抗菌八肽及其应用

摘要

本发明公开了四种抗菌八肽及其应用。这四种抗菌八肽的氨基酸序列分别为：I‑R‑I‑L‑K‑W‑L‑L‑NH2；I‑R‑L‑F‑K‑W‑L‑F‑NH2；I‑L‑R‑W‑L‑W‑K‑W‑NH2；I‑R‑W‑L‑K‑L‑L‑L‑NH2。这四种抗菌八肽具有强力、广谱的杀菌性能，且实际成本低，可用于制备需要添加到生活用品中使用的抑菌添加剂以及治疗和/或预防细菌感染的药物。

权利要求

1.抗菌八肽，其特征在于，所述抗菌八肽的氨基酸序列为下述之一：抗菌肽1：I‑R‑I‑L‑K‑W‑L‑L‑NH2，抗菌肽2：I‑R‑L‑F‑K‑W‑L‑F‑NH2，抗菌肽3：I‑L‑R‑W‑L‑W‑K‑W‑NH2，抗菌肽4：I‑R‑W‑L‑K‑L‑L‑L‑NH2。

2.根据权利要求1所述的抗菌八肽在制备治疗和/或预防金黄色葡萄球菌感染的药物中的应用。

3.一种适用于治疗和/或预防金黄色葡萄球菌感染的药物，其特征在于，所述药物含有权利要求1所述的抗菌八肽中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体。

5.一种抑菌添加剂，其特征在于，所述抑菌添加剂包括权利要求1所述的抗菌八肽中的至少一种，所述抑菌添加剂作为一种添加剂添加到生活用品中使用。

说明书

抗菌八肽及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及四种抗菌八肽及其应用。

背景技术

[0002] 抗生素的滥用以及误用正在导致极为严重的细菌耐药性问题。据世界卫生组织(WHO)报道，当前耐药细菌每年造成70万人死亡，并预测，这一数字将在2050年达到惊人的1000万。因此，开发新型抗菌药物刻不容缓。

[0003] 抗菌肽因其序列多样性和广谱的生物活性而受到广泛关注，并已在癌症、真菌、细菌感染等治疗中发挥重要作用。

[0004] 抗菌肽一般携带正电荷，并且具有α‑螺旋或者β‑折叠结构等二级结构。这两项特征可以帮助抗菌肽于带负电的细菌细胞膜表面富集，并侵入破坏细胞膜磷脂双分子层，从而杀死细菌。并且，抗菌肽的破膜杀菌已被广泛认为是一种不易产生细菌耐药性的杀菌机制。因此，抗菌肽被认为是下一代抗生素的理想备选药物。

[0005] 目前，抗菌肽大多包含10‑60个或以上氨基酸残基。例如：

[0006] 公开号为CN 112321698 A的专利说明书公开了三种以天然抗菌肽PGLa‑AM1为基础进行改造而成的超过25个氨基酸的抗菌肽，对幽门螺杆菌的抑制效果均强于PGLa‑AM1。

[0007] 公开号为CN 111925430 A的专利说明书公开了两种超过20个氨基酸的抗菌肽，基于来源于非洲爪蛙上皮的抗菌肽magainin的家族类似物Pexiganan通过理性分子设计方法设计得到。

[0008] 然而，抗菌肽的序列过长不仅易产生较大的生物毒性，也增加了生产成本，极大限制抗菌肽的应用。但是，抗菌肽序列长度过短可能会导致抗菌肽的抗菌活性降低。

发明内容

[0009] 针对上述技术问题以及本领域存在的不足之处，本发明提供了四种抗菌八肽，具有强力、广谱的杀菌性能，且实际成本低。

[0010] 具体技术方案如下：

[0011] 四种抗菌八肽的氨基酸序列分别为下述之一：

[0012] 抗菌肽1：I‑R‑I‑L‑K‑W‑L‑L‑NH2(SEQ ID NO：1)，

[0013] 抗菌肽2：I‑R‑L‑F‑K‑W‑L‑F‑NH2(SEQ ID NO：2)，

[0014] 抗菌肽3：I‑L‑R‑W‑L‑W‑K‑W‑NH2(SEQ ID NO：3)，

[0015] 抗菌肽4：I‑R‑W‑L‑K‑L‑L‑L‑NH2(SEQ ID NO：4)。

[0016] 上述四种抗菌八肽因其独特的氨基酸序列，可表现出显著的杀菌活性，并且在高浓度下表现出较低的细胞毒性以及溶血性，能够应用于治疗因细菌引起的肺炎、败血症等疾病的药物中。

[0017] 本发明还提供了上述四种抗菌八肽在制备治疗和/或预防细菌感染的药物中的应用。

[0018] 本发明还提供了一种适用于治疗和/或预防细菌感染的药物，所述药物含有上述四种抗菌八肽中的至少一种。

[0019] 本发明提供的四种抗菌八肽具有对细菌的抗/杀菌普适性，其主要作用机理为破坏细菌细胞膜。这四种抗菌八肽的净电荷为正，可以吸附到表面带负电的细菌细胞膜。而当吸附在细胞膜表面的这四种抗菌八肽达到一定浓度时，两亲性的多肽就会插入细胞膜的磷脂层并在其中自组装产生孔洞破坏细菌细胞膜，从而杀死细菌。因此本发明四种抗菌八肽具有抗菌广谱性，对多种细菌均具有杀灭作用。

[0020] 所述细菌可为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌，具体可为金黄色葡萄球菌和/或大肠杆菌等。

[0021] 本发明的四种抗菌八肽对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为8μg/mL。

[0022] 所述适用于治疗和/或预防细菌感染的药物还可包括药学上可接受的载体。

[0023] 作为一个总的发明构思，本发明还提供了一种抑菌添加剂，所述抑菌添加剂包括上述四种抗菌八肽中的至少一种，所述抑菌添加剂可作为一种添加剂添加到生活用品中使用。

[0024] 与现有技术相比，本发明具有如下显著的技术效果：

[0025] 1)本发明通过大量研究，发现了上述四种特定序列的抗菌八肽具有强效、广谱的抗/杀菌活性，能够应用于生活用品所需的抑菌添加剂以及治疗或者预防因细菌引起的疾病的药物中。

[0026] 2)本发明的抗菌八肽可人工合成(可采用现有常规技术，如采用固相法合成等)，操作方便，肽链短，不论是制备成本还是原料成本、应用成本，都非常低，具有非常好的应用前景。

附图说明

[0027] 图1为抗菌肽1的HPLC(a)与质谱(b)结果图；

[0028] 图2为抗菌肽2的HPLC(a)与质谱(b)结果图；

[0029] 图3为抗菌肽3的HPLC(a)与质谱(b)结果图；

[0030] 图4为抗菌肽4的HPLC(a)与质谱(b)结果图。

具体实施方式

[0031] 下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

[0032] 下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0033] 实施例1

[0034] 抗菌肽1‑4的固相合成：

[0035] 一、树脂溶胀

[0036] 称取取代度为0.4mmol/g的0.6g 2‑Chlorotrityl Chloride Resin树脂，将树脂放入反应管中，加二氯甲烷(DCM)(15mL/g)，振荡30分钟。

[0037] 二、接第一个氨基酸

[0038] 通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc‑L‑Leu‑OH氨基酸，再加入10倍摩尔过量的二异丙基乙胺(DIEA)，最后加入少量二甲基甲酰胺(DMF)溶解，振荡1小时。用DMF和DCM交替清洗6遍。

[0039] 三、脱保护

[0040] 加15mL 20％哌啶DMF溶液(15mL/g)，5分钟，去掉再加15mL 20％哌啶DMF溶液(15mL/g)，15分钟。

[0041] 四、检测

[0042] 抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5分钟，变深蓝色为阳性反应。

[0043] 五、洗

[0044] DMF(10mL/g)两次，甲醇(10mL/g)两次，DMF(10mL/g)两次。

[0045] 六、缩合

[0046] 保护氨基酸(Fmoc‑L‑Gly‑OH)三倍过量，O‑苯并三氮唑‑四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入N‑甲基吗啡啉(NMM)十倍过量。反应30分钟。

[0047] 七、洗

[0048] DMF(10mL/g)一次，甲醇(10mL/g)两次，DMF(10mL/g)两次。

[0049] 八、重复二至六步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸。

[0050] 九、最后一个氨基酸连接后，脱保护，按照下列方法洗树脂。

[0051] DMF(10mL/g)两次，甲醇(10mL/g)两次，DMF(10mL/g)两次，DCM(10mL/g)两次，抽干10分钟。

[0052] 十、从树脂上切割多肽

[0053] 配制切割液(10/g)TFA94.5％；水2.5％；EDT 2.5％；TIS 1％。

[0054] 将树脂装入烧瓶或者离心管中，树脂和切割液比例按照10mL/g，恒温震荡，时间：120分钟。

[0055] 十一、吹干洗涤

[0056] 将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚层析出来，再用乙醚洗六次，然后常温挥干。即得粗品肽序。

[0057] 十二、用HPLC纯化多肽

[0058] 具体操作步骤：

[0059] 1，取粗品肽200mg放入器皿中。用2‑5mL 50％的乙腈水溶液溶清。可以稍微超声2分钟。

[0060] 2，用0.45μm滤膜过滤溶解液。

[0061] 3，分析：取3μL用分析级HPLC分析粗品。流动相是水和乙腈，时间30分钟，梯度洗脱，先将HPLC用起始梯度平衡5分钟然后进样，起始梯度水95％，乙腈5％,结束比例水5％，乙腈95％

[0062] 4，制备：将溶解好的样品，做进样准备。制备HPLC平衡10分钟，起始梯度水95％，乙腈5％，结束梯度水25％，乙腈75％梯度时间40分钟。收集从检测器出来的样品。

[0063] 5，鉴定：将收集下来的样品，取样进行纯度和MS的鉴定。

[0064] 十三、最后将纯化后的溶液冻干，既得到成品。

[0065] 十四、将白色粉末状的多肽，密封包装，‑20℃保存。

[0066] 图1‑4分别依次为抗菌肽1‑4的HPLC(a)与质谱(b)结果图。

[0067] 实施例2

[0068] 抗菌肽的抗菌活性检测。

[0069] 以下的所使用的标准菌株均购于广东省微生物菌种保存中心。

[0070] 采用96孔板法对实施例1合成的抗菌八肽的抗菌活性进行检测，以评价抗菌肽1‑4的抗菌活性。

[0071] 按以下步骤测试抗菌肽的抗菌活性。

[0072] 一、将金黄色葡萄球菌(S.aureus)在灭菌的TSA培养基平板上培养过夜，挑取单菌落接种于灭菌的TSB培养基中37℃，150rpm，18小时过夜培养。

[0073] 二、将抗菌肽1‑4分别用PBS配成1024μg/mL，并按照2倍连续稀释的方式用PBS稀释成1024，512，256，128，64，32，16，8，4μg/mL并吸取100μL加入96孔板的2‑9列孔位并重复6组加入B‑G行。将培养后的细菌用TSB稀释成5×10^5CFU/mL，并在B2‑D9孔中加入100μL稀释后的菌液作为实验组。此时，待测的肽的浓度(μg/mL)如下表1所示。

[0074] 表1

[0075]列数 2 3 4 5 6 7 8 9
浓度 512 256 128 64 32 16 8 4

[0076] 在E2‑G9孔中加入100μL TSB溶液作为对照组，并在B10‑D10孔中分别加入100μL PBS以及TSB作为阴性对照，在E10‑G10孔中分别加入100μL PBS以及稀释后的菌液作为阳性对照。将96孔板用封口膜封口后装入自封袋置于37℃，150rpm，18小时过夜培养。用酶标仪分别测B2‑D9孔的OD600值，最小的OD600值所对应的最小浓度便为该抗菌肽对应细菌的MIC值。

[0077] 表2示出了本发明的抗菌八肽1‑4的最低抑菌浓度(MIC，μg/mL)。

[0078] 表2

[0079]抗菌八肽 IRILKWLL‑NH2 IRLFKWLF‑NH2
S.aureus 8 8
抗菌八肽 ILRWLWKW‑NH2 IRWLKLLL‑NH2
S.aureus 8 8

[0080] 表2中的MIC越小，代表抑菌能力越强。表2显示本发明的四种抗菌肽对革兰氏阳性菌表现出良好的抑菌能力，具有强效性。

[0081] 此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。