蛋白组合物及其制备方法和用途

摘要

本发明涉及一种蛋白组合物及其制备方法和用途。该组合物包括脱乙酰壳多糖衍生物和蛋白，所述脱乙酰壳多糖衍生物包括：(1)脱乙酰壳多糖主链；(2)与所述主链通过醚键连接的基团A；以及(3)与所述主链通过酰胺键连接的基团B，其中，所述基团A具有一个或多个羟乙基，所述基团B具有一个或多个酰基和一个或多个氨基。本发明提供的蛋白组合物能较好地经皮渗透，在护肤品领域具有广阔应用前景。

权利要求

1.一种蛋白组合物，包括脱乙酰壳多糖衍生物和蛋白，所述脱乙酰壳多糖衍生物包括：(1)脱乙酰壳多糖主链；(2)与所述主链通过醚键连接的基团A；以及(3)与所述主链通过酰胺键连接的基团B，其中，所述基团A具有一个或多个羟乙基，所述基团B具有一个或多个酰基和一个或多个氨基；

所述脱乙酰壳多糖衍生物具有如下结构单元1、2中的至少一种：其中，结构单元1、2中，A表示所述基团A，B表示所述基团B；

所述基团A具有如下结构：

，m为1‑100；

所述基团B是 ；

所述脱乙酰壳多糖衍生物和蛋白分子的重量比为1：0.01‑10；

所述脱乙酰壳多糖衍生物和所述蛋白形成纳米颗粒；

所述蛋白选自纤连蛋白、重组Ⅲ型人源化胶原蛋白中的一种或多种；

所述脱乙酰壳多糖衍生物的平均分子量为500‑18000Da。

2.权利要求1所述的蛋白组合物的制备方法，包括如下步骤：将脱乙酰壳多糖衍生物溶于溶剂，得到溶液A；

将蛋白溶于溶剂得到溶液B；

将溶液A和溶液B进行混合。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为水；

所述溶液A中脱乙酰壳多糖衍生物的质量浓度0.001%‑50%；

所述溶液B中蛋白的质量浓度为0.001%‑50%；

所述混合的条件包括：搅拌速度为10‑2000 rpm，搅拌时间为0.1‑48h。

4.一种护肤品，包括权利要求1所述的蛋白组合物。

说明书

蛋白组合物及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种蛋白组合物及其制备方法和用途。

背景技术

[0002] 随着年龄的增加，人身体的各项机能都在逐渐发生变化，在众多的变化中，比较明显的是皮肤状态的变化，如：随着年龄的增加，皮肤的光泽度降低，皱纹增加，皮肤暗黄无光等。如何解决这些问题，对于提高人的生活质量具有重要的现实意义。从衰老的机制来看，皮肤的衰老通常是由于真皮层内成纤维细胞功能的降低，进而导致皮肤内胶原蛋和弹力蛋白等含量降低，最终引起真皮层厚度的降低，引起皮肤皱纹的产生。为解决这一问题，通过基于皮肤营养物质，特别是蛋白，是一种不错的选择。如通过对皮肤进行重组III型人胶原蛋白，可以使皮肤具有更好的年轻化效果【中华医学美学美容杂志，2022，28（4），300‑303】。通过滚针的方式将胶原蛋白导入皮肤内部，也可以明显的改善面部光老化的情况【滚轮微针联合胶原蛋白敷料改善面部光老化的疗效观察，硕士论文，许靖，成都中医药大学】。但上述方法都是通过仪器方式，直接将功效物注射进入皮肤内部。这种方法虽然有效，但存在着操作方式复杂，费用高等问题。因此如何通过低成本的方式实现蛋白的经皮吸收，对于实现基于蛋白的抗衰具有重要的意义。

[0003] 由于蛋白的分子量较高，很难实现直接经皮吸收。目前通常采用的方式是通过物理或者化学手段降低角质层的的紧密结构，从而促进功效物的吸收。如：在驻极体存在下，基于N‑三甲基壳聚糖的纳米颗粒可以显著促进蛋白的经皮吸收【Tu Y, Wang X, et al. Promotion of the transdermal delivery of protein drugs by N‑trimethyl chitosan nanoparticles combined with polypropylene electret, Int J Nanomedicine, 2016, 11, 5549‑5561.】。使用合成的多肽作为促渗剂，促进蛋白的经皮吸收，如：陈等报道，合成的多肽可以增加胰岛素和生长激素的透皮吸收【Chen et al. Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display. Nat Biotechnol. 2006;24(4):455–460.】。但上述方法仍存在合成费事，成本高等缺点，难以实现大规模的市场应用。

[0004] 目前使用的促渗技术一般分为如下：物理方法，一般利用仪器直接将功效物透过导入皮肤内部，长期使用后会造成皮肤的损伤，引起皮肤炎症、敏感等；药学促渗技术，虽然在很大程度上解决了上面的问题，但是仍存在着对于功效物负载率低，使用局限性强（所负载药物以脂溶性物质为主）。基于多肽类促渗剂，虽然能够促进蛋白类物质的经皮吸收，但是合成费时，成本高，难以实现规模化应用；其他基于甲壳素的化妆品原料，如三甲基甲壳素可以促进蛋白吸收，但却依靠外加电压实现；多数甲壳素原料并未展示出具有促渗效果，多数是作为一种添加剂使用。

发明内容

[0005] 为了解决现有技术中存在的上述技术问题之一，本申请人以合成脱乙酰壳多糖衍生物为基础，利用该衍生物的高电荷性，与蛋白，如：胶原蛋白，重组III型胶原，纤连蛋白等进行结合，制备复合物，形成了纳米化蛋白。再利用脱乙酰壳多糖纳米颗粒表面的功能化修饰，降低角质层紧密结构导致的阻力，从而促进蛋白的经皮吸收，进而发挥蛋白类功效物质的抗衰效果。为此，提出本申请。

[0006] 第一方面，本发明提供了一种蛋白组合物，该蛋白组合物包括脱乙酰壳多糖衍生物和蛋白，所述脱乙酰壳多糖衍生物包括：(1)脱乙酰壳多糖主链；(2)与所述主链通过醚键连接的基团A；以及(3)与所述主链通过酰胺键连接的基团B，其中，所述基团A具有一个或多个羟乙基，所述基团B具有一个或多个酰基和一个或多个氨基。

[0007] 根据本发明的实施方式，所述脱乙酰壳多糖衍生物和蛋白分子的重量比为1：0.01‑10，优选地，所述脱乙酰壳多糖衍生物和所述蛋白形成纳米颗粒。

[0008] 本发明中，所述蛋白可以是在护肤品中可以添加的任何蛋白分子。根据本发明的实施方式，所述蛋白选自胶原蛋白、纤连蛋白、重组Ⅲ型人源化胶原蛋白中的一种或多种。

[0009] 根据本发明的实施方式，所述脱乙酰壳多糖衍生物具有如下结构单元1、2和3中的一种或多种：

[0010] ，

[0011] 其中，结构单元1、2、3中，A表示所述基团A，B表示所述基团B。

[0012] 在一些实施方式中，所述脱乙酰壳多糖衍生物具有所述结构单元1和2。在一些实施方式中，所述脱乙酰壳多糖衍生物具有所述结构单元3。在一些实施方式中，所述脱乙酰壳多糖衍生物具有所述结构单元1、2和3。

[0013] 根据本发明的实施方式，所述基团A是聚乙二醇基团。聚乙二醇基团的平均分子量可以为164‑5000Da。在一些实施例中，聚乙二醇基团的平均分子量可以为200Da、500Da、1000Da、1500Da、2000Da、2500Da、3000Da、3500Da、4000Da、4500Da、5000Da或其中任意二个数值之间的范围。

[0014] 根据本发明的实施方式，所述基团A具有如下结构：

[0015] ，

[0016] m≥1。

[0017] 根据本发明的实施方式，m的取值范围是1‑100，例如1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90或其中任意两个数值之间的范围。

[0018] 根据本发明的实施方式，所述基团B是氨基酸或多肽分子去掉一个羟基形成的基团。优选地，所述氨基酸选自选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种或多种。优选地，所述多肽选自二肽、三肽、四肽、五肽、六肽中的一种或多种。

[0019] 根据本发明的实施方式，所述基团B具有如下结构： ，

[0020] 其中羰基C=O与脱乙酰壳多糖主链连接。根据本发明的实施方式，所述基团B具有如下结构：

[0021] 。

[0022] 根据本发明的实施方式，所述脱乙酰壳多糖衍生物的平均分子量为500‑18000Da，优选537‑18000Da。在一些实施例中，所述脱乙酰壳多糖衍生物的平均分子量可以为550Da、600Da、650Da、800Da、900Da、1000Da、1200Da、1500Da、2000Da、2500Da、3000Da、3500Da、
4000Da、4500Da、5000Da、6000Da、8000Da、9000Da、10000Da或其中任意二个数值之间的范围。

[0023] 根据本发明的实施方式，所述的脱乙酰壳多糖衍生物的制备方法包括如下步骤：

[0024] （a）将脱乙酰壳多糖与含基团A的化合物反应，得到接枝有基团A的脱乙酰壳多糖；

[0025] （b）将所述接枝基团A的脱乙酰壳多糖与含基团B的化合物进行缩合反应，得到所述脱乙酰壳多糖衍生物。

[0026] 在本发明的一些实施方式中，含基团A的化合物为甲氧基聚乙二醇环氧乙烷。优选地，所述甲氧基聚乙二醇环氧乙烷的平均分子量为176‑5000Da，例如200Da、300Da、550Da、600Da、650Da、800Da、900Da、1000Da、1200Da、1500Da、2000Da、2500Da、3000Da、3500Da、
4000Da、4500Da、5000Da或其中任意二个数值之间的范围。在一些实施例中，所述甲氧基聚乙二醇环氧乙烷的平均分子量为1000‑2500Da。在一些实施例中，所述甲氧基聚乙二醇环氧乙烷的平均分子量为1500‑2000Da。

[0027] 在本发明的一些实施方式中，含基团B的化合物为氨基酸或多肽，优选地，所述氨基酸选自所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种或多种。优选地，所述多肽选自二肽、三肽、四肽、五肽或六肽中的一种或多种。

[0028] 在本发明的一些实施方式中，含基团B的化合物为精氨酸或组氨酸。在一些实施例中，含基团B的化合物为精氨酸。

[0029] 在本发明的一些实施方式中，步骤（a）中，所述反应的温度为至0‑95℃，优选为20‑35℃，例如25℃ ，反应时间可以为0.5‑24小时，例如2小时、3小时、5小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时等。

[0030] 在本发明的一些实施方式中，步骤（a）中，所述脱乙酰壳多糖与甲氧基聚乙二醇环氧乙烷的摩尔比为1:0.1‑1。

[0031] 在本发明的一些实施方式中，步骤（b）中，采用EDC和NHS作为缩合试剂。

[0032] 优选地，所述含基团B的化合物与所述EDC的摩尔比为1：1‑1.5。

[0033] 优选地，所述含基团B的化合物与所述NHS的摩尔比为1：1‑1.5。

[0034] 在本发明的一些实施方式中，步骤（b）中，所述缩合反应的温度为0‑4℃，反应时间可以为0.5‑24小时，例如2小时、3小时、5小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时等。

[0035] 在本发明的一些实施方式中，步骤（a）中，所述脱乙酰壳多糖的平均分子量为537‑18000Da在一些实施例中，所述脱乙酰壳多糖的平均分子量可以为550Da、600Da、650Da、
800Da、900Da、1000Da、1200Da、1500Da、2000Da、2500Da、3000Da、3500Da、4000Da、4500Da、
5000Da、6000Da、8000Da、9000Da、10000Da或其中任意二个数值之间的范围，例如1000‑
10000Da，1000‑5000Da，或1000‑3000Da。

[0036] 在本发明的一些实施方式中，步骤（a）中使用的脱乙酰壳多糖通过包括如下步骤的制备方法获得：a1、将甲壳素水解，得到脱乙酰化产物；a2、将所述脱乙酰化产物进行氧化降解，得到所述脱乙酰壳多糖。

[0037] 在本发明的一些实施方式中，步骤a1中，水解条件包括将甲壳素溶解于酸性溶液，然后加碱例如（氢氧化钠溶液）调节到碱性（例如pH至8‑10）。酸性溶液可以是盐酸或醋酸溶液，pH优选在0‑4之间。

[0038] 在本发明的一些实施方式中，步骤a1中，所述甲壳素与酸性溶液的固液比为1:5‑100。

[0039] 在本发明的一些实施方式中，所述脱乙酰壳多糖的制备包括：将甲壳素溶于酸性溶液（盐酸、醋酸）中，溶液pH在0‑4之间，所述甲克素与酸性溶液的固液比为1:5‑100；上述甲壳素的酸性溶液中加入氢氧化钠溶液（20‑60%），调节pH至8‑10，得沉淀1；将所得沉淀1，通过压滤、水洗等步骤获得沉淀2；将所得白色沉淀2加入反应釜中，加入氢氧化钠溶液，调节pH至8‑9；再加入过氧化氢溶液；调节温度至0‑95℃，反应0.5‑24小时，得悬浮液；将悬浮液通过离心，水洗，离心等步骤得沉淀3。

[0040] 在本发明的一些实施方式中，所述脱乙酰壳多糖衍生物的制备包括：将脱乙酰壳多糖溶于水中，调节pH8‑10；向其中加入甲氧基聚乙二醇环氧乙烷，调节反应温度至0‑95℃，反应0.5‑24小时，得透明液体；使用酸性溶液调节透明液体的pH至2‑4后，透析后（MW‑3000Da），经冷冻干燥后得产物1；所述脱乙酰壳多糖与甲氧基聚乙二醇环氧乙烷的摩尔比为1:0.1‑1；

[0041] 将氨基酸或者多肽溶于pH为2‑6的PBS溶液（0.05M‑1M）中，向其中加入EDC，NHS，0‑4℃活化0.1‑4h，再向其中加入产物1，控制温度反应0‑24h；反应完成透析后（MW‑3000Da），经冷冻干燥后得产物2；其中氨基或者多肽与EDC和NHS的摩尔比为1:1 1.5。
~

[0042] 本发明的实施方式中，脱乙酰壳多糖衍生物通过在壳多糖表面修饰羟乙基，从而增加其与皮肤角质层中脂质的相容性；通过在氨基上修饰氨基酸（如：精氨酸、组氨酸）增加其正电荷量，从而提高其电荷含量。

[0043] 在第二方面，本发明提供了如上所述的蛋白组合物的制备方法，其包括如下步骤：将脱乙酰壳多糖衍生物溶于溶剂，得到溶液A；将蛋白溶于溶剂得到溶液B；将溶液A和溶液B进行混合。

[0044] 根据本发明的实施方式，所述溶剂为水。

[0045] 根据本发明的实施方式，所述溶液A中脱乙酰壳多糖衍生物的质量浓度0.001%‑50%，例如0.001%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2%、5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、
35%、40%或45%。

[0046] 根据本发明的实施方式，所述溶液B中蛋白的质量浓度为0.001%‑50%，0.001%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2%、5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%或45%。

[0047] 根据本发明的实施方式，所述混合的条件包括：搅拌速度为10‑2000 rpm，搅拌时间为0.1‑48h。

[0048] 在第三方面，本发明还提供了一种护肤品，包括本发明第一方面所述的蛋白组合物。所述护肤品可以是水、乳、霜等。

[0049] 本发明提供的蛋白组合物可以有效地促进蛋白的透皮吸收，在护肤品领域具有广阔的应用前景。

附图说明

[0050] 图1是实施例1制备的脱乙酰壳多糖衍生物的氢谱。

[0051] 图2是实施例1制备的羟乙基脱乙酰壳多糖的氢谱。

[0052] 图3是实施例1制备的脱乙酰壳多糖CS、羟乙基脱乙酰壳多糖QYJ‑CS、脱乙酰壳多糖衍生物JAS‑CS的红外谱图。

[0053] 图4是应用例1样品动物皮肤试验的荧光成像图。

[0054] 图5是图4荧光成像结果的统计图。

[0055] 图6是应用例2样品动物皮肤试验的荧光成像图。

[0056] 图7是图6的荧光成像结果的统计图。

具体实施方式

[0057] 为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。

[0058] 胶原蛋白是一类蛋白质家族，已至少发现了30余种胶原蛋白链的编码基因，可以形成16种以上的胶原蛋白分子，根据其结构，可以分为纤维胶原，基膜胶原、微纤维胶原、锚定胶原、六边网状胶原、非纤维胶原、跨膜胶原等。根据它们在体内的分布和功能特点，可以将胶原分成间质胶原、基底膜胶原和细胞外周胶原。间质型胶原蛋白分子占整个机体胶原的绝大部分，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白分子，Ⅰ型胶原蛋白主要分布于皮肤、肌腱等组织，也是水产品加工废弃物(皮、骨和鳞)含量最多的蛋白质，占全部胶原蛋白含量的80% 90%左~右，在医学上的应用最为广泛。Ⅰ型胶原在鱼类胶原中一个最显著的的特点是热稳定性比较低，并呈现有鱼种的特异性。Ⅱ型胶原蛋白由软骨细胞产生;基底膜胶原蛋白通常是指Ⅳ型胶原蛋白，其主要分布于基底膜;细胞外周胶原蛋白通常中指Ⅴ型胶原蛋白，在结缔组织中大量存在。按功能，可将胶原分为两组，第一组是成纤维胶原，包括第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅺ、ⅩⅩⅣ和ⅩⅩⅦ型胶原;其余是第二组，非成纤维胶原。非成纤维胶原的α‑链既含有三螺旋域(胶原域，COL)，还含有非三螺旋域(非胶原域，NC)，其中成纤维胶原约占胶原总数的90%。

[0059] 重组人源化胶原蛋白，由DNA重组技术制备的人胶原蛋白特定型别基因编码的全长或部分氨基酸序列片段，或是含人胶原蛋白功能片段的组合。重组Ⅲ型人源化胶原蛋白是通过生物工程技术将人体胶原蛋白的mRNA逆转录成cDNA，使用生物细胞的总 mRNA 为模板，用反转录酶合成互补的双链 cDNA，然后嫁接接到载体上，转入到宿主后建立的基因文库就是 cDNA。

[0060] 纤连蛋白是高分子量糖蛋白，含糖4.5%－9.5%，其亚单位相对分子质量为22万－25万。各亚单位在C端形成二硫键交联。纤连蛋白在再生修复肌肤表皮层、真皮层及皮下组织，抑制肌肤细菌，提高肌肤光泽度，改善肌肤粗糙度、提高角质层含水量等方面有明显的作用。

[0061] 实施例1脱乙酰壳多糖衍生物的合成：步骤一、取10克甲壳素溶于400ml 10% 盐酸溶液中，调节pH为3，搅拌溶解后；加入50%NaOH水溶液，调节pH至8.5，得白色沉淀。将白色沉淀洗涤，压滤后，倒入三口烧瓶中，再加入过氧化氢 30g和170mL水，调节温度至80℃，反应6小时，得乳白色液体，通过离心，水洗等步骤后得白色沉淀脱乙酰壳多糖（CS）。

[0062] 步骤二、将白色沉淀溶于100mL中，调节pH为9，然后加入0.1g甲氧基PEG 环氧乙烷，调节反应温度至60℃，反应6小时，然后使用10% HCl溶液调节pH=4，经透析（MW=3000Da），冷冻干燥后得产物羟乙基壳多糖QYJ‑CS 8.5g。

[0063] 步骤三、将精氨酸0.712g溶于pH=4.0 (0.1M)的缓冲溶液中，冰水浴(0℃)下，加入EDC 0.88g， NHS 0.46g，冰浴下保持2h。再加入上步冷冻干燥物羟乙基壳多糖4g，室温下反应12h，经透析（MW=3000Da），冷冻干燥后得最终产物脱乙酰壳多糖衍生物（精氨酸羟乙基壳多糖，简称JAS‑CS）。

[0064] 图1是步骤三的JAS‑CS的1HNMR谱图，图2是步骤二的QYJ‑CS的1HNMR谱图，图3示出了步骤一的脱乙酰壳多糖（CS）、以及步骤二的QYJ‑CS和步骤三的JAS‑CS红外谱图。

[0065] 通过动态光散射检测发现，本实施例中制备的脱乙酰壳多糖衍生物，其中纳米颗粒粒径为390±20nm，Zeta电势为43mV。

[0066] 实施例2：取5g实施例1制备的脱乙酰壳多糖溶于100mL 水中，作为溶液A；取5g胶原蛋白溶于100mL水中，作为溶液B；室温下，在200rpm搅拌下，将溶液B加入溶液A中，制备脱乙酰壳多糖/蛋白复合物；所得复合物经过高温灭菌后，可直接作为功效物用于护肤品中。

[0067] 实施例3：取1g脱乙酰壳多糖溶于100mL 水中，作为溶液A；取1g重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶于100mL水中，作为溶液B；室温下，在200rpm搅拌下，将溶液B加入溶液A中，制备脱乙酰壳多糖/蛋白复合物；所得复合物经过高温灭菌后，可直接作为功效物用于护肤品中。

[0068] 实施例4：取0.1g脱乙酰壳多糖溶于100mL 水中，作为溶液A；取0.05g纤连蛋白溶于100mL水中，作为溶液B；室温下，在200rpm搅拌下，将溶液B加入溶液A中，制备脱乙酰壳多糖/胶原蛋白复合物；所得复合物经过高温灭菌后，可直接作为功效物用于护肤品中。

[0069] 实施例5：取1g脱乙酰壳多糖衍生物溶于100mL 水中，作为溶液A；取1g重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶于100mL水中，作为溶液B；室温下，在200rpm搅拌下，将溶液B加入溶液A中，制备脱乙酰壳多糖/蛋白复合物；所得复合物经过高温灭菌后，可直接作为功效物用于护肤品中。

[0070] 通过动态光散射检测发现，本实施例中制备的脱乙酰壳多糖/蛋白复合物中，脱乙酰壳多糖衍生物和纤连蛋白形成的纳米颗粒大小和Zeta电 势见表1。实施例6：1．将透明质酸钠0.1g，甘油50g，Sepimax Zen 0.5g，卡波姆 0.5g，霍霍巴蜡 PEG‑120 酯类 4g，PEG‑20 甲基葡糖倍半硬脂酸酯 4g，对羟基苯乙酮 2g，去离子水
923.9g ，加热至85℃，混合均质后，制得混合物；

[0071] 2．温度降至45℃后，向上述溶液中加入实施例2、3、4或5制备的脱乙酰壳多糖/蛋白复合物，搅拌使其充分溶解；

[0072] 3．再向上述溶液中加入1.2‑戊二醇 10g，充分搅拌，得精华液a，降至室温，出料、静置。

[0073] 应用例1：1、测试样品制备

[0074] 配制含1% CSNPs（实施例1制备的脱乙酰壳多糖衍生物）的5mL水溶液A。

[0075] 取1g 重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶于 pH5.5 （0.1M PBS）中，室温下，向其中加入0.05g荧光素，反应12小时后，使用透析方法（MW=300Da）除掉未反应的荧光素；得荧光素标记的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白。经冷冻干燥后，得成品荧光素标记的III型类人源蛋白。

[0076] 取0.1g制备的荧光素标记的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白蛋白溶于5mL水溶液中，得荧光素标记的III型类人源胶原蛋白产品B。

[0077] 取0.1g制备的荧光素标记的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶于含有1% CSNPs（实施例1制备的脱乙酰壳多糖衍生物）的5mL水溶液中，得荧光素标记的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白产品C。

[0078] 取0.1g制备的荧光素标记的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶于含有1%CMCS（羧甲基壳多糖）的5mL水溶液中，得荧光素标记的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白产品D。

[0079] 取0.1g制备的荧光素标记的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶于含有1%HPCS（羟丙基壳多糖）的5mL水溶液中，得荧光素标记的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白产品E。

[0080] 2、透皮实验：将60只C57BL/6小鼠随机分为六组，每组10只，即对照组，A，B，C，D，E每只小鼠用电动剃须刀去掉2块5*5cm的毛，露出皮肤，然后在上述脱毛的2块皮肤上分别涂抹0.5mL制备的空白溶液（超纯水，对照），A，B，C，D，E。经八小时后，麻醉处死小鼠后，取涂抹空白溶液（超纯水，对照），A，B，C，D，E的皮肤，常规制备石蜡切片，进行荧光成像，如图4所示。

[0081] 3、荧光定量统计方法：采用SPSS13.0统计软件对数据进行分析。冷冻切片直接免疫荧光染色方法的判读结果比较采用x2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。结果如图5所示。需要说明的是，图5中，CSNPs表示A中的脱乙酰壳多糖衍生物的吸收量；III Collagen表示B中的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的吸收量；III Collagen@CSNPs 表示C中的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的吸收量; III Collagen@CMCS表示D中的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的吸收量; III Collagen@HPCS表示E中的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的吸收量。

[0082] 4、结果

[0083] 从图5可以得出，与重组Ⅲ型人源化胶原蛋白相比，本发明的脱乙酰壳多糖衍生物可以显著地促进重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的经皮吸收，两小时时是单体的1.5倍；四小时后吸收量是单体的4倍。同样，与羧甲基壳多糖和羟丙基壳多糖相比，其吸收量也有4倍以上的增加。

[0084] 应用例2：1、样品制备：配制含1% CSNPs（实施例1制备的脱乙酰壳多糖衍生物）的5mL水溶液A(CS)。

[0085] 取1g 纤连蛋白溶于 pH5.5 （0.1M PBS）中，室温下，向其中加入0.05g荧光素，反应12小时后，使用透析方法（MW=300Da）除掉未反应的荧光素；得荧光素标记的纤连蛋白。经冷冻干燥后，得成品荧光素标记的纤连蛋白。

[0086] 取0.1g制备的荧光素标记的纤连蛋白溶于5mL水溶液中，得荧光素标记的纤连蛋白B(FN)。

[0087] 取0.1g制备的荧光素标记的纤连蛋白溶于含有1% CSNPs（实施例1制备的脱乙酰壳多糖衍生物）的5mL水溶液中，得荧光素标记的纤连蛋白产品C(CS@FN)。

[0088] 2、透皮实验：将40只C57BL/6小鼠随机分为四组，每组10只，即对照，A，B，C每只小鼠用电动剃须刀去掉2块5*5cm的毛，露出皮肤，然后在上述脱毛的2块皮肤上分别涂抹0.5mL制备的A，B，C。经八小时后，麻醉处死小鼠后，取A，B，C的皮肤，常规制备石蜡切片，进行荧光成像，如图6所示。

[0089] 3、荧光定量统计方法：采用SPSS13.0统计软件对数据进行分析。冷冻切片直接免疫荧光染色方法的判读结果比较采用x2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。结果如图7所示。需要说明的是，图7中CS@FN代表的是纤连蛋白的吸收量。

[0090] 4、结果：从图6和7可以得出，与纤连蛋白相比，本发明的脱乙酰壳多糖衍生物可以显著地促进纤连蛋白的经皮吸收。本发明的脱乙酰壳多糖/蛋白复合物具有较高的经皮吸收率。

[0091] 本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。