一株弗氏柠檬酸杆菌及其在农药生产废水处理中的应用转让专利
申请号 : CN202211419067.X
文献号 : CN115786191B
文献日 : 2023-04-07
发明人 : 蔡天明 , 蔡舒 , 吴康莉 , 岑非非 , 孙佳佳 , 贝倩文 , 唐莲莲
申请人 : 江苏聚庚科技股份有限公司
摘要 :
本发明公开了一株弗氏柠檬酸杆菌及其在农药生产废水处理中的应用，弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）命名为GH‑2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年9月9日，保藏编号为CGMCC No.25671。本发明的弗氏柠檬酸杆菌能高效降解农药生产废水中的有机污染物，且菌株对盐浓度和温度的适应范围广，为农药废水中的中间体降解提供了高效的微生物种质资源，具有较好的应用前景。
权利要求 :
1.一株弗氏柠檬酸杆菌，其特征在于，所述弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）命名为GH‑2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年9月9日，保藏编号为CGMCC No. 25671。
2.一种权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌在低温高盐条件下降解农药生产废水中有机污染物的应用，其特征在于，所述有机污染物为烯丙菊酯、烯丙醇酮、5‑甲基糠醛或呋喃甲醇中的一种或多种，有机污染物的含量为0.1 1g/L；所述农药生产废水中的盐浓度为1~ ~
20g/L，温度为10 30℃。
~
3.一种利用权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌株制备的菌剂。
4.一种权利要求3所述的菌剂在低温高盐条件下降解农药生产废水中有机污染物的应用，其特征在于，所述有机污染物为烯丙菊酯、烯丙醇酮、5‑甲基糠醛或呋喃甲醇中的一种或多种，有机污染物的含量为0.1 1g/L；所述农药生产废水中的盐浓度为1 20g/L，温度为~ ~
10 30℃。
~
5.一种权利要求3所述的菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：S1、挑选弗氏柠檬酸杆菌GH‑2单菌落接种于LB液体培养基中，摇床振荡，培养至对数生长期，得到菌液；
S2、将菌液接种至种子罐，培养至对数生长期，得到种子液；
S3、将种子液接种至发酵罐中发酵培养，发酵结束后，得到菌剂。
6.根据权利要求5所述的菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，LB液体培养基的组分为：酵母浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，pH 7.0 7.5；培养条件为：温度30 35~ ~℃，时间12 24h。
~
7.根据权利要求5所述的菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S2和S3中，发酵罐培养基和种子罐培养基的组分相同，均为：葡萄糖8g/L、酵母浸粉5g/L、K2HPO4 1g/L、NaCl 5g/L、CaCO3 2g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、大豆油0.1％(v/v)，pH 7.0~7.5。
8.根据权利要求5所述的菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S2和S3中，种子罐和发酵罐的培养条件相同，在培养过程中无菌空气的通气量与发酵培养基的体积比为1:0.6~
1.2，搅拌速度为180 240 rpm，培养温度为30 35℃，全流程培养时间为48 96h。
~ ~ ~
9.根据权利要求5所述的菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，菌液的接种量按体积比为5% 10%；所述步骤S3中，种子液的接种量按体积比为1% 8％。
~ ~
10.根据权利要求5所述的菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，发酵结束后发8
酵液中菌体数量达到10个/mL以上。
说明书 :
一株弗氏柠檬酸杆菌及其在农药生产废水处理中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株弗氏柠檬酸杆菌及其在农药生产废水处理中的应用。
背景技术
[0002] 农药是精细化工的一个重要领域。至今，全球研发的农药品种已达几十万个，商品化的有600多个，相关中间体更是数以万计。由于农药生产工艺复杂、原材料利用率低以及合成中间产物多，在生产过程中会产生含有原药、生产主要原料和中间体的废水。农药生产废水相比于其他行业产生的工业污水，由于农药目标靶向于特定生物的生长抑制作用，其生产废水中含有大量有毒物质，具有较高的生物毒性，城镇污水处理厂传统的生化处理方式难以降解，如若处理不好，将对周边生态环境造成严重危害。同时，由于农药生产过程中‑存在缩合、洗脱等工艺流程，最后产生的废水具有较高的含盐量，其高盐成分多为CI 、
2‑ + 2+
SO4 、Na、Ca 等盐类物质。
2‑ + 2+
SO4 、Na、Ca 等盐类物质。
[0003] 烯丙醇酮是烯丙菊酯合成过程中所需要的重要中间体之一，主要是由5‑甲基糠醛和呋喃甲醇制备而成，在制备的过程中，会排放出含高浓度5‑甲基糠醛和呋喃甲醇的废水。传统纯物理工艺无法对有机物进行有效降解，仍需增加后处理，而化学方法由于工艺流程复杂，运维成本较高，并且物理和化学法大多只能针对一种污染物组成，对含有多种物质的实际废水处理效果不理想。因此，对农药生产废水采用经济合理、综合效果良好的技术工艺进行适当有效处理，是我国农药行业目前需要解决的问题。
[0004] 与传统处理方式相比，微生物降解法具有同时去除多种污染物、降低成本、减少二次污染等方面的优势；应对不同组成的废水有不同种类的微生物与之对应，或一种微生物可同时降解多种污染物。经微生物代谢处理后所得的终产物多为低毒和无毒的低碳产物，或为二氧化碳和水。鉴于此，本发明所要解决的技术问题就是找到一株能够实现其快速降解的高效微生物，通过微生物优势菌株强化对水体中污染物的去除。
发明内容
[0005] 为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一株弗氏柠檬酸杆菌GH‑2，可在低温高盐条件下高效降解农药生产废水中的有机污染物。
[0006] 为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
[0007] 一株弗氏柠檬酸杆菌，弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）命名为GH‑2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年9月9日，保藏编号为CGMCC No. 25671。
[0008] 一种弗氏柠檬酸杆菌在低温高盐条件下降解农药生产废水中有机污染物的应用，有机污染物为烯丙菊酯、烯丙醇酮、5‑甲基糠醛或呋喃甲醇中的一种或多种，有机污染物的含量为0.1 1g/L；农药生产废水中的盐浓度为1 20g/L，温度为10 30℃。~ ~ ~
[0009] 一种利用弗氏柠檬酸杆菌株制备的菌剂。
[0010] 一种菌剂在低温高盐条件下降解农药生产废水中有机污染物的应用，有机污染物为烯丙菊酯、烯丙醇酮、5‑甲基糠醛或呋喃甲醇中的一种或多种，有机污染物的含量为0.1~1g/L；农药生产废水中的盐浓度为1 20g/L，温度为10 30℃。
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[0011] 一种上述菌剂的制备方法，包括以下具体步骤：
[0012] S1、挑选弗氏柠檬酸杆菌GH‑2单菌落接种于LB液体培养基中，摇床振荡，培养至对数生长期，得到菌液；
[0013] S2、将菌液接种至种子罐，培养至对数生长期，得到种子液；
[0014] S3、将种子液接种至发酵罐中发酵培养，发酵结束后，得到菌剂。
[0015] 优选地，前述步骤S1中，LB液体培养基的组分为：酵母浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，pH 7.0 7.5；培养条件为：温度30 35℃，时间12 24h。~ ~ ~
[0016] 优选地，前述步骤S2和S3中，发酵罐培养基和种子罐培养基的组分相同，均为：葡萄糖8g/L、酵母浸粉5g/L、K2HPO4 1g/L、NaCl 5g/L、CaCO3 2g/L、MgSO4•7H2O 0.2g/L、大豆油0.1％(v/v)，pH 7.0 7.5。
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[0017] 优选地，前述步骤S2和S3中，种子罐和发酵罐的培养条件相同，在培养过程中无菌空气的通气量与发酵培养基的体积比为1:0.6 1.2，搅拌速度为180 240 rpm，培养温度为~ ~30 35℃，全流程培养时间为48 96h。
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[0018] 优选地，前述步骤S2中，菌液的接种量按体积比为5% 10%；步骤S3中，种子液的接~种量按体积比为1% 8％。
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[0019] 优选地，前述步骤S3中，发酵结束后发酵液中菌体数量达到108个/mL以上。
[0020] 本发明的有益之处在于：本发明提供了一株能降解农药生产废水中有机污染物的弗氏柠檬酸杆菌GH‑2，菌株GH‑2在24h对烯丙菊酯的降解率在88%以上，对烯丙醇酮、5‑甲基糠醛和呋喃甲醇的降解率均可达96%以上；农药生产废水的盐浓度在1 20g/L范围内，菌株~GH‑2对烯丙醇酮、5‑甲基糠醛和呋喃甲醇的降解率均在96%以上，在10 30℃的温度范围内，~
菌株GH‑2对烯丙醇酮、5‑甲基糠醛和呋喃甲醇的降解率均在93%以上，表明该菌株可以在低温高盐条件下高效降解农药生产废水中的有机污染物，对于生物强化处理农药生产废水和保护生态环境等方面具有重要的意义。
菌株GH‑2对烯丙醇酮、5‑甲基糠醛和呋喃甲醇的降解率均在93%以上，表明该菌株可以在低温高盐条件下高效降解农药生产废水中的有机污染物，对于生物强化处理农药生产废水和保护生态环境等方面具有重要的意义。
附图说明
[0021] 图1为弗氏柠檬酸杆菌GH‑2的菌落形态图；
[0022] 图2为弗氏柠檬酸杆菌GH‑2对农药生产废水中有机污染物的降解效果图；
[0023] 图3为盐浓度对弗氏柠檬酸杆菌GH‑2降解效果的影响；
[0024] 图4为温度对弗氏柠檬酸杆菌GH‑2降解效果的影响；
[0025] 图5为菌株GH‑2对不同浓度有机污染物的降解效果；
[0026] 图6为菌剂对实际农药生产废水中有机污染物的降解效果图。
具体实施方式
[0027] 以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
[0028] 实施例1
[0029] 菌株的分离/纯化与鉴定：
[0030] 取某农药生产企业污水处理厂生化池中的好氧活性污泥，静置后去上清，加入清水混匀后静置，去上清，重复上述步骤2次。取上述污泥20mL添加到烯丙菊酯和烯丙醇酮初始浓度为100mg/L，5‑甲基糠醛和呋喃甲醇初始浓度为500mg/L的无机盐培养基中，30℃，160rpm条件下驯化培养7天，培养7天后，以6%的接种量接入到新鲜无机盐培养基中继续培养7天，每次转接培养基中有机污染物浓度增加100mg/L，连续富集转接5次，使无机盐培养基中烯丙菊酯和烯丙醇酮浓度达到500mg/L，5‑甲基糠醛和呋喃甲醇浓度达到1000mg/L，获得富集液。
[0031] 将获得的富集液用无菌水稀释至不同浓度梯度（10‑3 10‑7），取稀释后的菌液，涂~布在LB固体培养基上，待菌落长出后挑取不同形态的单菌落进行划线分离纯化。将纯化后的菌株再次转接到无机盐液体培养基中，于30℃，160rpm振荡培养，验证不同菌株的降解效果，筛选得到能高效降解农药及其中间体的优势菌株。经分离纯化得到了一株能够同时高效降解农药及其中间体的菌株，命名为GH‑2。
[0032] 无机盐培养基组分为：NaCl 1.0g/L、(NH4)2SO4 1.0g/L、K2HPO4 1.5 g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4•7H2O 0.2g/L和水1L，pH 7.0，培养基121℃灭菌20min。
[0033] LB固体培养基组分为：酵母浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，pH 7.0，固体培养基中加入 2% 的琼脂，培养基121℃灭菌20min。
[0034] 菌株GH‑2的主要生理学特征为革兰氏染色阴性，菌体杆状，在LB固体培养基上菌落光滑、低凸、温润、半透明或不透明，表面有光泽，边缘整齐，菌落直径2 4mm，能够以农药~中间体为唯一碳源进行生长，菌落形态如图1所示。
[0035] 实施例2
[0036] 菌剂的制备：
[0037] 挑选菌株GH‑2的单菌落接种于LB液体培养基中，培养温度30℃，时间12h，振荡培养至对数期；将上述培养好的菌液按10％的接种量接种至种子罐，培养至对数生长期；将种子液按5％的接种量接入发酵罐培养，发酵罐所用培养基与种子罐培养基相同；在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1.0，搅拌速度为240 rpm，培养温度为35℃，全8
流程培养时间为96h，发酵结束后菌体数量达到10 个/mL以上，发酵完成后发酵液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型。
流程培养时间为96h，发酵结束后菌体数量达到10 个/mL以上，发酵完成后发酵液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型。
[0038] LB液体培养基组分为：酵母浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，pH 7.0。
[0039] 种子罐及发酵罐培养基组分为：葡萄糖8g/L、酵母浸粉5g/L、K2HPO4 1g/L、NaCl 5g/L、CaCO3 2g/L、MgSO4 0.2g/L、大豆油0.1％(v/v)，pH值7.0。
[0040] 实施例3
[0041] 菌株GH‑2对农药生产废水中有机污染物的降解效果：
[0042] 将弗氏柠檬酸杆菌GH‑2接种在LB培养基中培养到对数期，LB液体培养基的组分为：蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、氯化钠10g/L，收集培养液，于4℃、8000r/min 离心5 min弃上清液，收集菌体，菌体以无菌水清洗重悬，再次离心去上清，按上述步骤重复 3 次得到清洗好的菌体，将菌体细胞用无菌水等体积重悬得到种子液。
[0043] 将种子液以5%的接种量分别接种至含烯丙菊酯、烯丙醇酮、5‑甲基糠醛和呋喃甲醇的无机盐培养基中，无机盐培养基的组分为：(NH4)2SO4 0.5g/L、KH2PO4 1g/L、Na2HPO4 1g/L、MgCl2 0.02g/L、CaCl2 0.03g/L，pH 7.0，烯丙菊酯和烯丙醇酮的初始浓度均为500mg/L，5‑甲基糠醛和呋喃甲醇的初始浓度均为1000mg/L，于30℃、160rpm条件下摇床振荡培养，
24h后测定其浓度，结果如图2所示。
24h后测定其浓度，结果如图2所示。
[0044] 由图2可知，菌株GH‑2对烯丙菊酯、烯丙醇酮、5‑甲基糠醛和呋喃甲醇的降解率分别为88.2%、96.3%、96.8%、和97.5%，降解效果很好。
[0045] 实施例4
[0046] 盐浓度对菌株GH‑2降解效率的影响：
[0047] 将实施例3中获得的种子液，以5%的接种量接到含有烯丙醇酮、5‑甲基糠醛和呋喃甲醇的无机盐培养基中，无机盐培养基的组分为：(NH4)2SO4 0.5g/L、KH2PO4 1g/L、Na2HPO4 1g/L、MgCl2 0.02g/L、CaCl2 0.03g/L，pH 7.0，农药生产废水中有机污染物的初始浓度均为
0.5g/L。调节无机盐培养基中NaCl浓度分别为 1.0 g/L、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L，在
30℃、160rpm摇床中振荡培养，24h后测定其含量，结果如图3所示。
0.5g/L。调节无机盐培养基中NaCl浓度分别为 1.0 g/L、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L，在
30℃、160rpm摇床中振荡培养，24h后测定其含量，结果如图3所示。
[0048] 由图3可知，农药生产废水中的盐浓度在1 20g/L范围内，菌株GH‑2对烯丙醇酮、5‑~甲基糠醛和呋喃甲醇的降解率均在96%以上，表明该菌株对盐浓度适用范围较广，对废水盐浓度具有较高的耐受性。
[0049] 实施例5
[0050] 温度对菌株GH‑2降解效率的影响：
[0051] 将实施例3中获得的种子液，以5%的接种量接到含有烯丙醇酮、5‑甲基糠醛和呋喃甲醇的无机盐培养基中，无机盐培养基的组分为：(NH4)2SO4 0.5g/L、KH2PO4 1g/L、Na2HPO4 1g/L、MgCl2 0.02g/L、CaCl2 0.03g/L，pH 7.0，农药及中间体的初始浓度均为0.5g/L。分别置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃，160rpm摇床中振荡培养，24h后测定含量，结果如图4所示。
[0052] 由图4可知，在10 30℃的温度范围内，菌株GH‑2对烯丙醇酮、5‑甲基糠醛和呋喃甲~醇的降解率均在93%以上，表明改菌株对环境温度具有较好适应性，可应用于低温环境下对农药生产废水中有机污染物的降解。
[0053] 实施例6
[0054] 菌株GH‑2对不同浓度有机污染物的降解效果：
[0055] 将实施例3中获得的种子液，以5%的接种量接种至含不同浓度烯丙醇酮的无机盐培养基中，无机盐培养基的组分为：(NH4)2SO4 0.5g/L、KH2PO4 1g/L、Na2HPO4 1g/L、MgCl2 0.02g/L、CaCl2 0.03g/L，pH 7.0，烯丙醇酮的初始浓度分别为0.1g/L、0.3g/L、0.5g/L、
0.7g/L、1g/L，于30℃、160rpm条件下摇床振荡培养，24h后测定其浓度，结果如图5所示。
0.7g/L、1g/L，于30℃、160rpm条件下摇床振荡培养，24h后测定其浓度，结果如图5所示。
[0056] 由图5可知，菌株GH‑2对浓度为0.1 1g/L烯丙醇酮的降解率均在95%以上，表明该~菌株可有效降解农药生产废水中的有机污染物。
[0057] 实施例7
[0058] 菌剂在实际农药生产废水中的降解应用：
[0059] 所用废水来源于某农药企业生产废水，废水pH 7.6，全盐浓度12g/L，测得烯丙菊酯浓度为146mg/L，烯丙醇酮浓度为412mg/L，5‑甲基糠醛浓度为973mg/L，呋喃甲醇浓度为1028mg/L。取该企业污水处理厂生化池中的好氧活性污泥，静置后去上清，加入清水混匀后静置，去上清，重复操作3次，得到清洗好的污泥。设置对照组：取上述清洗好的污泥200mL添加到含1.5L废水的2L广口玻璃瓶中，混匀后放置曝气器；实验组在添加活性污泥的基础上再投加由菌株GH‑2制备的菌剂，投加量为10%，3天后测定各中间体的浓度，结果如图6所示。
[0060] 由图6可知，只添加活性污泥时，3天后烯丙菊酯、烯丙醇酮、5‑甲基糠醛和呋喃甲醇的降解率分别为9.5%、13%、15.2%和21.6%；投加菌株GH‑2强化后，废水中的烯丙菊酯、烯丙醇酮、5‑甲基糠醛和呋喃甲醇的降解率分别达到94.5%、96%、97.4%和98.1%。以上实验数据表明，菌株GH‑2在实际农药废水处理中具有良好的应用前景。
[0061] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。