菌菌剂和标准短小芽孢杆菌菌剂或其它普通市购的短小芽孢杆菌菌剂对植株的果数、百果重、植株干重、植株全氮并无进一步的促进作用，说明标准短小芽孢杆菌和其它普通市购的短小芽孢杆菌对花生根瘤菌菌剂不具有增效作用；

[0126] 3、相对于单独施用花生根瘤菌菌剂，同时施用花生根瘤菌菌剂和短小芽孢杆菌LX4400菌剂，植株的果数增加14％、百果重增加15％、植株干重增加9％、植株全氮增加13％，植株的各参数均比单独施用花生根瘤菌菌剂具有明显的提高，说明短小芽孢杆菌LX4400对花生根瘤菌具有明显的增效作用。

[0127] 实施例7短小芽孢杆菌LX4400与降香黄檀根瘤菌共用试验

[0128] 一、实验材料：

[0129] 供试降香黄檀：黄花梨树种子。

[0130] 供试地址：广西凭祥市中国林科院热林中心苗圃温室。

[0131] 供试土壤：黄壤土。

[0132] 供试菌剂：

[0133] 1、降香黄檀根瘤菌菌剂：有效活菌数为56亿/mL，领先生物农业股份有限公司生产。

[0134] 2、短小芽孢杆菌菌剂：

[0135] 1)短小芽孢杆菌菌剂1：实施例2制备的短小芽孢杆菌LX4400菌剂；

[0136] 2)短小芽孢杆菌菌剂5：标准短小芽孢杆菌，购自北京万佳标准物质研究中心，按照实施例2方法发酵制备短小芽孢杆菌菌剂。

[0137] 为了保证试验结果的准确性，分别将短小芽孢杆菌菌剂1、5均稀释至50亿/mL备用。

[0138] 二、实验方法：

[0139] 挑选健康饱满的降香黄檀种子，清水浸泡后播种，待苗高4‑5cm长出2‑3片真叶后移入营养袋中培育，培养过程中施用菌剂/混合菌剂(实验方案见表8)，处理1‑4在施用前均将菌剂/混合菌剂稀释至总体积为5mL后进行施用，培育10个月后对成苗植株进行调查，调查结果见表9。

[0140] 表8降香黄檀施肥方案

[0141]

[0142] 表9降香黄檀植株调查结果

[0143]

[0144] 表9中，不同小写字母代表差异性显著(p＜0.05)。

[0145] 由表9结果可知：

[0146] 1、相对于对照组，单独使用降香黄檀根瘤菌菌剂提高了降香黄檀植株的株高，茎粗、有效根瘤数等，单独使用短小芽孢杆菌LX4400菌剂对植株也有一定的促生作用，但效果不显著；

[0147] 2、相对于仅施用降香黄檀根瘤菌菌剂，同时施用降香黄檀根瘤菌和标准短小芽孢杆菌对株高、茎粗、有效根瘤数等无明显提高，说明标准短小芽孢杆菌对降香黄檀根瘤菌不具有协同增效作用；

[0148] 3、相对于仅施用降香黄檀根瘤菌菌剂，同时施用降香黄檀根瘤菌菌剂和短小芽孢杆菌LX4400菌剂后,株高增加了16％、茎粗增加了21％、有效根瘤数增加了81％、地上部分干重增加了23％、根部干重增加了8％，说明在施用降香黄檀根瘤菌菌剂的同时施用短小芽孢杆菌LX4400菌剂可以提高根瘤菌在植株根部的定殖，增加了侵染的概率，从而为植株生长提供了更多氮肥，短小芽孢杆菌LX4400对于降香黄檀根瘤菌具有明显的协同增效作用。

[0149] 4、丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度，从而间接表示植株的抗逆能力；MDA含量越低，植株的抗逆性越好，当遇到干旱、高温、低温等恶劣环境时，植株的成活率会越高；丙二醛含量数据表明，短小芽孢杆菌LX4400与降香黄檀根瘤菌共同施用除了能够显著提高植株的生物量之外，还能明显提高植株的抗性；

[0150] 5、电导率可以反映植物在遭到逆境时细胞膜遭到破坏的程度，与植物抗逆性的强弱有关；电导率数据表明，短小芽孢杆菌LX4400与降香黄檀根瘤菌共同施用能够有效提高植株抗性，在干旱缺水的环境下种植可以有效提高幼苗的成活率。

[0151] 实施例8短小芽孢杆菌LX4400与防御假单胞菌混合复配试验

[0152] 一、实验材料：

[0153] 1、防御假单胞菌菌剂：有效活菌数为138亿/mL，领先生物农业股份有限公司生产。

[0154] 2、短小芽孢杆菌菌剂：

[0155] 1)短小芽孢杆菌菌剂1：实施例2制备的短小芽孢杆菌LX4400菌剂。

[0156] 2)短小芽孢杆菌菌剂3：河北中保绿农作物科技有限公司生产。

[0157] 3)短小芽孢杆菌菌剂5：标准短小芽孢杆菌，购自北京万佳标准物质研发中心，BWCC66005，按照实施例2方法发酵制得。

[0158] 4)短小芽孢杆菌菌剂6：广西东园生态农业科技有限公司生产。

[0159] 为了保证试验结果的准确性，分别将短小芽孢杆菌菌剂1、3、5、6均稀释至50亿/mL备用。

[0160] 二、实验方法：

[0161] 将防御假单胞菌菌剂分别与上述各短小芽孢杆菌菌剂在无菌条件下10：1混配后灌装，于25℃下进行保存，定期(0个月、3个月、6个月、12个月)检测防御假单胞菌的有效活菌数，结果见表10。

[0162] 表10防御假单胞菌的有效活菌数检测结果

[0163]

[0164] 由表10结果可知：

[0165] 1、将防御假单胞菌与标准短小芽孢杆菌或其它其它普通市购的短小芽孢杆菌混配，对防御假单胞菌的存活无显著影响；

[0166] 2、将防御假单胞菌与短小芽孢杆菌LX4400混配能够显著提高防御假单胞菌的存活率，说明短小芽孢杆菌LX4400有助于防御假单胞菌菌体的存活，进而能够有效延长防御假单胞菌菌剂产品的货架期。

[0167] 实施例9短小芽孢杆菌LX4400与荧光假单胞菌混合复配试验

[0168] 一、实验材料：

[0169] 1、荧光假单胞菌菌剂：有效活菌数为158亿/mL，领先生物农业股份有限公司生产。

[0170] 2、短小芽孢杆菌菌剂：

[0171] 1)短小芽孢杆菌菌剂1：实施例2制备的短小芽孢杆菌LX4400菌剂。

[0172] 2)短小芽孢杆菌菌剂3：河北中保绿农作物科技有限公司生产。

[0173] 3)短小芽孢杆菌菌剂5：标准短小芽孢杆菌，购自北京万佳标准物质研发中心，BWCC66005，按照实施例2方法发酵制得。

[0174] 4)短小芽孢杆菌菌剂6：广西东园生态农业科技有限公司生产。

[0175] 为了保证试验结果的准确性，分别将短小芽孢杆菌菌剂1、3、5、6均稀释至50亿/mL备用。

[0176] 二、实验方法：

[0177] 将荧光假单胞菌菌剂分别与上述各短小芽孢杆菌菌剂在无菌条件下10:1混配后灌装，于25℃下进行保存，定期(0个月、3个月、6个月、12个月)检测荧光假单胞菌的有效活菌数，结果见表11。

[0178] 表11荧光假单胞菌的有效活菌数检测结果

[0179]

[0180] 由表11结果可知：

[0181] 1、将荧光假单胞菌与标准短小芽孢杆菌或其它其它普通市购的短小芽孢杆菌混配，对荧光假单胞菌的存活无显著影响；

[0182] 2、将荧光假单胞菌与短小芽孢杆菌LX4400混配能够显著提高荧光假单胞菌的存活率，说明短小芽孢杆菌LX4400有助于荧光假单胞菌菌体的存活，进而能够有效延长荧光假单胞菌菌剂产品的货架期。

[0183] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。